葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的Candida tropicalis过量表达及其对木糖醇合成代谢的影响

高雪楠1，张 婵1,*，尹 胜2，张秋晨2，王成涛1,2,*，徐宝财1,2

（1.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；

2. 北京工商大学 食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

摘 要：研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd过量表达对Candida tropicalis木糖醇生物合成代谢的影响。克隆Candida tropicalis CT16的g6pd基因，并将其与表达载体pYES-pgk重组连接，构建重组载体pYES-pgk-g6pd，LiAc/ssDNA/PEG
方法转化导入C. tropicalis CT16，筛选阳性转化子，实现g6pd基因的过量表达。结果表明：发酵62h，阳性转化子
C. tropicalis SYG5的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力提高了300%，发酵液中木糖醇质量浓度达到79.90g/L，较野生型对照菌株的木糖醇产量提高了12.41%，木糖醇产率提高了44.94%。因此，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在C. tropicalis木糖醇的合成代谢途径中发挥重要作用，增强g6pd基因的表达，可以明显提高菌体NADPH供应量和还原力，有利于木糖醇的生物合成。

关键词：Candida tropicalis；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；g6pd基因；过量表达；木糖醇

Cloning and Overexpression of Glucose-6-phosphate dehydrogenase in Candida tropicalis and Its Influence on Xylitol Biosynthesis

Gao Xue-nan1 , Zhang Chan1,*, Yin Sheng2, Zhang Qiu-chen2, Wang Cheng-tao1,2,*, Xu Bao-cai1,2

(1. Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University,
Beijing 100048, China; 2. Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University,
Beijing 100048, China)

Abstract: The influence of overexpression of glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) gene, g6pd, on xylitol biosynthesis in Candida tropicalis was investigated. The gene g6pd was cloned from Candida tropicalis CT16 and inserted into a yeast expression vector pYES-pgk, generating a recombinant expression vector pYES-pgk-g6pd, which was then introduced into C. tropicalis CT16 by the LiAc/ssDNA/PEG transformation method, resulting in over-expression of the g6pd gene. The fermentation results showed that the G6PDH activity was increased by 300%, and a maximum xylitol yield of 79.90 g/L was achieved in the recombinant strain SYG5 harboring pYES-pgk-g6pd after 62 h of fermentation. Compared to the wild type strain C. tropicalis CT16, the yield and productive rate of xylitol in strain SYG5 were increased by 11.30% and 44.91%, respectively. These results indicate that increasing the expression level of the gene g6pd significantly enhances xylitol production and that the G6PDH plays a key role in the biosynthesis pathway of xylitol in C. tropicalis.

Key words: Candida tropicalis; glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH); gene g6pd over-expression; xylose; xylitol

中图分类号：Q789 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0102-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407021

木糖醇是甜度最高的糖醇，其甜度相当于蔗糖，热量只有蔗糖的40%，并具有清凉感，因其具有防龋齿、洁齿、润喉、改善胃肠功能等特点，已广泛应用于口香糖、胶姆糖、太妃糖、软糖、巧克力、果冻、冷饮、口含片、漱口剂、润喉药物、止咳糖浆中；木糖醇代谢不需要胰岛素调节，不会导致人体血糖的剧烈变化，可作为糖尿病人的甜味剂；木糖醇可促进肝糖元合成，减少脂肪和肝组织中蛋白质消耗，具有改善肝功能和抗脂肪肝的作用，可作为肝炎、高血压、高血脂和年老体弱病人的专用输液剂。近年来，随着人们生活质量提高，木糖醇的健康功效越来越多被消费者所接受[1-3]。全球木糖醇年需求量10万t以上，我是世界木糖醇的主要生产和出口国，年产量占世界总产量约40%，我国木糖醇年需求量2.5万t以上。目前木糖醇主要通过化学合成制造，需使用有毒性的镍催化剂和高压氢气，要求原料木糖的纯度高，工艺复杂、安全性差、生产成本高、副产物成分复杂，环境污染严重，不符合节能减排、可持续发展的社会要求，成为目前国家严格限制发展的行业[4]。

