南美白对虾酚氧化酶的提取及生化特性

吕艳芳，魏春娇，王 娇，马春颖，励建荣*

（渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心，
辽宁 锦州 121013）

摘 要：以南美白对虾为研究对象，分析以Tris-HCl为提取缓冲液，研究提取液浓度、提取液pH值、浸提时间对酚氧化酶活力的影响，以L9（33）正交试验方法优化酚氧化酶提取条件，然后对南美白对虾酚氧化酶生化特性进行研究。结果表明：提取液浓度为0.2mol/L、提取液pH值为8.0、浸提时间为20min条件下提取的酶具有最大的活力；以邻苯二酚为底物时，酚氧化酶最适pH值为8、最适温度为40℃，在该条件下酶促反应动力学符合米氏方程，米氏常数Km为0.717mol/L，Vmax为0.130 A/min。

关键词：南美白对虾；酚氧化酶；正交试验；提取；反应动力学

Extraction and Biochemical Characteristics of Phenoloxidase from Penaeus vannamei

LÜ Yan-fang, WEI Chun-jiao, WANG Jiao, MA Chun-ying, LI Jian-rong*

(Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, Engineering and Technology Research Center of Food Preservation, Processing and Safety Control of Liaoning Province, College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety,
Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Abstract: The extraction of phenoloxidase from Penaeus vannamei with Tris-HCl buffer as a function of three experimental parameters including extractant concentration, pH and extraction time was optimized using an L9 (33) orthogonal array design. The extracted enzyme was characterized. The highest phenoloxidase activity was obtained after 20 min of extraction with 0.2 mol/L Tris-HCl buffer at pH 8.0. This enzyme exhibited an optimal pH of 8 and temperature of 40 ℃ for catalyzing the oxidation of pyrocatechol as a substrate. Kinetic studies obeyed the Michaelis-Menten equation. The Km and Vmax were calculated to be 0.717 mol/L and 0.130 A/min, respectively.

Key words: Penaeus vannamei; phenoloxidase; orthogonal array design; extraction; kinetics

中图分类号：Q554 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0113-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407023

对虾蛋白质含量高，口味鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱，大部分的营养食谱已将其确定为合理膳食中不可缺少的一部分。虾体内含有酚氧化酶（phenoloxidase，PO），这是一种含有铜离子的金属酶，在活虾中该酶以酶原的形式存在，不具有催化活性，当虾死后，外来的一些微生物进入体内，体内的各种酶组分平衡被打破，酚氧化酶酶原被激活，催化体内的酪氨酸转化为黑色素类物质，因而虾死后迅速变黑[1-2]。而且虾体内的酚氧化酶在冷藏、冰藏过程中仍具有活性[3]，所以在贮藏过程中也很容易黑变。冷冻后解冻的对虾更容易黑变，主要是因为冻融过程使血细胞和消化腺里活性较低的酚氧化酶被释放出来，遇到合适的底物、有氧存在的条件下迅速形成黑色素[4]。对虾黑色素虽然对人体无害[5]，但对虾黑变后，易造成其营养成分流失，营养价值降低，影响销售价格。目前，一般使用焦亚硫酸钠处理对虾防止其黑变，但是焦亚硫酸钠处理的虾类产品中二氧化硫严重超标[6-7]，对人健康造成危害，随着人们食品安全意识的提高，使用安全无毒的抑制剂的要求越来越强烈。许多天然抑制剂，如抗坏血酸、植酸等对酚氧化酶都具有抑制作用[8]；Nirmal等[9]
将儿茶素和阿魏酸用于凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）黑变的抑制，二者对虾的黑变均具有一定的抑制效果；Encarnacion等[10]将金针菇(Flammulina velutipes)提取物作用于斑节对虾（Penaeus monodon)和凡纳滨对虾，发现其可以抑制虾的黑变。

已有研究发现，不同种属的甲壳类水生动物酚氧化酶的生化特性有一定的区别。以L-多巴（L-3,4-二羟基苯丙氨酸）为底物时，粉红对虾（Penaeus duorarum)在pH值为8.0～9.0时酶活力达到最大值[11]，中国对虾（Penaeus chinensis）的最适pH值为6.0左右，最适温度为40℃[12]，日本对虾（Penaeus japonicus）的最适pH值为6.5，最适温度35℃[13]。所以在使用抑制剂时，各种对虾的用量有所不同。本实验选用辽宁渤海的南美白对虾为研究材料，对其酚氧化酶的提取工艺进行优化；以邻苯二酚为底物，对其部分生化特性进行研究，为南美白对虾的研究、开发和使用新型防黑变保鲜剂研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活南美白对虾购于锦州市海鲜市场，清洗后，于－20℃冰贮藏备用。邻苯二酚BR级、L-脯氨酸BR级 北京中生瑞泰科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸等化学试剂均为分析纯 天津市化学试剂三厂。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Thermo Scientific高速冷冻离心机 美国热电子公司；DK8D型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；RL602-L电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚氧化酶作用邻苯二酚生成产物最大吸收波长的测定

