牛肉成熟过程中氧化对钙激活酶活性及 陈茜茜,黄 明*,周光宏,徐幸莲 (南京农业大学食品科技学院,肉品加工与质量控制教育部重点实验室,江苏 南京 210095)
摘 要:为了探究牛肉宰后成熟过程中氧化对钙激活酶活性及降解的影响,在牛屠宰后立即取其背最长肌,注射不同浓度氧化剂(0mmol/L H2O2+5 mmol/L NaCl ;50 mmol/L H2O2+5 mmol/L NaCl;200 mmol/L H2O2+ 关键词:氧化;钙激活酶;活性;降解
Effect of Oxidation on the Activity and Autolysis of Calpain in Beef during Postmortem Ageing
CHEN Qian-qian, HUANG Ming*, ZHOU Guang-hong, XU Xing-lian (Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University,
Abstract: The aim of this study was to explore the effect of oxidation on the activity and autolysis of calpain in beef during postmortem ageing. The longissimus dorsi was excised from the carcass immediately after exsanguination. Then oxidizing agent with different concentrations (0 mmol/L H2O2 + 5 mmol/L NaCl; 50 mmol/L H2O2 + 5 mmol/L NaCl; 200 mmol/L Key words: oxidation; calpain; activity; autolysis 中图分类号:TS251.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)07-0023-05 doi:10.7506/spkx1002-6630-201407005 动物的肌肉组织在屠宰后的成熟过程中会发生结缔组织松散、Z线降解和肌原纤维蛋白及细胞骨架蛋白水解等变化,使肌肉的僵直解除、持水力加强、嫩度提高,从而很大程度改善了肉的食用品质[1]。目前研究发现骨骼肌中内源酶与肉类的成熟嫩化过程联系密切,主要包括钙激活酶体系、溶酶体组织蛋白酶类和细胞凋亡酶体系[2-3]。其中钙激活酶在肉类宰后成熟过程中的重要作用已被大量的研究报道所证实。有研究发现用钙激活酶在体外孵育肌原纤维蛋白能完全模拟自然成熟条件下伴肌动蛋白、伴肌球蛋白、肌间线蛋白和肌钙蛋白-T等蛋白的降解情况[4]。向鸡肉中注射钙激活酶抑制剂后,部分关键肌原纤维蛋白的降解显著降低,鸡肉的嫩度变差[5]。成熟过程中不同物种之间的嫩化程度差异与钙激活酶抑制蛋白和钙激活酶的表达量之比之间也被证实存在负相关性[6]。在肉类的宰后成熟过程中,钙激活酶对部分关键肌原纤维蛋白如伴肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌间线蛋白及肌钙蛋白-T等的降解作用改善了肉的嫩度、风味、持水力等品质[7]。由此可知,钙激活酶在肉类成熟机制中起着极为重要的作用[8]。 肌肉组织中富含亚铁血红素、不饱和脂肪酸、金属催化剂等促氧化因子,因此在肉类宰后成熟、加工、运输及贮藏过程中,肌肉组织极易被氧自由基攻击。现有研究均集中于肌肉组织中的脂肪和蛋白质氧化对肉的食用品质如肉色、嫩度、持水力、风味及营养价值的影响。如脂肪氧化会造成红肉的肉色褪色和酸败,形成不良风味[9];而添加一些抗氧化剂如VC、VE则可以抑制蛋白质氧化而使肉色保持鲜红[10];经过辐照处理的牛肉在宰后成熟过程中剪切力明显高于对照组,即嫩度降低[11];纯化的肌原纤维蛋白在体外被H2O2氧化后持水力降低[12];赖氨酸、精氨酸等必需氨基酸的结构在蛋白质氧化过程中会被不可逆转的修饰,因此肉类蛋白质的营养价值也相应降低[13]。 但是,氧化引起这些品质变化的具体机制尚未被明确阐述,仍需要深入的研究。大部分研究主要围绕氧化对肌原纤维蛋白降解的影响。有研究将纯化的肌原纤维蛋白和纯化µ-钙激活酶氧化后,再分别与µ-钙激活酶和肌原纤维蛋白孵育,结果显示与嫩度密切相关的钙激活酶-T的降解均被抑制[14-15]。钙激活酶是一类半胱氨酸蛋白酶,其活性位点上的半胱氨酸残基是各类氨基酸中最易被氧化的[13,16],且与羟基自由基的反应活性较强[17]。据此推断氧化是通过改变钙激活酶的中心活性基团进而改变其对肌原纤维蛋白的降解作用,然而这方面的报道较少,因此研究氧化对钙激活酶结构和活性的影响十分必要。本实验对牛肉体外注射氧化剂,通过活性电泳(casein zymography)和蛋白免疫印迹(Western blotting)研究钙激活酶在牛肉自然成熟过程中的活性及降解变化,旨在阐明氧化条件下的钙激活酶和关键肌原纤维蛋白之间的作用机制,为全面阐述氧化对肉类成熟的影响机制提供科学依据,并为实际生产过程中肉类品质的改善提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 取3头年龄约2.5岁、活体质量约500kg、宰后20 min内的鲁西黄牛背最长肌,牛来源于安徽翰森荷金来屠宰场。 Clone 9A4H8D3鼠单克隆抗μ-钙激活酶 美国Abcam公司;过氧化物酶标记的抗鼠免疫球蛋白 美国Bio-Rad公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜 美国Millipore公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白检测试剂盒和酶放大化学发光免疫分析(ECL)试剂盒 美国Thermo公司:牛血清白蛋白 美国Promega 公司;酪蛋白 美国Sigma公司;FeSO4、H2O2、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、TritonX-100均为国产分析纯。 