狼山鸡腌制风干成熟过程中蛋白质分解及
游离氨基酸变化规律

纪韦韦1，臧明伍2，张迎阳3,*

（1.江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400；2.中国肉类食品综合研究中心，北京 100068；

3.南通双和食品有限公司，江苏 南通 226352）

摘 要：以狼山鸡为原料进行腌制风干成熟，分析测定加工过程中鸡胸肉中蛋白质分解和游离氨基酸变化情况，探究其蛋白质分解变化规律。结果表明：狼山鸡在风干成熟过程中蛋白质有显著的分解，蛋白质水解指数（proteolysis index，PI）显著降低（P＜0.05），肌肉肌浆蛋白和肌原纤维蛋白在腌制结束后显著分解（P＜0.05）；分子质量大于85kD的蛋白被逐渐分解，20～25kD的小分子蛋白逐渐累积，产品风干成熟过程中游离氨基酸总量呈显著上升趋势（P＜0.05），说明蛋白质分解形成了风味前体物质；部分游离氨基酸在风干成熟后期出现降低的趋势，说明风干成熟后期较高的温度可以促进游离氨基酸进一步转化为风味物质。

关键词：狼山鸡；风干成熟；蛋白质分解；游离氨基酸

Proteolysis and Free Amino Acid in Langshan Chicken during Curing and Air Drying Ripening

JI Wei-wei1, ZANG Ming-wu2, ZHANG Ying-yang3,*

(1. Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Jurong 212400, China;

2. China Meat Research Center, Beijing 100068, China; 3. Nantong Shuanghe Food Co. Ltd., Nantong 226352, China)

Abstract: This study was undertaken to investigate the proteolysis of myofibrillar and sarcoplasmic proteins and the consequent generation of free amino acids in the breast muscle of Langshan chicken from Nantong, Jiangsu province during curing and air drying-ripening. The results showed that the proteolysis index (PI) decreased significantly (P ＜ 0.05) during the air drying-ripening process. The contents of myofibrillar and sarcoplasmic proteins in chicken breast muscle were reduced significantly at the end of curing (P ＜ 0.05). Electrophoresis analysis showed that the proteins with a molecular weight more than 85 kD were degraded into smaller molecules (20－25 kD). Moreover, the total amount of free amino acids indicated a significant upward trend (P ＜ 0.05), suggesting the formation of flavour precursors from decomposed proteins. However, some free amino acids decreased at the late drying-ripening stage. This phenomenon indicates that higher temperature can promote further conversion of free amino acids into flavour precursors.

Key words: Langshan chicken; air-drying; proteolysis; free amino acid

中图分类号：TS251.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0072-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407015

作为肉制品的主要组成成分之一，蛋白质在风干禽肉制品的加工过程中会发生水解，这一重要生化反应对终产品的风味及滋味都有重要的作用[1]。蛋白质水解是影响肉制品产品品质的重要生化反应，在风干鸡加工过程中会发生不同程度的降解，不断累积小分子风味物质及风味前体物质，如小分子肽、游离氨基酸、小分子醛有机酸和胺类物质等[2-4]，并且参与后继氨基酸Strecker反应和Maillard反应，由此产生特征风味物质[5]。有研究证实此类小分子有机风味物质主要来自于游离氨基酸的深度降解[6-7]。另外，蛋白质的水解具体为肌肉内部的内源蛋白酶酶解肌浆蛋白、肌原纤维蛋白，主要表现为大分子蛋白质及肽类物质的减少，小分子肽类及游离氨基酸类物质不断累积[8-9]；肌肉蛋白质分解主要是在内肽酶的作用下进行，小分子肽产生的主要原因是肌肉中内肽酶的作用，而氨基端态肽酶是腌腊肉制品游离氨基酸产生的主要原因[10-11]。狼山鸡是我国著名的肉蛋兼用型地方鸡种，平均日龄为300～365d，具有肉质鲜美、浓郁的特点，其蛋白质含量约为23%，是一种优质的蛋白质资源。本实验通过对狼山鸡制作风鸡加工过程中不同阶段的鸡胸肉中蛋白质分解及氨基酸释放变化规律的分析，为传统风鸡加工采用现代工艺方法调控产品风味品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狼山鸡（鸡龄365d） 南通双和食品有限公司；消化片（5.5g硫酸钾和0.5g无水硫酸铜 丹麦Foss分析仪器公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、溴酚蓝、考马斯亮蓝、巯基乙醇、过硫酸胺 美国Sigma公司；尿素（分析纯） 天津市化学试剂三厂；丙三醇（分析纯） 天津市科盟化工工贸有限公司；三氯乙酸、硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水杨酸、盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-W420数显三用恒温水箱 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；Beckman Allegra 64R冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；2300型Kjeltec TM自动凯氏定氮仪 丹麦Foss分析仪器公司；101-O-S电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；JA2203N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；氨基酸自动分析仪 日本日立公司；602S稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂；FR-980生物电泳图象分析系统 上海复日科技有限公司；TY-80S脱色摇床 金坛市梅香仪器有限公司；SPX-250C 型恒温恒湿箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 风干成熟工艺流程

