基于混合培养和高通量测序分析云南传统发酵豆豉中活性细菌群落

李晓然1，龚福明1,2，李 洁1，罗义勇1，柳陈坚1,*

（1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.德宏职业学院基础系，云南 芒市 678400）

摘 要：选择两个使用传统发酵的豆豉样品，先进行混合预培养，再对混合培养液进行DNA提取和16S rRNA基因扩增及焦磷酸测序，最后对得到的序列进行分析。结果表明：两个样品在序列相似度为98%时多样性均较高。其中XG_1的主要细菌为肠球菌、甲基营养型芽孢菌和乳酸片球菌，在XG_2中的主要细菌为枯草芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌。

关键词：发酵豆豉；混合培养；细菌群落；焦磷酸测序

Active Bacterial Community Diversity in Traditional Fermented Soybean in Yunnan Using Mixed Culture and Barcoded Pyrosequencing

LI Xiao-ran1, GONG Fu-ming1,2, LI Jie1, LUO Yi-yong1, LIU Chen-jian1,*

(1. Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China;

2. Basic Department, Dehong Vocational College, Mangshi 678400, China)

Abstract: In this study, bacterial communities in two samples of traditional fermented soybean in Yunnan province were analyzed by the combined use of mixed culture and 16S rRNA gene barcoded pyrosequencing. Results revealed high bacterial community diversities of both samples at a 0.02 cutoff. In sample XG_1, the major bacteria were Enterococcus spp., Bacillus methylotrophicus and Pediococcus acidilactici. In sample XG_2, the abundant bacteria were Bacillus subtilis and B. methylotrophicus.

Key words: fermented soybean; mixed culture; bacterial community; pyrosequencing

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0090-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407019

发酵食品是指利用益生微生物加工制造而成的一类具有独特风味与营养价值的食品，其中，豆豉是以大豆或黄豆为主要原料，经由原料处理、制曲及后发酵三阶段酿制而成，它不仅风味独特，而且还富含多种生理活性物质。由于云南省独特的地理位置、气候条件和民族文化传统，生物资源繁多，发酵食品中具有独特和宝贵的微生物资源，由于缺乏对这些微生物全面的了解，这些宝贵的资源仍未得到很好的开发。

在过去的几十年中，大多数的微生物生态学家都在致力于分离和鉴定特殊环境中的微生物类群，通过这种方法已经获得了许多非常有用的信息。然而，由于许多微生物无法在实验室中通过常规培养得到，这使得可培养微生物的范围非常有限。基于分子生物学技术的针对rRNA基因的探索极大地促进了环境中微生物群落多样性的研究。rRNA基因在细胞中相对稳定，同时含有保守序列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要指标[1-2]。2008年，Hamady等[3]展示了一种使用焦磷酸测序可以同时平行分析多个样品的策略，在对不同的样品进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增时在引物的5’末端加上由8个碱基组成的标记（barcode），在同一次测序反应中同时分析了286个环境样品，由于使用高通量测序，每一个样品都可以得到较多的序列。这一方法在分析多个样品微生物群落多样性领域得到了极为广泛的应用。

然而，在对微生物群落进行DNA提取的过程中，游离于细胞外的DNA以及已经死亡的细胞的DNA依然会被提取出来并进行后续的实验，因此，基于DNA的分子生物学方法往往会因为这些非活性的DNA的存在而高估样品的微生物多样性。另外，在发酵食品中，并非所有的细菌都对食品发酵起作用，尤其是传统发酵方法制作的食品，其微生物来源于发酵基质和发酵环境，很多的微生物可能是死亡或者不起作用。

因此，在本研究中，对豆豉样品先采用富集细菌的液体培养基进行混合培养，对其中活着的细菌进行富集培养，然后对培养液提取总的DNA，再进行16S rRNA基因的扩增和焦磷酸测序，以此来分析豆豉中具有活性的细菌群落。将混合培养和16S rRNA基因高通量测序的方法结合起来可以分析发酵食品中具有活性的主要细菌种类及其相对丰度，为研究发酵食品中微生物群落提供更加全面而准确的信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆豉 云南省迪庆自治州（香格里拉）菜市场，为传统发酵制成的加辣椒等调料的发酵大豆，两个样品分别命名为XG_1和XG_2。购买后置于冰盒中运送到实验室，－80℃保存。

