传统四川泡菜中酵母菌的动态变化规律

曾 骏1，陈安均1,2,*，蒲 彪1,2，付莎莉1，郭双霜1

（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.四川省农产品加工及贮藏工程重点实验室，四川 雅安 625014）

摘 要：为研究传统四川泡菜发酵过程中酵母菌的动态变化规律，对传统四川泡菜自然发酵过程中的酵母菌进行分离、鉴定和计数。从自制四川泡菜样品中共分离到5株不同菌落特点的酵母菌，采用26S rDNA D1/D2区序列分析法鉴定，酿酒酵母（Kazachstania exigua）4株、膜璞毕赤酵母（Pichia membranefaciens）1株。结果表明：2种酵母菌都存在于泡菜发酵前期，初始数量为104～106 CFU/mL，随着发酵进行，泡青菜中2种酵母菌数量持续减少，泡萝卜中2种酵母菌数量先增加后减少，泡白菜中没有检测到膜璞毕赤酵母，酿酒酵母数量先增加后减少。2种酵母菌在泡菜主要发酵时期的第3～5天减少最快，5d后消失，不同发酵原料和盐水中pH值变化是影响2种酵母菌动态变化的重要原因。

关键词：四川泡菜；酵母菌；变化规律

Dynamic Changes of Yeasts during the Fermentation of Traditional Sichuan Kimchi

ZENG Jun1, CHEN An-jun1,2,*, PU Biao1,2, FU Sha-li1, GUO Shuang-shuang1

(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China;

2. Sichuan Key Laboratory of Agricultural Product Processing and Storage Engineering, Ya’an 625014, China)

Abstract: This study was designed to explore the dynamic changes of yeasts during the spontaneous fermentation of traditional Sichuan kimch. Five yeast strains from kimchi juice were isolated and identifiedby sequence analysis of the D1/D2
region of 26S rDNA as 4 Kazachstaniaexi gua strains and 1 Pichia membranefaciens strain. The results indicated that the initial quantities of both yeast species were 104－106 CFU/mL at the early fermentation stage. As the fermentation proceeded, the two yeast species showed a continuous decline in pickled bok choy and tended to increase initially and then decrease in pickled radish; however, Pichia membranefaciens was not detected in pickled Chinese cabbage, while Kazachstania exigua showed an initial increase followed by an opposite trend. The quantities of both yeast species exhibited the fastest decline from day 3 until day 5, that is the main fermentation period, to reach undetectable levels. These observed changes may be due to changes in the pH of fermentation substrates and pickle brine.

Key words: Sichuan kimchi; yeast; change

中图分类号：TS255.54 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0081-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407017

传统四川泡菜是利用一定浓度盐水泡制蔬菜，经乳酸发酵为主、兼有醋酸发酵、酒精发酵等过程制成的食品。其发酵原理是：蔬菜在5%～10%的高浓度食盐溶液中，借助于天然附着在蔬菜表面的有益微生物（主要是乳酸菌），发酵产酸，降低pH值，同时利用食盐的高渗透压，共同抑制其他有害微生物的生长。其精华在于结合了陈年的“老盐水”、具有密闭和通气功能的土陶泡菜坛等特色元素，制成四川泡菜独有的风味和口感，其原料丰富多样，以青菜、萝卜、白菜等时令蔬菜为原料发酵后形成的泡菜风味独特，不仅是佐餐佳品，而且还具有刺激食欲，健胃消食，改善肠道环境，促进胃肠健康，通便缓泻，调节血脂等功能[1-4]。

乳酸菌、酵母菌、醋酸菌是四川泡菜微生物学研究的主要对象，一直以来，学者对泡菜中起主要作用的乳酸菌研究较为全面[5-9]，而酵母菌的研究较少，已有研究主要集中在对泡菜和发酵蔬菜中酵母菌的分离、鉴定和菌种筛选上，关于四川泡菜发酵过程中酵母菌动态变化规律的研究鲜有报道。然而，酵母菌对发酵蔬菜的风味质地以及发酵后贮藏有着重要影响，且在泡菜的不同发酵阶段，酵母菌的种类和数量不同，其发酵性能差异较大，对泡菜风味品质的影响也不尽相同[10-11]。因此，研究整个泡菜发酵过程中，酵母菌的菌相构成及动态变化对进一步揭示传统四川泡菜微生态系统动态变化过程与风味品质形成的内在联系十分必要，可为规模化生产优质的传统四川泡菜提供依据。本实验通过按40%的比例加入品质优良的传统四川泡菜“老盐水”制作泡菜，分离鉴定其中的酵母菌，并通过菌落计数研究整个发酵过程中酵母菌的数量变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泡菜老盐水：从四川民间采集2年以上优质泡菜“老盐水”10份，通过感官和风味评价，筛选出Y1、Y2、Y3 3份优质“老盐水”用于实验。