实验以邻苯二酚为底物，采用分光光度法测定酚氧化酶的活性[14]。具体操作：在离心管内加入4.4mL、0.2mol/L
的Tris-HCl（pH8）缓冲溶液，0.4mL、0.5mol/L的L-脯氨酸溶液，0.4mL、0.5mol/L邻苯二酚，和0.8mL粗酶液混合，盖上离心管盖放37℃的水浴锅中预热10 min后，取出立即放入冰中，终止反应，倒入比色皿中，用紫外分光光度计在260～700nm波长范围内每隔2nm进行扫描，确定PO作用产物的最大吸收波长（λmax）。

1.3.2 酚氧化酶酶活力测定

PO活力的测定，将离心管依次加入4.4 mL、0.2mol/L
的Tris-HCl（pH8）缓冲溶液，0.4 mL、0.5 mol/L的L-脯氨酸，0.4 mL、0.5 mol/L邻苯二酚，置于37 ℃恒温水浴5 min，然后加入预先37 ℃预热2 min的粗酶液0.8 mL，该混合液作为酶反应体系，立即将该混合液置于比色皿中，选择紫外-可见分光光度计动力学模块，在产物的最大吸收波长（λmax）下测定反应液的吸光度，每隔10s记录1次吸光度，一共测定10 min，并计算PO活力，选取反应体系吸光度A直线上升区间数据计算酶活，由于此阶段属于酶促反应的初速率阶段。

酶活力以酶反应的初速率表示，以在产物最大吸收波长（λmax）每分钟增加0.001定义为一个酶活力单位，即单位体积酶液在单位时间使酶反应体系在525nm波长处吸光度增加0.001定义为1个酶活力单位[15-16]，
用A/（min•mL）表示。

（1）

式中：ΔA为吸光度变化量；t为反应时间/min；V为反应体系中加入的酶液体积/mL。

酶促反应速率（V）以单位时间内A的吸光度的增加量表示。

（2）

1.3.3 Tris-HCl提取酚氧化酶条件优化

参考相关文献[17-19]对南美白对虾PO提取方法进行优化。将冻藏于－20 ℃的对虾置于4 ℃条件下解冻，冰浴下剪碎研磨成肉糜，称取5g加入20mL Tris-HCl提取缓冲液（质量体积比1∶4），静置于4 ℃条件下进行浸提，然后高速冷冻离心，4 ℃、12000r/min条件下冷冻离心30 min，取其上清液即为PO粗酶液。对提取缓冲液的浓度、pH值、浸提时间3个因素进行研究，确定其最适范围。

1.3.3.1 单因素试验

以Tris-HCl提取缓冲液浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L）、提取液pH值（5、6、7、8、9）、浸提时间（20、40、60、80、100、120 min）为单因素，在其他条件一定的前提下，进行单因素试验，以确定正交试验的因素水平。

1.3.3.2 正交试验

根据单因素试验所确定的提取液浓度、提取液pH值、浸提时间进行L9（33）正交试验，通过正交试验确定PO的最佳提取条件。

1.3.4 硫酸铵分级沉淀酚氧化酶

采用硫酸铵分级沉淀法对1.3.3.2节正交试验所得粗酶液进行初步纯化浓缩，所有操作都在4 ℃条件下进行。取PO粗提液20 mL，边缓慢搅拌边加入固体硫酸铵，使饱和度达到10%，静置30 min，12000r/min离心30 min，收集沉淀，将沉淀用去离子水溶解，透析，再冻干浓缩后置于－20 ℃冰箱中备用。重复上述步骤，分别进行饱和度为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的硫酸铵沉淀。

用10 mL、0.2mol/L 的Tris-HCl（pH8）缓冲液溶解以上各饱和度硫酸铵沉淀纯化所得的酶蛋白，然后测其酶活力。选择出沉淀PO的硫酸铵饱和度，以下实验所用PO均用此饱和度硫酸铵沉淀后再冻干浓缩，溶解备用。

1.3.5 酚氧化酶最适pH值的测定

以不同pH值（6.2、6.8、7.4、8.0、8.6、9.2、9.8）的Tris-HCl缓冲液作为反应环境，酚氧化酶液用1.3.4节纯化后的酶液，然后操作参考1.3.2节，测定酚氧化酶酶活力以确定最适pH值。