DNA提取裂解缓冲液：0.1 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L EDTA、0.75 mol/L蔗糖。

1.2 仪器与设备

Labnet230V EU涡旋仪 美国Labnet公司；ABI 7200PCR仪 美国ABI公司；罗氏GS-FLX测序仪 瑞士Roche公司；Nanodrop ND-1000分光光度计 美国Thermo公司；Sigma 3-18K离心机、玻璃珠（直径212～300 µm） 美国Sigma公司；Premix Ex Taq™ 日本TaKaRa公司；QIAquick gel Extraction Kit 德国Qiangen公司。

1.3 方法

1.3.1 预培养

在无菌培养下称取豆豉样品1.0 g，置于5 mL生理盐水中进行研磨和振荡，取混合液体20 μL接种至5 mL NA培养基中，置于35 ℃培养24 h。

1.3.2 DNA提取

DNA提取参考Schmidt等[4]的方法并做了部分改变，步骤如下：取1 mL混合培养液离心收集菌体，加入450 μL裂解缓冲液和10 μL 50 mg/mL溶菌酶，37 ℃水浴30 min。加入25 μL 20% SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，55 ℃水浴2 h以上后，加入0.1 g玻璃珠，于涡旋仪上以最高转速振荡5 min，之后将离心管放置于研钵中，加入液氮冻融3次。加入80 μL 5 mol/L NaCl和60 μL 10g/100mL CTAB，小心混匀，65 ℃水浴20 min。分别用等体积苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，V/V）和氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）抽提一次。加入0.6倍体积的异丙醇于－20 ℃沉淀DNA，最后加入50µL TE（0.01 mol/L Tris-HCl，pH8.0；0.001 mol/L EDTA，pH8.0）缓冲液溶解DNA。提取好的DNA保存于－20 ℃。

1.3.3 细菌16S rRNA基因扩增和焦磷酸测序

使用细菌的16S rRNA基因V3～V5高变区通用引物对提取的DNA进行扩增。扩增使用通用引物338F（5’- ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3’）和907R（5’- CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3’），并在引物338F的5’末端添加8个碱基的标记。为了减少PCR产物中非特异性扩增的异源双链DNA的含量，将PCR产物稀释10倍作为模板后按照原来的条件再做5个循环[5]。PCR扩增采用Premix Ex Taq™具体体系及程序如下。在50μL 的PCR反应体系中：ddH2O 18μL，正向引物（5μmol/L） 2μL，反向引物（5μmol/L）2μL，Premix Ex Taq™ 25μL，模板（15ng）3μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5min；94 ℃变性1min，56 ℃复性1min，72 ℃延伸1min，共30个循环；最后72 ℃延伸7min，4 ℃保存。

将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳后将凝胶浸泡于含有20µg/mL EB的TAE缓冲液中10 min后在紫外灯（216nm）照射下呈现橙色的条带，目标条带割下后使用QIAquick gel Extraction Kit回收PCR产物。使用Nanodrop ND-1000分光光度计将纯化好的PCR扩增产物定量。由国家人类基因组南方研究中心使用焦磷酸测序对DNA进行测序。

1.3.4 测序结果分类鉴定

对于焦磷酸测序的测序结果分析质量文件，去掉含有“N”的序列，并对序列长度进行筛选，删掉长度小于300 bp的序列，根据Barcode将序列确定各个本样品的序列，并去除Barcode和引物序列，得到有效的序列文件。使用Mallard v1.02[6]来检测PCR产物序列中的嵌合体。使用mothur v1.25.1[7]的classify.seqs命令，采用Silva的核糖体小亚基RNA（SSU rRNA）序列数据库V102[8]的分类信息，得到序列的分类信息，分别采用80%的置信区间。

1.3.5 多样性指数和系统发育分析

对所有序列使用Mothur v1.25.1[7]进行比对，以0.02和0.05为Cutoff值划分可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。计算Cutoff为0.02和0.05时的ACE和Chao1值，并绘制Rarefaction曲线。从细菌
16S rRNA基因序列中每个OTU选取代表序列，将其在NCBI的GenBank进行BLAST比对，将结果中具有确定分类信息的序列用ClustalX 1.83[9]进行比对，将比对的结果用Mega v4.0[10]中的邻接法（Neighbour-Joining）方法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 序列信息和多样性指数