1.2 仪器与设备 U410型超低温冰柜 日本日立公司;Spectramax M2酶标仪 美国MD公司;AUY120型电子分析天平 日本Shimadzu公司;Ultra Turrax T25高速匀浆器 德国Basis公司;HANNA 211 型pH计 意大利Hanna公司; Beckman冷冻离心机 美国Avanti J-E公司;小型垂直电泳系统和凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。 1.3 方法 取3条背最长肌作为3组平行,每条背最长肌切出20块,并将这20块随机平均分为4组,分别注射4个浓度的氧化剂:0 mmol/L H2O2+5 mmol/L 1.3.1 钙激活酶提取与电泳样品制备 参照Camou等[18]的方法,取1g已剔除结缔组织的肉样,加入3倍体积的提取液(100mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA、体积分数0.05% β-巯基乙醇,pH8.3)。使用高速匀浆机在4 ℃、15000r/min条件下匀浆30s,每隔10s间隔10s。然后在20000×g、4 ℃条件下离心30min。取上清液,采用BCA试剂盒测定蛋白浓度并统一调整。 活性电泳样品制定:按1∶1(V/V)的比例加入样品处理液(150mmol/L Tris-HCl、20%甘油、0.75% β-巯基乙醇、0.02%溴酚蓝,pH6.8),随即放入-80 ℃冰箱备用。 SDS-PAGE电泳样品制定:按1∶1(V/V)的比例加入样品处理液(30mmol/L Tris-HCl、3mmol/L EDTA、3%SDS、20%甘油、8%巯基乙醇、0.04%溴酚蓝,pH8.0),50 ℃水浴20min,随即放入-80 ℃冰箱备用。 1.3.2 活性电泳[19]测定钙激活酶活性 本实验中使用0.75mm的胶板,12.5%的分离胶(1.5 mmol/L Tris-HCl、pH8.8,丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺75∶1(m/m),0.05g/100mL过硫酸铵,0.05g/100mL四甲基乙二胺(TEMED),2.1mg/mL酪蛋白)和4%的浓缩胶(125mmol/L 1.3.3 蛋白免疫印迹法[20]分析钙激活酶的降解 采用1.0mm的胶板,10%的分离胶(1.5mol/L Tris-HCl、pH8.8,丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺37.5∶1(m/m),0.1 g/100 mL SDS,0.05 g/100 mL过硫酸铵,0.05 g/100 mL TEMED)和4%的浓缩胶(0.5mol/L 1.3.4 μ-钙激活酶的半定量分析 采用Quanity-One分析软件对蛋白免疫印迹条带光密度值进行半定量;μ-钙激活酶免疫印迹条带相对光密度值分别为目标条带光密度值与宰后0d未氧化处理组蛋白条带光密度值的比值。 1.4 统计分析 每组样品做3组平行,采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析,不同氧化处理组和不同成熟时间之间的差异使用邓肯多重比较,P<0.05为显著水平。 2 结果与分析 2.1 体外氧化对牛肉自然成熟过程中钙激活酶活性的影响 通过活性电泳分析在氧化条件下牛肉宰后成熟过程中钙激活酶的活性变化(图1),并对µ-钙激活酶的活性条带进行半定量,得到其相对光密度值(图2)。宰后0d和1d时,氧化对µ-钙激活酶和m-钙激活酶的活性几乎没有影响,各氧化组的相对光密度值均无显著差异
图 1 不同氧化水平对牛肉宰后成熟过程中μ-钙激活酶和m-钙激活酶 Fig.1 Casein zymography analysis showing the effect of variable oxidative conditions on the activity of μ-calpain and m-calpain during beef postmortem ageing
字母不同表示不同氧化处理组间差异显著(P<0.05)。 图 2 不同氧化水平对牛肉宰后成熟过程中µ-钙激活酶活性条带的 Fig.2 Relative optical density of μ-calpain activity under various oxidative conditions during beef postmortem ageing 另外活性电泳结果显示,牛肉宰后成熟14d时,当氧化剂浓度为0mmol/L H2O2+5mmol/L NaCl和50 mmol/L 2.2 体外氧化对牛肉自然成熟中钙激活酶降解的影响
图 3 不同氧化水平对牛肉宰后成熟过程中80kD μ-钙激活酶降解 Fig.3 Western blotting analysis showing the effect of various oxidative conditions on μ-calpain autolysis during beef postmortem ageing 本实验中使用的鼠单克隆抗μ-钙激活酶能够特异性识别80kD的μ-钙激活酶片段,通过蛋白免疫印迹法分析µ-钙激活酶降解情况(图2);采用QuatityOne分析软件对蛋白印迹条带光密度值进行半定量,得到不同成熟时间各氧化组µ-钙激活酶的相对光密度值(表1)。µ-钙激活酶的Western-blotting结果(图3)显示牛肉在宰后0d和1d时,几乎没有发生降解;在宰后成熟3d后,分子质量为80kD的μ-钙激活酶条带变浅,此时经高浓度氧化剂处理的µ-钙激活酶的相对光密度值为76.42%。7d以后, 结合活性电泳结果可知,μ-钙激活酶的活性随着其降解程度的增强而降低。曾有研究结果表明牛肉骨骼肌中μ-钙激活酶的活性增强,同时其降解被抑制[11],这与本实验结果类似。μ-钙激活酶的80kD亚基包括蛋白酶活性结构域和钙结合结构域,μ-钙激活酶一旦发生降解,活性结构域便会被破坏,从而影响其活性。μ-钙激活酶的激活所需的Ca2+浓度与自动降解所需浓度接近,因此μ-钙激活酶由80kD向更小亚基如78kD和76kD的自动降解为一直以来被认为是μ-钙激活酶激活的标志,而μ-钙激活酶被激活后的持续迅速降解导致了其活性的降低[23]。 表 1 不同氧化水平对牛肉宰后成熟过程中µ-钙激活酶 Table 1 Relative optical density of µ-calpain under various oxidative conditions during beef postmortem ageing %