将宰杀适龄狼山鸡、放血、拔毛、去内脏、洗净鸡体、沥干水分；取质量分数2.6%的食盐分3次均匀的涂在样品的表面及腹腔内，4 ℃腌制1.5d；将腌制结束的鸡体置入恒温恒湿箱中进行风干：起始温度12.5 ℃，升温程序为温度1 ℃/12h，风干时间为92h，相对湿度在58%～62%。

1.3.2 取样

取风干成熟后的样品，剔除可见脂肪和肌膜，
－20 ℃贮藏。分别在原料肉（取样点1）、腌制结束（取样点2）、风干成熟24h（取样点3）、48h（取样点4）、72h（取样点5）、风干结束（取样点6）点取样。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 蛋白质水解指数（proteolysis index，PI）的测定

总氮含量（total nitrogen，TN）测定：精确称取解冻绞碎后的样品1.000g于消化管中，加12mL浓硫酸及1片消化片于消化管中，于消化炉中420 ℃消化1.5h，冷却后用自动凯氏定氮仪测定其氮的含量。

非蛋白氮含量（non-protein nitrogen，NPN）测定：样品解冻绞碎后，取1.000g加入25mL质量分数10%三氯乙酸（TCA），高速分散器匀浆3次（5000 r/min，20s/次），4 ℃放置过夜，冷冻离心（5000×g，4 ℃，5min），过滤，取滤液于消化管中，加5mL浓硫酸于220 ℃烘水1h，再加浓硫酸7mL，420 ℃消化1.5h，冷却后用自动凯氏定氮仪测定。按照下式[12]计算PI。

PI/%=NPN含量/TN含量×100

1.3.3.2 游离氨基酸测定

参考Virzgil等[13]的方法，略作修改：准确称取样品6.00g，加入60mL 0.2 mol/L、pH6.5磷酸盐缓冲液，匀浆（6000 r/min，3min），离心（10000×g，4 ℃，20min），定容至100 mL，取上清液5 mL，用3%水杨酸溶液调节pH2.0，离心（15000×g，4 ℃，20 min），用双蒸水定容至10 mL，取溶液0.5 mL，使用0.02 mol/L盐酸稀释5倍，用氨基酸自动分析仪检测。检测条件：洗脱液为柠檬酸缓冲液（pH3.3～4.9），显色液为茚三酮-乙二醇甲醚-乙酸钠缓冲液（2∶75∶25，V/V），除羟脯氨酸在波长440nm处检测外，其余氨基酸均在波长570nm处检测。

1.3.3.3 肌浆蛋白(sarcoplasmic protein)的提取测定

称取2g剪碎肉样，加入20 mL 0.02 mol/L pH6.5的磷酸缓冲液，高速分散器匀浆（6000 r/min，3 min），冷冻离心（10000×g，4 ℃，20 min），吸取上清液即为肌浆蛋白[14]。

1.3.3.4 肌原纤维蛋白（myofibrillar protein）的提取测定

上述离心沉淀物重新悬浮于0.03 mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液中，在高速分散器中匀浆（6000 r/min，4 min），然后离心（10000×g，4 ℃，20 min），去除上清液，重复以上操作3次，目的是为了除去肌肉中的内源蛋白酶，最终沉淀再次悬浮于8 mL 0.1 mol/L pH6.5的PBS中，另加入碘化钾和迭氮钠使最终量分别为0.7 mol/L
和0.02%，悬浮液在高速分散器中匀浆（7000 r/min，3 min），然后离心（10000×g，4 ℃，20 min），吸取上清即为肌原纤维蛋白[14]。

