谷氨酸螯合钙替代部分食盐对兔肉肌原纤维
蛋白热凝胶和乳化特性的影响

常辰曦1，邹玉峰1，曹锦轩2，徐幸莲1,*，周光宏1

（1.南京农业大学，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095；

2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211）

摘 要：为降低凝胶类低温肉制品中的钠离子含量，研究谷氨酸螯合钙替代部分食盐对兔肉肌原纤维蛋白加工特性的影响。从兔腰大肌中提取肌原纤维蛋白，添加质量分数为1.25%的谷氨酸螯合钙，再分别添加0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%的食盐（食盐组成为70%NaCl和30%KCl），研究肌原纤维蛋白流变特性、保水性、乳化活性和乳化稳定性以及乳化体系复合热凝胶的保油保水性变化，并以3%食盐组作为对照。结果表明：食盐添加量增多，肌原纤维蛋白热凝胶储能模量（G’）增大，1.2%食盐组G’值高于对照组（P＜0.05）；但是凝胶保水性先增强后减弱，1.2%食盐组保水效果最好。食盐添加量增多，乳化活性增大；而乳化稳定性以0.8%和1.2%食盐组最高，与对照组差异不显著（P＞0.05）。1.2%和1.6%食盐组的保油保水性显著高于对照组（P＜0.05）。结论：添加谷氨酸螯合钙可以使兔肉肌原纤维蛋白形成具有良好黏弹性和保油保水性的低钠热凝胶，凝胶类低温肉制品的NaCl添加量可以减至0.84%。

关键词：谷氨酸螯合钙；低钠；肌原纤维蛋白；热凝胶特性；乳化

Effect of Partially Substituting NaCl by Calcium Diglutamate on Heat-Induced Gelation and Emulsification Properties of Rabbit Myofibrillar Proteins

CHANG Chen-xi1, ZOU Yu-feng1, CAO Jin-xuan2, XU Xing-lian1,*, ZHOU Guang-hong1

(1. National Center of Meat Quality and Safety Control, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;

2. College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Abstract: This study attempted to reduce the content of sodium ion in low-temperature gel-type meat products by investigating the effect of partial substitution of NaCl by calcium diglutamate on processing properties of rabbit myofibrillar proteins. Rheological properties and water-holding capacity (WHC) of heat-induced gels from myofibrillar proteins extracted from rabbit Pasoas major (PM) muscle with the addition of 1.25% calcium diglutamate and 0.4%, 0.8%, 1.2%, 1.6% or 2.0% salt (comprised of 70% NaCl and 30% KCl) as well as emulsification capacity, emulsion stability, and water- and oil-binding capacities of myofibrillar protein-lipid emulsion composite gels were measured and compared with those observed when 3% salt was added (control). The results showed that the storage modulus (G’) of heat-induced myofibrillar gels was increased with increasing salt concentration and showed a significantly higher level at a salt content of 1.2% than at 3% (P ＜ 0.05); however, the WHC was decreased after an initial increase and reached the best level when the amount of added salt was 1.2%. In addition, the emulsification capacity of myofibrillar protein-lipid emulsion composite gels was positively dependent upon salt concentration, and the highest emulsion stability was achieved at 0.8% and 1.2% without significant difference as compared with the control group (P ＞ 0.05). The 1.2% and 1.6% salt groups exhibited significantly increased water- and oil-binding capacities compared with the control group (P ＜ 0.05). In conclusion, low sodium conditions caused by adding calcium diglutamate improves the viscoelasticity and water- and oil-binding capacities of rabbit myofibrillar proteins. Hence, the NaCl content of gel-type low-temperature meat products can be reduced to 0.84%.

Key words: calcium diglutamate; low sodium; myofibrillar proteins; heat-induced gel properties; emulsification

中图分类号：TS251.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0001-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407001