已有研究发现，酵母菌可转化木糖生成木糖醇，该生化过程的原料木糖无需纯化制备，反应条件温和，无需耐高压设备，此“清洁”、“绿色”的生产技术成为近年研究热点[5-7]。木糖醇的生物合成与磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)紧密相连，需要木糖还原酶、还原性辅酶NADPH等参与（木糖＋NADPH

木糖还原酶

木糖醇＋NADP+），此还原反应是木糖醇能否顺利连续合成的关键步骤[8-10]，NADPH主要是通过PPP途径产生，当PPP途径受到破坏，木糖醇产量则明显降低[11]。关于增强PPP途径的代谢通量分配及NADPH的再生，改善PPP途径以提高木糖醇产率的研究已有一些报道[12-19]。Kang等[15]研究认为，以木糖为底物发酵时，PPP途径的多种酶活力远远高于以葡萄糖为底物时的情况。Choi等[16]研究认为，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose 6-phosphatedehydrogenase，G6PDH）是PPP途径中催化生成NADPH的关键性调控限速酶，因此，提高G6PDH的酶活力是增加NADPH供应量的有效手段之一。Kwon等[17]
将Saccharomyces cerevisiae的G6PDH编码基因ZWF1导入遗传改造后含外源木糖脱氢酶基因的酿酒酵母中，改造后重组菌株中G6PDH的酶活力提高了近6倍，发酵液中木糖醇浓度与只导入木糖脱氢酶基因的菌株相比，木糖醇产率提高了25%，表明导入编码G6PDH的基因能够显著提高木糖醇产率。热带假丝酵母（Candida tropicalis）也是目前木糖醇生产研究广泛应用的菌株[6-7,15-16]。
本实验以Candida tropicalis CT16为模式菌株，将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因G6PDH进行克隆、过量表达，构建高产稳定表达的木糖醇工程菌株，研究其对木糖醇合成代谢的影响，为木糖醇生物合成制造提供优良菌株和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C. tropicalis CT16 本实验室保存；Escherichia coli TOP10感受态细胞 天根生化科技（北京）有限公司；酵母表达载体pYES-pgk 本实验室构建保存。

酵母基因组提取试剂盒、酵母质粒提取试剂盒、抗生素G418 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker 北京全式金公司；EX Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶 日本TaKaRa公司；酵母提取物、胰蛋白胨和蛋白胨 英国Oxoid公司；木糖 山东福田科技集团；木糖醇（分析纯） 美国Sigma公司；NADP+、NADPH 半夏科技公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 培养基

Luria-Bertani （LB）培养基（g/L）：胰蛋白胨 10、酵母提取物5、NaCl 10；YPD （yeast extract peptone dextrose）培养基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10；木糖醇发酵培养基（g/L）：木糖100、葡萄糖10、蛋白胨 1、酵母提取物0.5。

1.3 引物设计

根据GenBank中报道的C. tropicalis葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd编码序列（Accession No. XM_002548907），利用DNAMAN软件设计引物。

g6pd基因扩增引物：F-g6pd：5’-gg ggt acc atg tct tat gat tca ttc gg-3’（酶切位点KpnⅠ）；R-g6pd：5’-gc tct aga tta gat ctt acc ttt gac at-3’（酶切位点XbaⅠ）。酵母转化子鉴定引物：F-T7：5’-CAG CTG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；
R-CYC1：5’-TATAATACCGGTGTTGGCCGATTCATTATT-3’。

1.4 g6pd基因的PCR扩增

以C. tropicalis CT16的基因组为模板，设计引物F-g6pd和R-g6pd进行PCR扩增。反应体系如下：Ex Taq聚合酶0.3μL、模板2μL、上下游引物（10mmol/L）各1μL、dNTP混合物（2.5mmol/L）2μL、10×Ex Taq Buffer 2.5μL、ddH2O补至25μL。扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1.5min，30个循环，72℃ 10min。凝胶电泳检测PCR产物。将纯化的PCR产物送至上海生工（生物）工程技术有限公司测序，DNAMAN软件和NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站在线BLAST程序（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列分析和同源性搜索比对。