1.3.6 酚氧化酶最适温度的测定

以pH8.0的Tris-HCl缓冲液作为反应环境，加入0.4 mL、0.5 mol/L L-脯氨酸，0.4 mL、0.5 mol/L邻苯二酚，然后加入0.8 mL纯化后的酶液，该混合液作为酶反应体系，分别将反应体系置于10、20、30、40、50、60、70 ℃下反应10 min，取出立即放入冰中，终止反应，然后立即在产物最大吸收波长(λmax)下测定反应液的吸光度，并计算PO活力。

1.3.7 底物浓度与反应速率的关系及酶促动力学常数Km值测定

在酚氧化酶最适温度和最适pH值条件下，测定不同底物浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L的邻苯二酚溶液）条件下PO的反应速率，然后采用Lineweaver-Burk 作图法计算出学Km、Vmax值。操作步骤参考1.3.6节。

2 结果与分析

2.1 酚氧化酶作用生成产物的最大吸收波长

图 1 酚氧化酶与邻苯二酚作用生成产物的最大吸收波长

Fig.1 Maximum absorption wavelength of the reaction product between phenoloxidase and catechol

由图1可知，以邻苯二酚为底物，反应体系中有两个吸收峰，在525nm有一个很宽的吸收峰，289nm有一个细窄的吸收峰。525nm的吸收峰与郑丹等[14]研究三疣梭子蟹酚氧化酶生化特性时选择的吸收波长相近，这个可能是PO氧化邻苯二酚产生的产物醌类物质。289nm的吸收峰，可能是在525nm波长处的产物进一步的反应或与渗透到提取液中的氨基酸发生反应生成了另外一种物质，或者是未参与反应的底物邻苯二酚。由此可以确定酶作用生成产物的最大吸收波长为525nm。所以本实验选取525nm为本实验反应产物的吸收峰值。

2.2 提取液浓度对酚氧化酶酶活力的影响

图 2 提取液浓度对酚氧化酶活性的影响

Fig.2 Effect of Tris-HCl concentration on PO activity

Tris-HCl在提取过程中主要作用是溶解细胞膜，使蛋白质溶解于溶液中。由图2可以看出，在Tris-HCl的浓度为0.05～0.20mol/L的范围内，随着提取液浓度的增加，所提酶液活力不断增加，当浓度为0.20mol/L时提取的酶液活力最高；提取液浓度再逐渐增加时，所提酶液活性逐渐减小，可能是浓度进一步提高时，离子的水合作用，降低了蛋白质的溶解度。所以Tris-HCl提取液浓度选择0.20mol/L较好。

2.3 提取液pH值对酚氧化酶酶活力的影响

图 3 提取液pH值对酚氧化酶活性的影响

Fig.3 Effect of Tris-HCl pH on PO activity

由图3可以看出，当提取液pH值由5.0逐渐增到8.0时，所提取酶液酶活力随pH值的增大而升高，可能是在低酸环境下蛋白质的结构发生了改变，同时破坏了蛋白质分子间的部分氢键，从而促使杂蛋白质分离，增加杂蛋白的沉淀，而酶蛋白溶解于溶液中，因此酶活性较强。但当pH值继续升高时，所提酶液酶活力逐渐降低，可能是过强的碱性环境，会使酶蛋白质变性和水解，使酶活力降低。所以酶蛋白的提取液pH值应在8.0左右。

2.4 浸提时间对酚氧化酶活性影响

如图4所示，浸提时间为20 min时，所提酶液酶活力最高，随着提取时间的增加，所提酶液酶活力逐渐降低，可能是因为Tris-HCl这种提取液本身具有很好的溶解细胞膜的作用，提取过程中很快将细胞中的蛋白质溶解出来，但当提取时间过长有可能出现部分蛋白质凝聚沉淀。为了保证细胞中的酶蛋白质全部溶解出来，浸提时间也不应太短，所以选择酶蛋白浸提时间为30 min。

图 4 浸提时间对酚氧化酶活性的影响

Fig.4 Effect of extraction time on PO activity

2.5 正交试验结果

表 1 正交试验设计及结果

Table 1 Design and results of orthogonal array experiments

由表1可知，3个因素对PO提取的影响顺序是B＞C＞
A，由k值和极差值R可知，提取液pH值对所提的PO酶活性影响最大。选用Tris-HCl提取对虾PO时，提取的最佳条件为A2B2C1，即Tris-HCl提取液浓度0.2mol/L、pH8.0、浸提时间20 min的条件下，提取的PO酶活性最大。重复3次平行实验验定此条件下的酶活力为46.80、47.08、47.65
（A/（min•mL）），平均为47.18（A/（min•mL））。