蔬菜：从蔬菜市场采购新鲜的大白菜、红皮萝卜、青菜等。

调料：从蔬菜市场采购的生姜、红辣椒、花椒、食盐、冰糖、白酒等。

1.2 仪器与设备

DNP-9162电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；WH-2旋涡振荡器 上海沪西分析仪器厂有限公司；SW-CJ-1F无菌操作台 苏州净化设备有限公司；CX21FS1显微镜 上海光学仪器一厂；PHS-4C精密pH计 成都世纪方舟科技有限公司；BT124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；SYQ-DSX-280B高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DYY-10C电泳仪 北京六一仪器厂；PCR仪 德国Eppendorf公司。

1.3 培养基

YPD琼脂培养基[12]：葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母膏10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

马铃薯（PDA）琼脂培养基[12]：马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。马铃薯切成小块放入烧杯中，煮沸30min，纱布过滤，加糖和琼脂，补水至1000mL，121℃灭菌20min。

孟加拉红琼脂培养基：购于杭州微生物试剂有限公司，按说明配制，121℃灭菌20min。

1.4 泡菜制作工艺

40%优质“老盐水”和60%饮用水

↓

原料→清洗→晒干→切分→称量→装坛→密封→发酵→成品

↑

配料（食盐、花椒、辣椒、生姜、冰糖、白酒）

配方：采用3种优质泡菜“老盐水”分别泡制3种蔬菜，将泡制后的盐水用于研究。泡菜的主要原料及“老盐水”配方见表1，再分别向坛中加入食盐160g、花椒5g、辣椒50g、生姜20g、冰糖10g、白酒20mL制作泡菜。

表 1 传统四川泡菜的制作配方

Table 1 The recipes for traditional Sichuan kimchi

1.5 酵母菌分离、纯化及鉴定

样品为按1.4节制成的传统四川泡菜盐水，每天取样1次，分离其中的酵母菌。无菌操作下取泡菜盐水25 mL，加入225 mL无菌水中，漩涡振荡器振荡30s，再取1 mL稀释液加入9 mL无菌水中，依次稀释成10-1，10-2、10-3、10-4、10-5倍稀释液，分别取0.3 mL稀释液接种到3种培养基（孟加拉红、PDA、YPD琼脂培养基）上，每个处理3次重复，置于恒温培养箱中28 ℃培养24h，观察菌落长出时间、菌势强弱和菌落形态，无菌操作下取不同形态的酵母菌单菌落于孟加拉红培养基上划线纯化[13]，3次纯化后的单菌落用于显微镜镜检和分子鉴定。

分子鉴定方法采用26S rDNA D1/D2区序列分析法。对不同菌落特点的菌落随机取样2～3个用作PCR模板；PCR引物：NL1 5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’，NL2 5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’；PCR体系（总体积50 μL）：引物1 μL×2，模板1 μL，Mix 25 μL，ddH2O 22 μL；PCR 反应程序：94 ℃变性1min，55 ℃退火1min，72 ℃延伸55s，36个循环；72 ℃延伸10min，4 ℃保存。PCR产物由北京华大中生科技发展有限公司测序。将测序结果输入 www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST软件，将测得的基因序列与GenBank数据库的序列进行同源性比较。

1.6 菌落计数方法

通过不同酵母菌在培养基上表现出的不同菌落特点来分别计数[14-15]：按1.5节的取样方法，将样品接种于3种
培养基（孟加拉红、YPD和PDA培养基）。观察选取最容易区分菌落特点和便于计数的培养基。对不同菌落特点的酵母菌分别编号、计数、划线纯化、鉴定；对相同菌落特点的菌随机取2～3个，划线纯化、鉴定。根据计数结果与鉴定结果相结合得出每种酵母菌的数量，例如：有几个菌落特点不同的菌种经鉴定属于同种酵母菌，就将之前的分别计数结果相加得出最终数量。