1.3.3.5 SDS-PAGE实验

利用考马斯亮蓝法[15]测定蛋白浓度，必要时稀释一定倍数。

SDS-PAGE电泳测定分子质量分布：参照郭尧君[16]的方法，将酶解后的蛋白产物配制成蛋白样品并与标准分子质量蛋白进行SDS-PAGE，10%分离胶，5%浓缩胶，用考马斯亮蓝G-250染色，Quantity-One分析蛋白质分子质量。

1.4 数据统计分析

用Microsoft Excel进行数据整理，采用Origin 8.0进行作图分析。不同平均值（n=3）之间用SAS 8.2统计软件的GLM程序中的邓肯氏多重比较法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 狼山鸡风干过程中蛋白质水解指数的变化

图 1 风鸡风干过程中蛋白质水解指数的变化

Fig.1 Changes in the PI of dry-cured chicken during processing

PI可以反映蛋白质的水解度以及风干过程中蛋白质分解的宏观进程。由图1可知，随着风干过程的进行，鸡肉蛋白质被逐渐分解，在腌制结束后，PI值呈现显著的上升趋势（P＜0.01），在风干结束后，PI值达到（10.61±0.09）%，相比于原料升高了20.82%。在风干成熟72h后，PI值升高速率开始减慢。造成这一现象的原因可能是，随着干腌肉制品的风干成熟过程的推进，水分活度的降低、离子浓度的相对升高、pH值环境的改变，使得内源蛋白酶酶解作用及微生物的发酵作用逐渐降低，蛋白质分解速率下降。

2.2 狼山鸡风干过程中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的变化

图 2 风鸡风干过程中蛋白质组分变化

Fig.2 Changes in protein fractions in dry-cured chicken during processing

肌浆蛋白和肌原纤维蛋白是影响干腌肉制品的风味形成的主要降解蛋白质[17]。由图2可知，在原料肉中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白占总蛋白的50%左右，并且在整个风干成熟过程中呈显著的下降趋势（P＜0.05）。肌浆蛋白易溶于低离子的中性盐溶液，因此又称可溶性蛋白质，主要包括肌红蛋白、肌粒中的蛋白质、肌球蛋白X和即溶蛋白及一些磷酸化酶[18]，鸡肉中肌浆蛋白主要与色泽、浸出物、呈味特性有关[19]，在腌制结束后，有显著的下降趋势（P＜0.05），相比于原料，风干结束后鸡肉中肌浆蛋白分解了4.36%，肌浆蛋白的分解对游离氨基酸和小分子肽的累积有重要作用；肌原纤维蛋白主要是由重酶解肌球蛋白、肌动球蛋白、肌钙蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、α及β-辅肌动蛋白构成，该类蛋白易溶于高浓度的中性盐溶液[20]。肌原纤维蛋白是构成鸡肉蛋白质的重要组成成分，主要决定肌肉的质构和其他加工功能特性，如肉的热凝胶形成能力、保水能力、脂肪乳化力等[21]。在狼山鸡的风干过程中，肌原纤维蛋白被逐渐分解，由原来的（15.08±0.07）%降低到（13.77±0.05）%。两种蛋白的分解过程与蛋白质水解指数的变化趋势相似，都是在风干结束后期风干速度出现显著的减缓过程（P＜0.05），变化趋势在整个风干过程中一致。

2.3 狼山鸡风干过程中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白分子质量变化

鸡肉蛋白质的空间组成是由不同分子质量的肽链通过二硫键等相互作用折叠组成，在风干过程中由于内源蛋白酶特异性的作用，部分不同分子质量的蛋白质被逐渐分解，产生肽类及游离氨基酸。在蛋白质的分解过程中，通过SDS-PAGE可直观的反应蛋白的分子质量分布。

0.Marker；1～6.过程取样点。图4同。

图 3 风鸡风干过程中肌浆蛋白SDS-PAGE电泳图

Fig. 3 SDS-PAGE pattern of sarcoplasmic proteins in dry-cured chicken during processing