1.5 表达载体pYES-pgk-g6pd的构建

表达载体pYES-pgk-g6pd的构建如图1所示。KpnⅠ和XbaⅠ分别对g6pd基因片段和pYES-pgk进行双酶切，纯化回收的酶切片断经T4 DNA Ligase于16℃连接过夜，连接产物转化E. coli TOP10感受态细胞，在添加抗生素G418的LB平板上筛选阳性重组子，37℃培养过夜，提取阳性菌落质粒鉴定。

图 1 表达载体pYES-pgk-g6pd的构建策略

Fig.1 Construction strategy of the expression vector pYES-pgk-g6pd

1.6 g6pd基因在C. tropicalis中的过量表达

利用LiAc/ssDNA/PEG方法将重组表达载体pYES-pgk-g6pd转化至C. tropicalis CT16感受态细胞中，在添加G418的YPD平板上筛选阳性重组子。提取重组子质粒，设计引物F-T7和R-CYC1进行PCR扩增，回收目的条带，酶切、测序鉴定重组子。C. tropicalis感受态细胞的制备及其转化方法参照文献[20]。

1.7 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的酶活力检测

取30h的发酵液，1100r/min、4℃离心20min，灭菌蒸馏水洗涤、重悬、再离心，菌体重悬于缓冲液体系：10mmol/L β-巯基乙醇、2mmol/L甘氨酸、0.071mol/L Tris-HCl（pH7.5），并加入玻璃珠（体积比1∶1）振荡破碎，离心取上清液（粗酶液）用于酶活力分析[13]。

反应体系（2.56mL）：2mL 70 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、0.4 mL 35 mmol/L MgCl2、20μL 131 mmol/L NADP+、40μL 500 mmol/L 6-磷酸-葡萄糖、0.1 mL粗酶液。30 ℃、340 nm测定NADPH吸收值变化。340 nm波长处每隔30s测定一次吸光度，反应10 min，以吸光度y与NADPH浓度x（mmol/L）作标准曲线。G6PDH酶活力定义：反应体系中每分钟还原1μL NADP+所需的酶量为1U。

1.8 发酵实验及木糖和木糖醇的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测

将C. tropicalis CT16野生型和重组菌株C. tropicalis SYG5 以3%的接种量分别接种到木糖醇发酵培养基，30 ℃、200r/min振荡培养，每隔10h取发酵液样品，8000r/min离心4 min，HPLC检测木糖及木糖醇浓度。HPLC（岛津LC-20A）检测条件为：色谱柱HPX-87H（300mm×7.8mm），示差折光检测器，柱温45 ℃，流动相0.5mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，进样量20μL。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd的PCR扩增

以C. tropicalis CT16基因组为模板，扩增目的基因片段，电泳、测序。如图2所示，得到的PCR产物单一DNA片段大小约为1.5kb，与预期相符。将纯化的PCR产物测序，经DNAMAN软件和NCBI比对，与GenBank中报道的C. tropicalis基因g6pd（Accession No. XM_002548907）相似度达100%，表明g6pd基因扩增正确。

M.DNA Marker D2000；1.g6pd基因PCR产物。

图 2 g6pd基因PCR产物电泳图

Fig.2 Electrophoresis of the PCR product of the g6pd gene

2.2 表达载体pYES-pgk-g6pd的构建

使用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定重组质粒，电泳检测如图3所示。重组质粒pYES-pgk-g6pd经双酶切得到6.0kb和1.5kb的清晰条带，与预期相符，证明表达载体构建正确。

M.DNA Marker Trans2k plus；1.pYES-pgk-g6pd双酶切产物；2.pYES-pgk双酶切产物。

图 3 KpnⅠ+XbaⅠ双酶切重组质粒pYES-pgk-g6pd电泳图

Fig.3 Electrophoresis of the plasmid pYES-pgk-g6pd double digested with KpnⅠ+ XbaⅠ

2.3 重组C. tropicalis的筛选、鉴定及酶活力分析

表达载体pYES-pgk-g6pd转入C. tropicalis CT16后，在含抗生素G418的YPD平板上进行筛选。从平板上挑取长势较好的单菌落，在含1mg/mL G418的培养基培养，筛选获得阳性转化子C. tropicalis SYG5。