注:μ-钙激活酶的相对光密度值以 ±s的形式表示。小写字母表示不同氧化处理组间差异显著性(P<0.05);大写字母不同表示不同成熟时间的差异显著性(P<0.05)。 3 结 论 本实验结果表明,在牛肉的宰后成熟过程中,氧化能促进80kD的μ-钙激活酶降解并抑制其活性,当氧化剂浓度为500 mmol/L H2O2+5 mmol/L NaCl时,μ-钙激活酶的活性和降解较未氧化组均有显著差异;并且当牛肉宰后成熟7d以后,氧化对钙激活酶的影响较成熟1、3d相比影响更大。这说明在肉类宰后成熟及贮藏过程中,辐照、冷冻解冻、高氧包装等因素导致的氧化反应会促进μ-钙激活酶降解并抑制其活性。同时本实验还揭示了牛肉的宰后储藏时间对钙激活酶降解及活性影响大于注射氧化剂对其的影响。μ-钙激活酶作为肉类宰后嫩度改善的主要贡献者,它的活性变化必然对肉类宰后相关食用品质如嫩度、风味等产生不利影响。因此本实验结果为肉类宰后成熟过程中食用品质的改善提供了科学依据。 参考文献: [1] MOHRHAUSER D A, UNDERWOOD K R, WEAVER A D. in vitro degradation of bovine myofibrils is caused by mu -calpain, not caspase3[J]. Journal of Animal Science, 2011, 89(3): 798-808. [2] SMUDER A J, KAVAZIS A N, HUDSON M B, et al. Oxidation enhances myofibrillar protein degradation via calpain and caspase-3[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2010, 49(7): 1152-1160. [3] 黄明, 黄峰, 黄继超, 等. 内源性蛋白酶对宰后肌肉嫩化机制研究进展[J]. 中国农业科学, 2011, 44(15): 3214-3222. [4] GEESINK G H, KOOHMARAIE M. Effect of calpastatin on degradation of myofibrillar proteins by mu-calpain under postmortem conditions[J]. Journal of Animal Science, 1999, 77(10): 2685-2692. [5] HUANG M, HUANG F, MA H J, et al. Preliminary study on the effect of caspase-6 and calpain inhibitors on postmortem proteolysis of myofibrillar proteins in chicken breast muscle[J]. Meat Science, 2012, 90(3): 536-542. [6] KOOHMARAIE M, WHIPPLE G, KRETCHMAR D H, et al. Postmortem proteolysis in longissimus muscle from beef, lamb and pork carcasses[J]. Journal of Animal Science, 1991, 69(2): 617-624. [7] KOOHMARAIE M, GEESINK G H. Contribution of postmortem muscle biochemistry to the delivery of consistent meat quality with particular focus on the calpain system[J]. Meat Science, 2006, 74(1): 34-43. [8] 黄明, 汤晓燕, 黄峰. 黄牛肉中钙激活酶系统的动力学性质[J]. 中国农业科学, 2010, 43(8): 1664-1669. [9] MONTGOMERY J L, PARRISH F C, OLSON D G, et al. Storage and packaging effects on sensory and color characteristics of ground beef[J]. Meat Science, 2003, 64(4): 357-363. [10] GANHAO R, MORCUENDE D, ESTEVEZ M. Protein oxidation in emulsified cooked burger patties with added fruit extracts: influence on colour and texture deterioration during chill storage[J]. Meat Science, 2010, 85(3): 402-409. [11] ROWE L J, MADDOCK K R, LONERGAN S M, et al. Oxidative environments decrease tenderization of beef steaks through inactivation of mu-calpain[J]. Journal of Animal Science, 2004, 82(11): 3254-3266. [12] BERTRAM H C, KRISTENSEN M, OSTDAL H, et al. Does oxidation affect the water functionality of myofibrillar proteins?