越来越多的消费者希望能够买到低钠的凝胶类低温肉制品[1]，但是高盐条件下肌原纤维蛋白才可溶解并实现其乳化和热诱导凝胶形成等加工特性[2-4]，因此在低温肉制品生产中一般添加不低于原料肉质量3%的NaCl[5-6]，这导致低温肉制品的食盐含量普遍偏高[7-9]。减少食盐摄入量对人类健康有益，该积极作用已被量化[10-12]。食盐的部分替代是降低钠含量的有效途径，如KCl可替代25%～30%的NaCl而不影响法兰克福香肠的质构和口感以及货架期内的食用品质[13]。流行病学调查显示，中国人均钙摄入量远低于世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的推荐摄入量[14]。凝胶类低温肉制品营养丰富，但钙含量较低。谷氨酸螯合钙是一种改善鲜味的食品添加剂，安全性高，来源充足，价格也相对低廉，可用来代替部分食盐，增加钙质补充，且生物利用率较高，易于人体吸收[15]。谷氨酸螯合钙1999年被批准使用，其在肉制品中食盐替代效果的研究刚刚开始，Woodward等[16]通过感官评定研究认为，添加0.4%的谷氨酸螯合钙即可使Bratwurst香肠配方中NaCl的含量降至0.3%，国内学者[17-18]对此进行了多次引用。然而我们前期的研究表明，不管采用哪种香肠（包括Bratwurst）或熏煮火腿的配方和生产工艺，谷氨酸螯合钙都不能如此显著地降低食盐添加量。要解释两者间的差异，就要在前人对于肉糜及感官评定的研究基础上，进一步对添加谷氨酸螯合钙的低盐条件下的肌原纤维蛋白热凝胶和乳化特性进行研究。因此本研究以兔腰大肌为材料，探讨谷氨酸螯合钙替代部分食盐对其肌原纤维蛋白热凝胶的动态黏弹性、保水性、乳化活性和乳化稳定性，以及乳化体系复合热凝胶的保油保水性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

兔腰大肌取自3月龄雄性新西兰白兔（活体兔质量2～2.5kg），购于江苏省农业科学院种兔场，分3次取样（实验完全重复3次），每次取4只，屠宰后胴体冷却4h后取肉，真空包装，每袋约200g，共12袋，－20 ℃冷冻保存，每次使用前放于冷库（2±1） ℃解冻12h。

食盐均指的是含有KCl的低钠盐，组成为70%NaCl＋30% KCl。谷氨酸螯合钙购自河南省科学院化学研究所有限公司，分析纯，钙含量为12.04%，螯合率为94.5%，由于其容易吸水受潮，因此预先配成25 g/100 mL的贮液冷藏（4d内用完）。

1.2 仪器与设备

Waring Blender 8010ES高速组织捣碎机 美国Waring公司；Ultra-Turrax T25 basic匀浆机 德国IKA公司；AUY120分析天平 日本岛津公司；J-A型落地式、AR64型台式离心机 美国Beckman Coulter公司；Physica MCR301旋转流变仪 奥地利安东帕公司；YYW-2型应变控制室无侧限压力仪 南京土壤仪器厂有限公司；WFJ2100型可见分光光度计 上海尤尼可公司；ZKSY-600智能恒温水箱 南京科尔公司；冷库操作间 上海锐欧公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纤维蛋白提取及浓度测定

肌原纤维蛋白提取方法参照Park等[19]并略作修改，所有操作均在冷库操作间（2±1）℃进行。兔腰大肌（2±1）℃条件下解冻12h，剔除脂肪和结缔组织，低速斩碎（2000 r/ min，30s）后，加入4倍体积的提取液Ⅰ（0.1mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH7.0），冰浴匀浆1 min，纱布（纱布提前用沸水煮20 min后凉干）过滤。2000×g离心15 min，弃上清，取沉淀。加入4倍体积的提取液Ⅰ，重复以上提取过程2次，重复过程不用再次过滤。沉淀重新分散在4倍体积的提取液Ⅱ（0.1mol/L NaCl）中，冰浴匀浆1 min。2000×g离心15 min，弃上清，取沉淀。沉淀分散在4倍体积的提取液Ⅱ，重复以上过程两次，再将沉淀分散在4倍体积的去离子水中洗脱两次，离心后所得沉淀物即为不含食盐的肌原纤维蛋白。提取的肌原纤维蛋白贮存于0～4 ℃，48h内用完。用双缩脲法[20]测定肌原纤维蛋白含量，以牛血清蛋白作标准曲线，计算蛋白含量。

1.3.2 试验设计

预实验结果表明，食盐或谷氨酸螯合钙的添加量与兔肉肌原纤维蛋白热凝胶的储能模量（G′）值呈正相关，添加量越大凝胶弹性越好。但食品添加剂法典专家委员会规定谷氨酸螯合钙的添加量上限为1.25%，因此本实验研究了添加质量分数为1.25%谷氨酸螯合钙和0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%食盐对兔肉蛋白热凝胶和乳化特性的影响。