由图3可知，肌浆蛋白的分子质量主要集中在35～120 kD之间，并且随着风干过程的进行有高分子蛋白的分解和小分子蛋白的累积。风干24h后，85 kD的条带消失；与原料肉相比，在腌制结束后，35 kD处的条带变亮，有蛋白片段和多肽的累积；在风干48h后，50 kD处的条带逐渐变暗，并且在低于25 kD处有部分条带出现。在经过风干成熟48h后，高分子的肌浆蛋白大量被分解，风干过程中肌浆蛋白的含量变化也证明了这一点。在风干结束后，肌浆蛋白的分子质量主要集中在20～85 kD之间。研究表明，引起干腌肉制品的蛋白质降解的主要酶类为组织蛋白酶和肌钙蛋白酶[22]，尤其是组织蛋白酶B和L是对肌肉蛋白质起主要作用的内肽酶[9]，在狼山鸡的风干成熟过程中对肌浆蛋白的分解有关键的作用。

由图4可知，风干过程中有部分肌原纤维蛋白被分解，为风干狼山鸡蛋白质降解的主要蛋白。狼山鸡原料肉的肌原纤维蛋白分子质量高于35 kD，在腌制结束后，20 kD及50 kD处条带变亮，与原料肉相比，50～85 kD之间有蛋白条带逐渐变暗；在风干成熟24h后大分子质量肌原纤维蛋白被大量分解，50kD附近条带变亮；并且随着风干过程的继续进行，高于85 kD的条带无明显的而变化，但在风干48h后，25～35 kD之间有新的条带出现，在风干结束后又逐渐变暗。因此，风干狼山鸡的肌原纤维蛋白在风干过程前期主要为大分子质量的蛋白逐渐降解，风干成熟后期主要为小分子质量的降解过程。主要的原因可能是在腌制及风干过程前期，肌钙蛋白酶为主要的蛋白酶类，对肌原纤维蛋白的降解起主要作用，随着风干过程的进行，水分逐渐散失及离子浓度的升高，使部分酶的活性降低；在风干成熟后期，随着温度的升高，组织蛋白酶B对肌球蛋白的大量分解导致肌原纤维蛋白的分解。

图 4 风鸡风干过程中肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳图

Fig.4 SDS-PAGE pattern of myofibrillar proteins in dry-cured chicken during processing

2.4 狼山鸡风干过程中游离氨基酸的变化

表 1 风干过程中主要游离氨基酸含量

Table 1 Major free amino acids contents in dry-cured chicken during air drying-ripening

注：以干基计；同一行上标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

由表1可知，在整个风干成熟过程中，游离氨基酸总量有显著的上升趋势（P＜0.05）。主要原因是，在风干成熟中蛋白质逐渐分解，表现为蛋白质水解指数不断增加，具体为肌浆蛋白与肌原纤维蛋白等被逐渐分解，从而出现氨基酸等小分子物质的累积。在风干成熟结束后，该值为（1588.1±4.33）mg/100g，相比于腌制结束升高了2.25倍，并且所有的游离氨基酸在腌制风干成熟中都有显著的（P＜0.05）上升趋势，其中甘氨酸、天冬氨酸、缬氨酸是增加倍数最多的游离氨基酸。在整个风干过程中未检测出半胱氨酸，可能的原因是狼山鸡鸡肉中半胱氨酸的组成较少在检测过程中并未检测到；在风干狼山鸡的游离氨基酸组成中，含量最多的是谷氨酸和赖氨酸，分别占总量的17.59%和19.93%，不同于赵改名等[5]研究得出的金华火腿中含量最多的是精氨酸的结果。另外，在风干成熟后期天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸等游离氨基酸出现下降趋势，尤其是脯氨酸在风干成熟结束后含量少于腌制结束后的量，Beriain等[23]将其归因于参与了风味物质的合成。因此，这些游离氨基酸降低的主要原因是一部分参与了风干成熟后期的美拉德反应等一系列合成反应，另一部分被微生物直接利用产生风味物质。

3 结 论

狼山鸡在风干成熟过程中蛋白质经历一个明显的水解过程：蛋白质水解指数显著升高（P＜0.05），肌肉中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白在腌制结束后有显著的分解
（P＜0.05），分子质量高于85 kD的蛋白被逐渐分解，而小分子蛋白（20～25 kD）逐渐累积，风干过程中游离氨基酸的分析，产品中游离氨基酸总量呈显著地
（P＜0.05）上升趋势，说明蛋白质分解形成了风味前提物质，其中谷氨酸和赖氨酸是含量最多的游离氨基酸；部分游离氨基酸在风干成熟后期出现降低的趋势，说明风干成熟后期较高的温度可以促进游离氨基酸进一步转化为风味物质。

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