2.6 硫酸铵逐级沉淀酚氧化酶结果

图 5 硫酸铵分级沉淀后的PO酶活力

Fig.5 PO activities of ammonium sulfate fractions with different saturation degrees

用饱和度为10%～80%的硫酸铵对南美白对虾粗酶液进行分级沉淀，其目的是有效地将酶蛋白和其他杂蛋白分离开，使南美白对虾粗酶液达到初步的分离纯化。由图5可以看出，酚氧化酶的粗酶液经硫酸铵沉淀，酶活力集中在30%～50%，当硫酸铵饱和度为40%时，酶活性较高，这与Nirmal等[20]实验中选用沉淀对虾酚氧化酶的硫酸铵饱和度相一致。因此后续实验所用PO酶均用40%硫酸铵沉淀后再冻干浓缩，溶解后使用。

2.7 反应温度对酚氧化酶活性的影响

图 6 反应温度对酚氧化酶活性的影响

Fig.6 Effect of reaction temperature on PO activity

在一定的条件下，生物酶促反应存在一个最适温度，由图6可以看出，对虾PO在反应温度为40 ℃时活性最高；在20～70 ℃温度范围内，反应温度从20～40 ℃期间，酶活力逐渐上升，40 ℃最高，随后酶活力随温度的升高开始降低。温度对酶活性有双重影响，一方面，温度升高加快酶催化反应速度；另一方面，当温度升高到一定程度促使酶蛋白质热变性、失活，所以酶促反应速率降低。因此，在对虾贮藏过程中，采用冷藏方法可以抑制酚氧化酶的部分活力，对防止虾的黑变有一定的作用。

2.8 反应体系pH值对酚氧化酶活性的影响

图 7 酚氧化酶最适pH

Fig.7 Optimum pH of PO

由图7可以看出，对虾酚氧化酶对pH值非常敏感，在此反应条件下其最适pH值是8.0。酶活力在pH值为 6.2～8.0区间不断上升，pH值8时酶活力最高；然后随着反应体系pH值的升高，酶活力开始下降，在pH值为9.2时酶活力出现升高，但仍然低于pH8时的酶活力；pH值继续升高，酶活力继续降低。这可能是由于在pH值较低的酸性环境中，酶中铜离子因被解离而失活；在pH值较高的碱性环境中，铜与酶蛋白脱离，成为不溶性氢氧化铜，也会使酶失活[21]。因此，在对虾贮藏中，控制pH值在一定范围内可以抑制对虾酚氧化酶的活性，对防止虾的黑变有一定的作用。

2.9 底物浓度与酚氧化酶活力的关系

图 8 底物浓度与酚氧化酶反应速度率的关系

Fig.8 Relationship between catechol concentration and PO reaction rate

从图8可以看出，底物邻苯二酚溶液的浓度对酚氧化酶反应速率有直接影响，底物浓度较低时，产物生成的速率随着底物浓度的增大而呈直线上升趋势，符合一级反应和混合级反应曲线，直到反应速率达到最大值，底物浓度继续增加，反应速率变化不明显，符合反应进入零级反应，说明所有的酶蛋白已被底物饱和，进一步提高底物浓度也不能提高酶促反应速率。由此可见，底物浓度与酶促反应速度关系完全遵循米氏方程（Michaelis-Menten）的酶动力学性质。

2.10 米氏常数Km及最大反应速率Vmax

图 9 酚氧化酶的Lineweaver-Burk图

Fig.9 Lineweaver-Burk plot of PO

在最适温度40 ℃、最适pH8.0的条件下测定酚氧化酶的动力学常数，以Lineweaver-Burk双倒数法得到图9，计算得到PO的动力学参数，Km为0.717mol/L，Vmax为0.130 A/min。

3 结 论

不同种对虾的酚氧化酶的生化特性存在一定的差异，本实验研究了辽宁锦州渤海养殖南美白对虾的酚氧化酶的提取及生化特性，为对虾的研究及抑制剂使用提供参考。在4 ℃条件下，采用Tris-HCl提取液提取南美白对虾PO时，提取缓冲液浓度为0.2mol/L、pH8.0、浸提时间为20 min的条件下提取的酶活性最大。以邻苯二酚为底物，南美白对虾PO的最适温度为40 ℃、最适pH值为8；在南美白对虾PO的最适条件下，可得出南美白对虾PO米氏方程的参数：Km为0.717mol/L，Vmax为0.130 A/min。

参考文献：

[1] MONTERO P, AVALOS A, PEREZ-MATEOS M. Characterization of polyphenoloxidase of prawns (Penaeus japonicus). Alternatives to inhibition: additives and high-pressure treatment[J]. Food Chemistry, 2001, 75 (3): 317-324.