1.3.3 凝胶流变学测定

用MCR301型旋转流变仪测定样品的动态流变学特性。采用50mm平板测试，将质量浓度80 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液均匀涂布于测试平台，赶走气泡。测试参数为：频率1Hz，应变0.5%，上下夹缝距离0.5mm，起始温度25 ℃，升温速率2 ℃/min，终止温度85 ℃。测定过程中，样品与空气接触处，加一层硅油密封，防止挥发。每个处理测定3个平行。测定指标为储能模量（G’）、损耗模量（G”）及相位角（δ），但本实验主要通过研究G’的变化来比较各组间弹性差异。

1.3.4 凝胶保水性测定

制备肌原纤维蛋白热凝胶：将肌原纤维蛋白溶液质量浓度调整到80 mg/mL，置于50mL离心管中，水浴加热，以1 ℃/min升温速度从20 ℃升至72 ℃，72 ℃保温30 min，然后在4 ℃条件下过夜(12h)。通过测定压榨损失来反映凝胶保水性，测定方法参照Nurkhoeriyati等[21]并略作改进：取1cm厚均匀样品使用直径为2.5cm的取样器取样，天平称量，然后置于铺有18层定性滤纸的压力仪平台上，样品上方再放18层定性滤纸，加压至35kg保持5 min。加压前后分别称质量并记录加压前凝胶质量和加压后凝胶质量。每个处理测定4个平行。按照公式（1）计算压榨损失。

（1）

式中：m1为加压前凝胶质量/g；m2为加压后凝胶质量/g。

1.3.5 肌原纤维蛋白乳化活性和乳化稳定性测定[22-23]

以6g大豆油，加入24mL质量浓度为10 mg/mL肌原纤维蛋白溶液中，12500 r/min均质1 min，低温操作。迅速从新制的乳化液底部取20μL，加入5mL 0.1%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液混匀，以相同的SDS溶液作为对照组，立即测定其在500nm波长处的吸光度A500nm。乳化液在冰盒中放置0、30、60、120、180 min时，到时间点即用相同的方法测定吸光度。每个处理测定3个平行。按照式（1）计算乳化活性。

（2）

式中：ρ为乳化前的蛋白质量浓度/（mg/mL）；φ为乳化液中油所占的体积比例/%；N为稀释倍数。

乳化稳定性在此实验中以不同存放时间下500nm波长处的吸光度来表示。

1.3.6 肌原纤维蛋白乳化体系的保油保水性测定

100mL质量浓度为80 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液，加10g大豆油，12500 r/min匀浆45s后制备肌原纤维蛋白复合热凝胶。复合热凝胶保油保水性的测定基于Kocher等[24]的离心法，按照Han minyi等[25]的参数进行设定。将制备的肌原纤维蛋白复合凝胶称质量后，于0～4 ℃条件下10000×g离心10 min，去除离出的液体，记录空离心管的质量以及离心前后离心管与凝胶的总质量。每个处理测定4个平行。按照公式（3）计算复合凝胶保油保水性。

（3）

式中：m0为离心管质量/g；m1为离心前离心管与凝胶质量/g；m2为离心去液体后离心管与凝胶质量/g。

1.4 统计分析

全部实验重复3次，每次重新提取肌原纤维蛋白，数据均用SAS8.2处理，并用Duncan’s多重比较法进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维蛋白热凝胶储能模量的影响

图 1 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维
蛋白热凝胶储能模量的影响

Fig.1 Effect of salt content on storage modulus of heat-induced myofibrillar gels containing 1.25% calcium diglutamate