[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(6): 2342-2348. [13] PARK D, XIONG Y L. Oxidative modification of amino acids in porcine myofibrillar protein isolates exposed to three oxidizing systems[J]. Food Chemistry, 2007, 103(2): 607-616. [14] 薛梅, 黄继超, 钱钊. 体外氧化μ-钙激活酶对牛肉肌原纤维蛋白降解的影响[J]. 南京农业大学学报, 2012, 35(4): 121-125. [15] XUE M, HUANG F, HUANG M, et al. Influence of oxidation on myofibrillar proteins degradation from bovine via mu-calpain[J]. Food Chemistry, 2012, 134(1): 106-112. [16] LAMETSCH R, LONERGAN S M, HUFF-LONERGAN E. Disulfide bond within µ-calpain active site inhibits activity and autolysis[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2008, 1784(9): 1215-1221. [17] SHARP J S, BECKER J M, HETTICH R L. Analysis of protein solvent accessible surfaces by photochemical oxidation and mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2004, 76(3): 672-683. [18] CAMOU J P, MARCHELLO J A, GOLL D E. Effects of postmortem storage on mu- and m-calpain in bovine skeletal muscle[J]. Journal of Animal Science, 2006, 84: 38-38. [19] MELODY J L, LONERGAN S M, ROWE L J, et al. Early postmortem biochemical factors influence tenderness and water-holding capacity of three porcine muscles[J]. Journal of Animal Science, 2004, 82(4): 1195-1205. [20] HUANG F, HUANG M, ZHOU G H, et al. in vitro proteolysis of myofibrillar proteins from beef skeletal muscle by caspase-3 and caspase-6[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(17): 9658-9663. [21] CARLIN K R M, HUFF-LONERGAN E, ROWE L J, et al. Effect of oxidation, pH, and ionic strength on calpastatin inhibition of mu- and m-calpain[J]. Journal of Animal Science, 2006, 84(4): 925-937. [22] ROWE L J, MADDOCK K R, LONERGAN S M, et al. Influence of early postmortem protein oxidation on beef quality[J]. Journal of Animal Science, 2004, 82(3): 785-793. [23] GUTTMANN R P, ELCE J S, BELL P D, et al. Oxidation inhibits substrate proteolysis by calpain I but not autolysis[J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(3): 2005-2012. 收稿日期:2013-05-30 基金项目:国家自然科学基金面上项目(31171706) 作者简介:陈茜茜(1988—),女,硕士研究生,研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail:2011108009@njau.edu.cn *通信作者:黄明(1970—),男,教授,博士,研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail:mhuang@njau.edu.cn |
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