[2] 须山三千三, 鸿巢章二. 水产食品学[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1992: 69-70.

[3] MARTINEZ-ALVAREZ O, LOPEZ-CABALLERO M E, MONTERO P, et al. Spraying of 4-hexylresorcinol based formulations to prevent enzymatic browning in Norway lobsters (Nephrops norvegicus) during chilled storage[J]. Food Chemistry, 2007, 100(1): 147-155.

[4] DIAZ-TENORIO L M, GARCIA-CARRENO F L, PACHECO-AGUILAR R . Comparison of freezing and thawing treatments on muscle properties of whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei)[J]. Journal of Food Biochemistry, 2007, 31(5): 563-576.

[5] MONTERO P, LOPEZ-CABALLERO M E, PEREZ-MATEOS M. The effect of inhibitors and high pressure treatment to prevent melanosis and microbialgrowth on chilled prawns (Penaeus japonicus)[J]. Journal of Food Science, 2001, 66: 1201-1206.

[6] LU Shengmin . Effects of bactericides and modified atmosphere packaging on shelf-life of Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis)[J]. LWT-Food Science and Technology, 2009, 42 (1): 286-291.

[7] NIRMAL N P, BENJAKUL S. Effect of ferulic acid on inhibition of polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during iced storage[J]. Food Chemistry, 2009, 116(1): 323-331.

[8] 蔡燕萍, 张建友. 虾体多酚氧化酶特性及其抑制技术研究进展[J]. 食品工业科技技, 2012, 33(13): 424-428.

[9] NIRMAL N P, BENJAKUL S. Effect of catechin and ferulic acid on melanosis and quality of Pacific white shrimp subjected to freeze-thawing prior refrigerated storage[J]. Food Control, 2010, 21(9): 1263-1271.

[10] ENCAMACION A B, FAGUTAO F, JINTASATAPORN O, et al. Application of ergothioneine-rich extract from an edible mushroom Flammulina velutipes for melanosis prevention in shrimp, Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei[J]. Food Research International, 2012, 45: 232-237.

[11] SIMPSON B K, MARSHALL M R, STEVEN O W. Phenoloxidases from pink and white shrimp: kinetic and other properties[J]. Food Biochemistry, 1988, 12(3): 205-218.

[12] 汪小锋, 樊廷俊. 中国对虾酚氧化酶的部分生物化学特性的初步研究[J]. 海洋科学, 2003, 27(4): 71-75.

[13] SOOTTAWAT B, WONNOP V, MUNEHIKO T. Properties of phenoloxidase isolated from the cephalothorax of kuruma prawn (Penaeus japonicus)[J]. Food Biochemistry, 2005, 29(5): 470-485.

[14] 郑丹, 段青源, 朱励华, 等. 三疣梭子蟹酚氧化酶的生化特性研究[J]. 食品科学, 2010, 31(1): 172-176.

[15] CONG Rishan, SUN Wenjie, LIU Guangxing, et al. Purification and characterization of phenoloxidase from clam Ruditapes philippinarum[J]. Fish and Shellfish Immunology, 2005, 18(1): 61-70.

[16] 任佩, 王莹, 金玉兰, 等. 章鱼消化道蛋白酶的分离纯化及性质[J]. 食品科学, 2012, 33(7): 168-171.

[17] 吴亮亮, 杨会成, 廖妙飞, 等. 不同对虾中多酚氧化酶的提取比较及在虾体的分布研究[J]. 食品工业科技, 2012, 33(7): 55-57.

[18] 陈康玉, 彭珩, 何翠萍, 等. 南美白对虾虾头内源酶的分离纯化[J]. 现代食品科技, 2010, 26 (6): 573-576.

[19] 郑斌, 郝云彬, 杨会成, 等. 中华管鞭虾多酚氧化酶生化特性研究[J]. 浙江海洋学院学报: 自然科学版, 2010, 29(6): 526-530.

[20] NIRMAL N P, BENJAKUL S. Inhibition kinetics of catechin and ferulic acid on polyphenoloxidase from cephalothorax of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei)[J]. Food Chemistry, 2012, 131: 569-573.

[21] 陈丽娇, 郑明峰, 李怡宾. 南美白对虾多酚氧化酶的生化特性[J]. 福建农林大学学报: 自然科学版, 2004, 3(9): 377-380.