流变特性是衡量凝胶类低温肉制品食用品质的关键指标。减少食盐添加量或者以其他组分部分替代食盐，对肌原纤维蛋白凝胶流变特性有显著影响。G’显示了凝胶体系的弹性特征，G’值越高说明形成凝胶的能力越好[26]。由图1可知，1.2%～2.0%组肌原纤维蛋白热凝胶形成过程中G’变化趋势相同：G’值在25～40 ℃温度范围内没有增加，说明肌球蛋白等没有变性解折叠或者变性后的分子间聚集没有引起体系弹性的显著增大；在40～45 ℃温度范围内G’值快速增加，对应肌球蛋白的头部区域（S1部分）变性发生聚集[27]；在45～53 ℃温度范围内G’值轻微下降，这可能是由于肌球蛋白尾部（S2部分）展开[27]，已形成的蛋白质立体网络结构发生一定程度的崩溃瓦解，蛋白解折叠速度超过新的分子间聚集的形成速度，体系弹性下降而黏性增加；在53～72 ℃温度范围内G’值快速增加，直到72 ℃后达到较高值，说明体系中形成更多的疏水交联或二硫键使聚集体彼此交联，使凝胶网络体系的表观弹性整体增强。0.4%和0.8%组变化趋势与上述3组类似，但是40～55 ℃温度范围内G’值没有显著增加。溶解的肌球蛋白在40 ℃开始变性，头部区域的疏水集团暴露并发生聚集，体系弹性变大，但0.4%和0.8%组的表观弹性并没有对应的增加，意味着这两组样品中肌球蛋白的溶解度低于其余组。

食盐添加量从0.4%增加到2.0%，加热终点凝胶G’值从9196Pa升高到13990Pa，增长52.1%；1.2%食盐组（同时添加1.25%谷氨酸螯合钙和1.2%食盐）热凝胶的G’值就已开始高于3%食盐组。这说明盐添加量大有利于肌原纤维的溶胀以及肌原纤维蛋白组分的溶解，加热过程中的变性解折叠增强了活性巯基等功能基团的分子间交联；该过程中谷氨酸根离子或Ca2+应该也会参与凝胶网络线的形成，并最终增强凝胶弹性。Woodward等[17]也发现钙盐和食盐添加量越高凝胶弹性越大，与本实验结论相似，但该文献认为添加0.4%的谷氨酸螯合钙即可使Bratwurst香肠配方中的NaCl含量降至0.3%，而本实验流变结果发现NaCl最低添加量为0.84%。可能是两方面原因导致该结果的差异，一是研究指标不同，Woodward等[17]采用的是感官评定法而本研究测定的是黏弹性和保水性；二是研究对象不同，本研究采用80 mg/mL的肌原纤维蛋白体系而Woodward等[17]的研究采用乳化肠肉糜，肉糜组成相对复杂，对NaCl替代效果的影响因素较多，而且不同原料肉来源和加工措施都有可能使结果发生显著变化。

2.2 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维蛋白热凝胶保水性的影响

字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图 2 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维
蛋白热凝胶保水性的影响

Fig.2 Effect of salt content on WHC of heat-induced myofibrillar gels containing 1.25% calcium diglutamate

在肉及肉制品生产加工过程中，蛋白质结合水的能力决定了保水性，保水性对产品的出品率、嫩度、颜色和多汁性都有较大影响，是客观评价肉及肉制品的重要指标，对于消费者对最终产品的喜好程度也起着至关重要的作用。肌原纤维蛋白热凝胶的保水性可用压榨损失来衡量，压榨损失越小则保水性越好。由图2可知，对照组的凝胶压榨损失在53%左右，处理组随食盐添加量增加压榨损失先减小后增大。1.2%组压榨损失为53.6%，与对照组相比无显著差异（P＞0.05），而1.6%与2.0%组的压榨损失显著增大（P＜0.05），2.0%组高达58.51%。这说明食盐添加量增加不利于添加谷氨酸螯合钙的肌原纤维蛋白的水分吸附和保持能力，Ca2+属于二价盐，倾向于在蛋白分子间形成盐桥，盐浓度过高易使蛋白-蛋白和蛋白-水分子间的交联平衡被打破，不利于水分保持，使压榨损失增大，但合适的替代比例条件下，如同时添加1.25%谷氨酸螯合钙和1.2%食盐，就可以较好的维持蛋白-蛋白以及蛋白-水分子之间的交联平衡，使蛋白保水性较好。

2.3 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响

肌原纤维蛋白是肉糜中乳化脂肪的主要蛋白[27]。乳化活性代表了蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与脂肪之间复杂的相互作用，可以用来表征该离子条件下肌原纤维蛋白体系对脂肪的最大吸附程度[28]。由图3可知，在相同谷氨酸螯合钙添加量的条件下，各处理组的乳化活性随着食盐添加量的增多而增大，0.4%食盐组乳化活性仅有18.65m2/g，而2%食盐组的乳化活性达到25.55m2/g，甚至略高于对照组的24.85m2/g。这说明食盐和谷氨酸螯合钙对蛋白乳化能力有较强的协同作用，而离子强度的增加有助于发挥肌原纤维蛋白的乳化能力。