1.7 传统四川泡菜发酵过程中酵母菌的动态变化规律

按照1.4节所述泡菜制作工艺，用3种“老盐水”（编号为Y1、Y2、Y3）分别泡制萝卜、白菜、青菜，形成9个泡菜样品。在泡制第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15天分别从9个样品中取样，对其中不同菌落特点的酵母菌分别计数，同时用精密pH计测定盐水中的pH值，得到不同发酵时间泡菜发酵液中的pH值变化情况。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离鉴定

从平板上分离得到5株酵母菌，菌株编号分别为CP-A、CP-C、CP-J、CP-K、CP-L，经分子鉴定，其中4株
为酿酒酵母，另1株为膜璞毕赤酵母，鉴定结果见表2。

表 2 5株酵母菌26S rDNA鉴定结果

Table 2 Identification of five yeast strains based on 26S rDNA

2.2 菌落计数结果

在YPD培养基上，2种酵母菌的菌落特点鲜明，长势最好，便于分别计数，图1为2种菌在YPD培养基上的菌落差异。2株酵母菌最佳的计数浓度梯度为10-3、10-4、10-5，最佳的计数时间为发酵后48～60h。结合上述鉴定结果，将最初对CP-A、CP-J、CP-K、CP-L的计数结果相加得到酿酒酵母的数目，CP-C的计数结果为膜璞毕赤酵母的数目。

a

b

图 1 YPD培养基上酿酒酵母（a）和膜璞毕赤酵母（b）的菌落差异

Fig.1 Comaprative colony morphology between Kazachstania exigua and Pichia membranefacienson (a) in YPD medium (b)

2.3 传统四川泡菜发酵过程中酵母菌的动态变化规律

2.3.1 酿酒酵母的动态变化规律

选取菌落数为30～300CFU的平板计数，以1 mL泡菜盐水中菌落数的常用对数为纵坐标、发酵时间为横坐标进行统计，得到泡青菜、泡萝卜和泡白菜过程中酿酒酵母的动态变化规律，如图2A～C所示。发酵刚开始，酿酒酵母数量为104～106 CFU/mL。泡青菜中，酿酒酵母的数量持续减少，发酵第3～4天减少最快，在第5天左右消失（图2A）；泡萝卜中，酿酒酵母的数量先增加后减少，发酵后2d，酿酒酵母的数量最大，达到107 CFU/mL，
之后快速减少，第5天左右消失（图2B）；泡白菜中，酿酒酵母的数量先增加，发酵后1d达到最大值，之后快速减少，4d后消失（图2C）。

图 2 3种“老盐水”样品泡制青菜（A）、萝卜（B）、
白菜（C）过程中酿酒酵母的动态变化规律

Fig.2 Dynamic growth curves of Kazachstania exigua during pickling of bok choy (A), radish (B) and Chinese cabbage (C) with three different brines (Y1, Y2 and Y3)

2.3.2 膜璞毕赤酵母的动态变化规律

泡白菜中没有检测出膜璞毕赤酵母，泡青菜和泡萝卜过程中膜璞毕赤酵母的动态变化规律如图3所示。

图 3 3种“老盐水”样品泡制青菜（A）、萝卜（B）
过程中膜璞毕赤酵母的动态变化规律

Fig.3 Dynamic growth curves of Pichia membranefaciens during pickling of bok choy (A), radish (B) and Chinese cabbage (C) with three different brines (Y1, Y2 and Y3)

由图3A可知，在泡青菜中，其初始数量为104～105 CFU/mL，随发酵进行，其数目持续减少，在发酵第3～4天减少最快，4d后消失；由图3B可知，在泡萝卜中，膜璞毕赤酵母的初始数量为5×104 CFU/mL左右，随发酵进行，其数目呈先增加后减少的趋势，2d后达到最大值，超过
106 CFU/mL。之后采用Y2老盐水、Y3老盐水的发酵液中膜璞毕赤酵母的数目开始缓慢减少，5d后消失；而采用Y1老盐水的发酵液中，其数目一直维持在105 CFU/mL左右，发酵11d后开始减少，同时发现，采用Y1老盐水泡制萝卜10d后，泡菜表面出现白膜（俗称“生花”），这可能与Y1发酵液中酸度上升缓慢，后期酵母菌较多有关。

