耐超高压胁迫副溶血性弧菌的逆境耐受性

黄小鸣1，童 钰1，马君妍1，祝凯丽1，周杨武1，陆海霞1,*，励建荣2

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州 310035；

2.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁 锦州 121013）

摘 要：目的：探讨水产品中耐超高压胁迫的副溶血性弧菌对高压及其他逆境环境的耐受性。方法：以80～250MPa超高压处理原始敏感菌株（Vibrio. parahaemolyticus ZJGSMC001），筛选得到耐高压菌株
（V. parahaemolyticus ZJGSPR001），以其他逆境处理，分析二者对高压和其他逆境的耐受性差异。结果：以250MPa压力胁迫处理，耐压菌株存活量比原始菌株高2（lg（CFU/mL））。3 ℃以下原始菌株生长速率为负值，45 ℃以上原始菌株不能存活，耐压菌株则生长良好，1 ℃和48 ℃时仍可存活。在NaCl质量浓度高达11.5 g/100 mL时，原始菌株为负生长，耐压菌株仍能生长。耐压菌株对有机溶剂和有机酸的耐受性增强，其中乙醇体积分数12%、丙酮体积分数9%、甲苯体积分数0.75%、柠檬酸3 mg/mL和乳酸体积分数1.5%时，原始菌株全部致死，耐压菌株仍存活。结论：原始菌株对压力较敏感，而耐压菌株经超高压胁迫处理后，除对高压的耐受能力提高外，对其他逆境（如温度、氯化钠、有机溶剂、有机酸）的耐受性也有所增强。

关键词：副溶血性弧菌；耐压菌株；逆境

Susceptibility of Pressure-Resistant Vibrio parahaemolyticus to Various Environmental Stresses

HUANG Xiao-ming1, TONG Yu1, MA Jun-yan1, ZHU Kai-li1, ZHOU Yang-wu1, LU Hai-xia1,*, LI Jian-rong2

(1. Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China; 2. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Abstract: Objective: The objective of this study was to observe the susceptibility of Vibrio parahaemolyticus to various environment stresses as influenced by high hydrostatic pressure treatments. Methods: A pressure-sensitive strain of
V. parahaemolyticus (ZJGSMC001) isolated from seafoods was repeatedly treated with high hydrostatic pressures ranging from 80 to 250 MPa, and the surviving cells were selected as pressure-resistant strains (ZJGSPR001). The tolerance of
V. parahaemolyticus to subsequent adverse conditions was investigated in the pressure-sensitive strains as well as the pressure-resistant strains. Results: When exposed to a pressure of 250 MPa, the survival of pressure-resistant strains was 2 (lg (CFU/mL))
higher than that of pressure-sensitive strains. When exposed to low temperature (1 ℃) and high temperature (45 ℃), pressure-sensitive strains could not survive, while the pressure-resistant ones grew well and still survive at 1 ℃or 48 ℃. Pressure-sensitive strains could not grow at high salt concentration such as 11.5 g/100mL NaCl. However, pressure-resistant bacteria could survive and grow well. Pressure-resistant strains were more resistant to organic solvent and organic acids compared to the pressure-sensitive ones. When exposed to alcohol (12%), acetone (9%), toluene (0.75%), citric acid (3 mg/mL)
and lactic acid (1.5%), the pressure-sensitive bacteria were totally dead, while the pressure-resistant cells remained alive. Conclusion: The pressure-resistant V. parahaemolyticus is more tolerant to environment stresses such as temperature, NaCl solution, organic solvent and organic acids than the pressure-sensitive strains.

Key words: Vibrio parahaemolyticus; pressure-resistant bacteria; environmental stresses

中图分类号：Q93-3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0164-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407033

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VPH）是夏秋季沿海地区引发食物中毒的首要病原菌[1]。1950年，VPH首次在日本大阪引起食物中毒并暴发流行。副溶血弧菌主要通过烹饪不当的海产品、盐腌制品或生熟不分所传播，并引起食物中毒，还可引起浅表创伤感染、败血症等。副溶血弧菌的感染临床症状为腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症 。

随着食品消费市场需求的提高，人们越来越热衷于制品的卫生安全性、无添加剂性、营养功能性、方便性、耐藏性及其色泽、风味和外观[2-4]，超高压杀菌技术的出现正满足了人们的需要。副溶血弧菌属于耐压性较弱的细菌，但在研究中发现有些副溶血性弧菌对超高压有一定的耐受性[5]，在250 MPa以下超高压处理之后少量细胞仍保持生命活力，而250 MPa以上压力处理会对贝类等鲜活水产品的品质造成不利影响。