对焦磷酸高通量测序的结果进行分析，通过添加的Barcode将序列分到两个样品中，XG_1有478条序列，XG_2有437条序列，对两个序列文件进行长度和质量删选，去掉含有“N”的序列，将大于350 bp的序列用来做后续分析，XG_1有417条序列，XG_2有384条序列。

为了消除不同序列数目对多样性指数的影响，在两个样品中都随机选取380条序列来分析其多样性指数，分别以0.02和0.05为Cutoff，OTU数目、Singleton（有2条序列的OTU）、Doubleton（有2条序列的OTU）数目以及多样性指数ACE和Chao1值如表1所示。所有多样性指数均显示，样品XG_1的丰度远远大于XG_2，在Cutoff为0.02时，即大约相当于种的分类水平时，两个样品均显示了较高的多样性，然而在Cutoff为0.05，即大约相当于属的分类水平时，XG_1的多样性还较高，而XG_2的多样性已经很低。图1显示了OTU数目随着序列数增长情况的Rarefaction曲线，在Cutoff为0.05时，两个样品的曲线均呈现出了接近平台的趋势，而在Cutoff为0.02时，两个曲线的上升趋势还很明显，说明在种的水平上，测序量可能还不能完全反映两个样品的多样性。

表 1 基于Cutoff 0.02和0.05的细菌丰度

Table 1 Bacterial richness with cutoffs of 0.02 and 0.05

注：OTU、Singleton和Doubleton数目为使用样品所有序列计算的值；ACE和Chao1值均为随机选取380条序列计算得到的值。

图 1 根据Rarefaction方法估计豆豉样品细菌的多样性

Fig.1 Estimated OTU numbers according to the rarefaction method depending on OTU identification with the cutoffs of 0.02 and 0.05

2.2 细菌群落结构

根据Silva的SSU rRNA序列数据库对序列进行分类，两个样品中所有的序列都属于厚壁菌门（Firmicutes）。对于XG_1，厚壁菌门中包含了3个目，分别是乳酸杆菌目（Lactobacillales，264条序列，63%），芽孢杆菌目（Bacillales，149条序列，36%）和候选目432-1（Candidate order 432-1，4条序列，1%）。在乳酸杆菌目中，146条序列属于肠球菌科（Enterococcaceae），88条序列属于乳酸杆菌科（Lactobacillaceae），21条序列属于肉杆菌科（Carnobacteriaceae）；在芽孢杆菌目中，全部序列都属于芽孢杆菌科（Bacillaceae）。另一个样品XG_2的细菌群落则更为简单，厚壁菌门中包含了2个目，分别是芽孢杆菌目（367条序列，96%）和候选目432-1（17条序列，4%）。芽孢杆菌目中所有序列全部属于芽孢杆菌科。可见，在XG_1中，具有活性的优势菌为乳酸菌，而在XG_2中则为芽孢杆菌。

将在Cutoff为0.02时两个样品共81个OTU进行分析，去除Singleton和Doubleton后的23个OTU用来构建系统发育树，如图2所示。两个样品中具有活性的细菌种类是不一样的，大多数的OTU都属于芽孢杆菌科，尤其是XG_2，全部的OTU都在这个科中，丰度最高的OTU为XG_2_M4，有267条序列（70%），它与枯草芽孢杆菌亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis 6051-HGW）（CP003329）呈现出较高的相似度。在XG_2中，丰度第二高的OTU为XG_2_DT，有47条序列（12%），其16S rRNA基因序列与甲基营养型芽孢杆菌
（B. methylotrophicus strain CBMB205）（EU194897）显示出较高的相似度，同时，在XG_1中丰度第二高的OTU XG_1_AF也可鉴定为这一细菌。OTU XG_2_0X包含27条序列（7%），经过鉴定，与炭疽杆菌（B. anthracis strain g9B-2）（HQ238757）相似度较高，这株菌是在小麦发酵食品的生产房间中检测到的。

图 2 细菌的系统发育树

Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences and their phylogenetic relationships