2.4 不同发酵时间发酵液中pH值的变化

表 3 不同发酵时间下3种“老盐水”泡制3种蔬菜过程中
盐水pH值的变化

Table 3 Changes in the pH of three different brines during pickling of bok choy, radish and Chinese cabbage

如表3所示，采用老盐水Y1泡制不同原料时，pH值变化范围为2.9～6.0，采用老盐水Y2和Y3时，pH值变化范围为2.8～4.0。利用3种“老盐水”泡制蔬菜过程中，pH值都随发酵的进行呈下降趋势，且在发酵3～6d下降较快，后期pH值维持在3左右。Y1老盐水泡制白菜时，pH值下降最快，第4天下降到3.5以下，而低pH值会抑制酵母菌的生长[16-17]，与上述关于酵母菌在泡白菜中存在时间更短相吻合。Y1老盐水泡制萝卜时，盐水的pH值在发酵后10d才下降到4以下，较高的pH值可能是该发酵液中膜璞毕赤酵母存在时间较长的重要原因。

3 结论与讨论

本实验分离得到2种酵母菌：酿酒酵母（Kazachstania exigua）和膜璞毕赤酵母（Pichia membranefaciens），数量为104～107 CFU/ mL，仅存在于泡菜发酵前期。与之前文献[10-11,18]报道从泡菜中分离得到酵母菌种类多、数量大、持续时间长有较大不同，原因可能有以下两点：一是样品来源不同，之前研究大多是腌制蔬菜，其半封闭的发酵方式与厌氧发酵的传统四川泡菜差别较大；二是本研究采用40%“老盐水”制作泡菜，盐水中本身乳酸菌较多，环境中pH值快速降低至3以下，多数酵母菌难以生长，尤其在发酵后期。

2种酵母菌都存在于泡菜发酵前期，初始数量约为104～106 CFU/mL，随着发酵进行，泡青菜中酵母菌数量持续减少，泡萝卜和泡白菜中酵母菌数量先增加后减少，在泡菜主要发酵时期的第3～5天减少最快，5d后消失。这与杨瑞[19]研究认为泡菜发酵过程中酵母菌的浓度会经历“先上升，达到最高点再下降”的结果一致。而泡菜中酵母菌的数量与pH值、酸度密切相关[20]，结合泡菜发酵液中的pH值变化，可以推测，传统四川泡菜在发酵的3～6d是泡菜发酵的最主要时期，是乳酸菌大量繁殖，大量产酸，逐渐抑制酵母菌而成为泡菜优势菌群的时期。本实验利用3种不同的“老盐水”发酵3种常见蔬菜，其变化趋势基本一致，研究结果具有一定代表性，并发现采用不同原料，盐水中酵母菌的数量变化差异较大。

四川泡菜发酵是一个多种微生物共同发挥作用的混合发酵体系，通过实验发现：发酵前期，酵母菌数量较多，其既可以有效利用可发酵糖，抑制杂菌生长，又能产生一定的醇香和酯类物质，因此，在泡菜工业化生产时，可以选择在前期加入更多的酵母菌，数量以
106 CFU/mL左右为宜，发酵3～6d是乳酸菌大量产酸时间，应加入更多的乳酸菌，保证盐水pH值的快速降低。而发酵后期酵母菌较多，会使泡菜“生花”和产生不愉快的风味，影响泡菜风味和品质[21-22]。因此，应严格控制后期发酵液中的酵母菌数量。已有研究[23-26]表明：环境中盐浓度变化、pH值降低、其他微生物的积累以及香辛料逐渐溶于泡菜水，都会导致酵母菌种类和数量的变化，可通过这些措施来促进和抑制其生长和繁殖。然而，酵母菌的动态变化是如何对四川泡菜风味和口感产生作用的，它们之间的关联还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 林燕文, 黄君红, 黄建杏, 等. 泡菜营养强化食品的研制初探[J]. 食品科技, 2001, 26(2): 28-29.