提取C. tropicalis SYG5质粒，设计引物F-T7和R-CYC1-Age PCR扩增，电泳检测结果如图4所示。从转化子（工程菌）SYG5中扩增g6pd基因表达盒（包括启动子、g6pd基因编码序列和终止子）的特异性条带，大小约为1.9kb，与预期相符，且测序验证正确，表明重组质粒pYES-pgk-g6pd已转入C. tropicalis CT16。

分析30h发酵粗酶液的G6PDH酶活力，以吸光度y与NADPH浓度x（mmol/L）作标准曲线，获得方程y=0.0055x－0.0073（R2＝0.9999）。C. tropicalis CT16 G6PDH的酶活力为786 U/L，C. tropicalis SYG5的G6PDH酶活力为3145U/L，说明g6pd基因的过量表达能显著增强C. tropicalis G6PDH的活性。

M.DNA Marker D2000；1. g6pd 基因表达盒的PCR产物。

图 4 重组菌株C. tropicalis SYG5中g6pd基因表达盒的PCR产物电泳图

Fig.4 Electrophoresis of the PCR product of the g6pd gene expression cassette from the recombinant strain C. tropicalis SYG5

2.4 野生菌和工程菌转化木糖醇能力比较

将野生型菌C. tropicalis CT16和重组工程菌
C. tropicalis SYG5分别接种于木糖醇发酵培养液。如图5所示，在此实验条件下发酵液中木糖和木糖醇能较好的分离，且峰型较好，无前延、拖尾、重叠，其木糖和木糖醇的特征峰分别出现于11.354 min和13.161 min。

图 5 木糖和木糖醇的HPLC分析

Fig.5 HPLC analysis of xylose and xylitol

如图6所示，工程菌C. tropicalis SYG5的木糖醇生成量随发酵时间延长逐渐增多，摇瓶发酵62h时木糖醇质量浓度达到最高值79.90 g/L，木糖醇产率为1.29 g/（L•h）；
野生菌株CT16发酵80h时，木糖醇生成量达到峰值，约为71.08 g/L，产率为0.89 g/（L•h）。与野生型菌株相比，工程菌C. tropicalis SYG5的木糖醇产量提高12.41%，产率提高44.94%。发酵62h时，工程菌SYG5的木糖几乎完全消耗，木糖醇呈现最高质量浓度，随后木糖醇消耗，导致其质量浓度下降；野生菌C. tropicalis CT16发酵80h时木糖醇浓度才达到最大值，但其峰值明显低于工程菌SYG5。上述结果表明，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd的过量表达，可以显著提高C. tropicalis的PPP途径的G6PDH酶活力、代谢通量分配，增加NADPH供应量，加速木糖醇合成速率和产量，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在木糖醇生物合成过程中发挥关键性作用。

图 6 C. tropicalis CT16与C. tropicalis SYG5摇瓶发酵实验中的木糖和木糖醇质量浓度动态变化曲线

Fig.6 Dynamic curves of xylitol production and xylose consumption in C. tropicalis CT16 and C. tropicalis SYG5 during fermentation on xylose and glucose in shaking flasks

3 结 论

本实验构建了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶g6pd基因的重组表达载体pYES-pgk-g6pd，并将其过量表达于C. tropicalis CT16，探索g6pd基因过量表达对木糖醇合成代谢影响。结果表明，发酵62h时，携带重组质粒pYES-pgk-g6pd的工程菌C. Tropicalis SYG5摇瓶发酵木糖醇产量为79.90g/L，
与野生菌株相比，木糖醇产量提高12.41%，产率提高44.94%；g6pd基因的过量表达，增强了G6PDH的酶活力，提高了菌体NADPH供应量和还原力，显著促进木糖醇生物合成的代谢流量分配，提高了木糖醇产量和木糖产率。因此，G6PDH是木糖醇生物合成途径中的关键酶，构建的高产木糖醇工程菌为其产业化转化提供了重要基础。

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