图 3 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维
蛋白乳化活性的影响

Fig.3 Effect of salt content on emulsifying activity index of myofibrillar proteins containing 1.25% calcium diglutamate

表 1 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维蛋白乳化
稳定性的影响（

x

±s，n=3）

Table 1 Effect of salt content on lsion stability index of myofibrillar protein containing 1.25% calcium diglutamate（

x

± s, n = 3）

注：同列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

乳化稳定性指数数值变化小，说明乳化液的变化小，乳化稳定性也就越好。由表1可知，0.8%和1.2%食盐组的乳化稳定性较好，3h内吸光度分别减少27.8%和34.1%，最终的吸光度接近对照组；而其余3组特别是2.0%食盐组的乳化稳定性较差，180 min内吸光度由0.444降为0.172，减少了61.3%。这说明同时添加谷氨酸螯合钙和食盐与肌原纤维蛋白乳化稳定性的变化并非线性关系，添加合适比例的钙盐和食盐（1.25%钙盐和0.8%或1.2%食盐）可有效改善体系的乳化稳定性。

乳化稳定性体现了蛋白维持乳化液分散体系不被破坏的能力，乳化稳定性高的产品不容易产生出油出水问题。乳化稳定性受体系的pH值和离子强度、蛋白溶解和分散程度、蛋白和油脂分子的构象变化以及连续相和分散相交联化学作用力的组成等诸多因素的影响。本实验中，添加谷氨酸螯合钙的肌原纤维蛋白溶液的乳化稳定性低于对照组，这说明Ca2+促进肌原纤维蛋白乳化稳定的效果不如NaCl等单价离子，含有钙离子的乳化体系静置过程中容易发生蛋白表面结构的变化，随后通过Ca2+形成蛋白分子间的聚合或交联，从而降低对脂肪的吸附和稳定能力。

2.4 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维蛋白乳化体系复合热凝胶保油保水性的影响

图 4 食盐添加量对含有1.25%谷氨酸螯合钙的肌原纤维蛋白乳化体系复合热凝胶保油保水性的影响

Fig.4 Effect of salt content on water- and oil-binding capacities of myofibrillar protein-lipid emulsion composite gels containing 1.25% calcium diglutamate

由图4可知，随着食盐添加量增多，兔肉肌原纤维蛋白乳化体系复合热凝胶的保油保水性呈现先增大然后稳定再减小的趋势。食盐添加量从0.4%增大至1.2%，保油保水性从81.9%增至88.7%，1.6%食盐组的保油保水性为89.4%，与1.2%食盐组相比差异不显著（P＞0.05），但2.0%食盐组的保油保水性显著降低（P＜0.05）。与对照组相比，添加钙盐的1.2%和1.6%食盐组的保油保水性显著提高（P＜0.05）。这说明谷氨酸螯合钙的添加可显著改善加热后肌原纤维蛋白乳化体系复合凝胶的油水保持能力。Whiting等[29]研究发现Br－、C5H8NO4－、PO43－、P2O74－、C6H8O7－等阴离子的加工特性并不比Cl－差，替代Cl－后均可显著增强凝胶的保油保水性，其他文献中也有类似的结果报道[30-32] 。本实验结果与该结论类似。另一方面，Ca2+有助于蛋白分子间的交联，提高体系的凝胶强度，这说明加热后形成的三维凝胶网络结构对乳化脂肪球的保持也起到了重要作用。

3 结 论

综上所述，在添加1.25%谷氨酸螯合钙的条件下，肌原纤维蛋白热凝胶储能模量值随食盐添加量增多而增大，1.2%食盐组的储能模量值即高于对照组；凝胶保水性随食盐添加量的增加呈现先增强后减弱的趋势，1.2%食盐组保水性最好；各处理组的乳化活性随食盐添加量增多而增大，而0.8%和1.2%食盐组的乳化稳定性较好；1.2%和1.6%食盐组的肌原纤维蛋白乳化体系复合热凝胶的保油保水性显著高于对照组。由此可知，谷氨酸螯合钙可成功替代部分食盐，凝胶类低温肉制品中添加0.84%的NaCl即可使肌原纤维蛋白形成具有良好凝胶和乳化性能的低钠热凝胶。

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