[2] 罗冬英, 尹传武. 乳酸菌制剂对人体保健功能的机理探讨[J]. 兰州大学学报, 2002(4): 53-54.

[3] SUN M, JEON Y S, RHEE S H, et al. Red pepper powder and Kimichi reduce body weight and blood and tissue lipids in ratsfed a high fat diet[J]. Nutraceuticals and Food, 2002, 7(2): 162-167.

[4] 蒋和体, 卢新军. 泡菜对大鼠血脂的调节作用研究[J]. 食品科学, 2008, 29(1): 314-316.

[5] 李铁军, 李爱云. 乳酸菌抗菌机理研究进展[J]. 微生物学通报, 2002, 29(5): 81-85.

[6] VINDEROLA G, PERDIGÓN G, DUARTE J, et al. Effects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity[J]. Cytokine, 2006, 36(5): 254-260.

[7] AMROUCHE T, BOUTIN Y, PRIOULT G, et al. Effects of bifidobacterial cytoplasm, cell wall and exopolysaccharide on mouse lymphocyte proliferation and cytokine production[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(1): 70-80.

[8] 蒋欣茵, 李晓辉, 张伯生, 等. 腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定[J]. 中国酿造, 2008, 27(1): 13-16.

[9] 郑坚. 乳酸菌对血脂的影响[J]. 黄冈师范学院学报, 2002, 22(3): 37-38.

[10] 贺稚非, 李洪军, 任俊琦. 发酵蔬菜低温贮藏酵母菌动态变化研究[J]. 食品科学, 2011, 32(13): 165-168.

[11] 张鹏. 四川泡菜中酵母菌的分离筛选及其应用研究[D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2007.

[12] 黄秀梨, 辛明秀, 夏立秋, 等. 微生物学试验指导[M]. 北京: 高等教育出版社, 1999: 114-117.

[13] 哈瑞根. 食品微生物实验室手册[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2004: 36-37.

[14] TABASCO R, PAARUP T, JANER C, et al. Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L.paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(9): 1107-1114.

[15] XIONG Tao, GUAN Qianqian, SONG Suhua, et al. Dynamic changes of lactic acid bacteria flora during Chinese sauerkraut fermentation[J]. Food Control, 2012, 26(1): 178-181.

[16] 潘静, 王昌禄. 多耐性酒精酵母菌的选育及特性研究[J]. 中国酿造, 2011, 30(5): 113-116.

[17] 单艺，张兰威. 优选糯米酒腐木生假丝酵母菌Y-2生长性能及其酿造条件优化的研究[J]. 食品科技, 2007, 32(11): 40-45.

[18] WOOD B J B. 发酵食品微生物学[M]. 徐岩. 译. 北京: 中国轻工业出版社, 2001: 42.

[19] 杨瑞. 泡菜微生态的研究[D]. 成都: 四川大学, 2006.

[20] 罗松明, 刘书亮, 杜晓华, 等. 四川泡菜微生态分布及其与盐度、酸度的关系[J]. 食品与发酵工业, 2013, 39(2): 29-34.

[21] 鄯晋晓. 四川泡菜菌系分离、筛选及发酵剂的研究[D]. 重庆: 西南大学, 2008.

[22] 何玲, 李勤振, 浆水芹, 等. 菜发酵过程中优势菌群的分离、鉴定及变化[J]. 食品科技, 2010, 35(5): 36-40.

[23] 张鹏, 张兰威, 吴海波. 香辛料对四川泡菜中酵母菌生长的影响[J]. 中国调味品, 2007, 32(6): 28-32.

[24] 杨瑞, 张伟, 陈炼红, 等. 发酵条件对泡菜发酵过程中微生物菌系的影响[J]. 食品与发酵工业, 2005, 31(3): 90-92.

[25] ALVAREZ-MARTIN P, FLOREZ A B, HERNÁNDEZ-BARRANCO A, et al. Interaction between dairy yeasts and lactic acid bacteria strains during milk fermentation[J]. Food Control, 2008, 19(1): 62-70.

[26] KUNG H F, LEE Y H, TENG D F, et al. Histamine formation by histamine-forming bacteria and yeast in mustard pickle products in Taiwan[J]. Food Chemistry, 2006, 99(3): 579-585.