在样品XG_1中，样品的均一度与XG_2也不一样，丰度最高的OTU XG_1_EJ仅有103条序列，占25%，这个OTU属于肠球菌科，其16S rRNA基因序列与多株肠球菌如耐久肠球菌（Enterococcus durans）、蒙氏肠球菌（E. mundtii）和海氏肠球菌（E. hirae）均显示了较高的相似度，并和从米糠中分离到的16S rRNA基因序列也呈现了较高的相似度（AB671280）。丰度第三的OTU为XG_1_NA，有58条序列，占14%，在系统发育树上与乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici strain Ni1001）（AB598949）聚类在一起。此外，从系统发育树上可以看出，有部分序列不能与已知分类信息的细菌16S rRNA基因序列完全聚类在一起，也暗示了在这两个样品中，有部分细菌是未培养细菌，值得更为深入的研究。

3 讨 论

本研究使用了培养和分子生物学高通量测序方法的结合，对传统发酵食品的主要种类之一豆豉中具有活性的细菌群落进行了分析。这种方法既规避了实验室传统培养方法对微生物种类的限制，同时由于在DNA提取之前进行了富集培养的步骤，使得在样品中具有活性的细菌得到富集生长，也避免了直接使用分子生物学方法分析而受到样品中死细胞的干扰从而高估了细菌多样性。

在样品XG_1中，丰度最高的OTU与耐久肠球菌或蒙氏肠球菌的序列具有明显的相似性。在以前的研究中，耐久肠球菌被认为有抗真菌活性，在发酵食品中，真菌尤其是霉菌的污染和增殖是食品变质的重要方面，因此，耐久肠球菌的这一特性无疑为食品提供了保鲜成分，延长其保存时间。而蒙氏肠球菌则有产生细菌素的能力[11]，细菌素也是乳酸菌产生的具有生物防腐的物质之一。其次为可鉴定为枯草芽孢杆菌的OTU，这一OTU也是样品XG_2中的优势菌。枯草芽孢杆菌虽然在自然界中广泛存在，如土壤[12]、空气[13]等，近年来，也在人体肠道样品中多次检出[14]，被认为是正常的肠道菌群，与人类共生。枯草芽孢杆菌在食品发酵中也发挥着重要作用，如日本纳豆中就是由纳豆枯草芽孢杆菌（B. subtilis natto）发酵而成，可以释放胞外蛋白酶来消化大豆蛋白[15]。甲基营养型芽孢杆菌也同样遍布在土壤[16]和海水[17]中，也有研究证明一株分离自土壤的该菌可以产纤维素酶[18]，在大豆发酵中也起到降解纤维素的作用。丰度第三高的OTU被鉴定为乳酸片球菌，这是食品发酵中重要的乳酸菌之一，也是主要的益生菌之一，可以用于发酵蔬菜、乳制品和肉类。乳酸片球菌还可以保护肠道，使病原体如痢疾杆菌、沙门氏菌等在肠道定殖[19]。在以前的研究中，尚未有任何研究证明乳酸片球菌有毒性作用，因此非常适合作为益生菌用于发酵食品。在样品XG_2中另一个主要的OTU被鉴定为炭疽杆菌，研究证明，在多种食品相关样品中都检测到了炭疽杆菌的孢子[20-21]。然而，值得注意的是，芽孢杆菌可以形成内生孢子，能够承受极端的环境条件。因此，在两个样品中存在的具有活性的芽孢杆菌，并不能准确判断其来源及作用，若要了解其在豆豉发酵中的具体作用，还需要进一步的活性测试和基于RNA的相关分析。

本研究分析的两个豆豉样品培养液的细菌多样性，其中一个样品不具有明显的优势菌，主要的细菌为肠球菌、乳酸片球菌和甲基营养型芽孢菌，另一个样品主要的优势菌为枯草芽孢杆菌。作为乳酸菌的重要组成部分，肠球菌和乳酸片球菌在发酵食品中的作用非常重要和明显，然而，芽孢杆菌由于其广泛的环境适应能力，也可以在食品发酵中发挥作用，因此在本研究中很难明确其作用，这一点仍需结合功能基因的表达进行更为深入的研究。

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