研究发现，在微生物受到亚致死剂量的预适应处理后会发生应激反应[6]。不同的菌种，预适应处理的差异、致死剂量的差异和生长阶段的差异都会产生不同的应激反应[7]。

为采取更有效的措施杀灭水产品中的副溶血性弧菌，尤其是能够耐受逆境环境如高压环境而存活下来的副溶血性弧菌，控制海产品中副溶血性弧菌的污染率，本实验研究了副溶血弧菌原始菌株及其耐压菌株对温度、pH值、NaCl、有机溶剂（乙醇、丙酮、正丁醇、甲苯）、有机酸（柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸）这些逆境环境的耐受性，以期通过在生产运输的过程适当改变储藏条件来彻底杀灭水产品中的副溶血弧菌，为有效杀灭水产品中耐超高压致病菌提供思路，为超高压技术在水产品保鲜杀菌和改善水产品品质中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，ZJ GSMC001）由浙江工商大学食品与生物工程学院提供，分离自水产品；氯化钠胰蛋白胨大豆（TSA）琼脂培养基和3 g/100 mL氯化钠碱性蛋白胨水（APW）培养基 杭州微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PB.A2-600/0.6超高压生物处理机 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；MIR-554低温恒温培养箱 日本Sanyo公司；3-30K台式高速离心机 德国Sigma公司；M200多功能酶标仪 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 耐压菌的筛选

将活化好的副溶血弧菌5000×g离心10min，弃上清液，以无菌生理盐水将菌悬液浓度调整至108 CFU/mL，分装于50mL的无菌蒸煮袋中，热封口。

采用80～250 MPa由低到高的超高压多次处理副溶血性弧菌的方式来获得可以耐受超高压胁迫的副溶血弧菌菌株。压力处理程序为80、100、120、150、180、200、200、200、200、250、250、250 MPa的压力依次处理15min，对处理后的菌液进行分离培养，从中分离得到最终存活下来的菌株。然后再对原始菌株和分离得到的菌株以0～500 MPa压力分别处理15min，若分离得到的菌株存活率远远高于原始菌株，即视其为耐高压胁迫菌株。

1.3.2 副溶血弧菌与耐压菌株耐受性差异研究[8]

1.3.2.1 温度耐受性差异

将副溶血性弧菌和耐压菌株接种于液体培养基中，200 r/min摇床培养12h后，分别置于－1、1、2、3、4、5 ℃的低温恒温培养箱中培养，以及44、45、46、47、48、49 ℃的摇床中200 r/min培养24h，随后进行平板计数，并计算生长速率。

1.3.2.2 NaCl耐受性差异

将副溶血弧菌和耐压菌株接种于液体培养基中，200 r/min摇床培养12h后，分别置于NaCl质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 mL，以及10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5 g/100 mL的液体培养基中，200 r/min摇床中培养24h，随后进行平板计数，并计算生长速率。

1.3.2.3 pH值耐受性差异

将副溶血弧菌和耐压菌株接种于液体培养基中，200 r/min摇床培养12h后，调整液体培养基pH值至3.1、3.4、3.7、4.0、4.3、4.6、10.6、11.0、11.4、11.8、12.2、12.6，将副溶血弧菌和耐压菌株分别置于200 r/min摇床中培养24h，随后进行平板计数，并计算生长速率。

1.3.2.4 有机溶剂耐受性差异

将副溶血弧菌和耐压菌株分别接种于液体培养基中，200 r/min摇床培养12h后，分别加入不等量的有机溶剂至不同的终体积分数（乙醇6%、8%、10%、12%、14%；丙酮6%、7%、8%、9%、10%；正丁醇0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%；甲苯0.05%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%），再次摇床培养2h后平板计数测定菌落数。

1.3.2.5 有机酸耐受性差异

将副溶血弧菌和耐压菌株分别接种于液体培养基中，200 r/min摇床培养12h后，分别加入不等量的有机酸至不同的终质量浓度或体积分数（柠檬酸0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL；苹果酸0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL；
酒石酸0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL；乳酸体积分数0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%），再次摇床培养2h后平板计数测定菌落数。

1.3.3 微生物数量的测定

按GB4789.2—2010《食品微生物检验国家标准》和GB/T4789.7—2008《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌的检验》，采用平板倾注计数法进行菌落总数的测定。以无菌生理盐水适当稀释超高压处理后和未处理作为对照的供试菌悬液，于质量浓度为3 g/100 mL氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板37 ℃恒温培养48h后，进行菌落计数。

生长速率＝

n－n0

n0

式中：n为摇床培养24h之后的菌落总数（lg（CFU/mL））；
n0为初始（0h）的菌落总数（lg（CFU/mL））。

1.4 数据分析

实验数据为3次平行测定值的平均值，数据统计采用SPSS7.0软件进行ANOVA单因素方差分析，采用Origin8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 耐压菌的筛选和压力耐受性检测

经80～250 MPa反复处理最终分离获得的耐压菌株经250 MPa的压力胁迫处理存活率较原始菌株大大提高。耐压菌株和原始菌株均参照GB/T4789.7—2008《食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》经生理生化鉴定为副溶血性弧菌，结果如表1所示。

表 1 原始菌株和耐压菌株生化鉴定结果

Table 1 Biochemical appraisal results of pressure-sensitive and pressure-resistant strains

注：＋.阳性；—. 阴性。

图 1 原始副溶血性弧菌与耐压菌株的超高压耐受性

Fig.1 Ultra-high pressure tolerance of pressure-sensitive and pressure-resistant Vibrio parahaemolyticus

如图1所示，未经高压处理的副溶血性弧菌原始菌株的菌落总数为9.2（lg（CFU/mL）），经100、200、250 MPa高压处理后菌落总数分别降至8.8、8.2、4.4
（lg（CFU/mL））。经300 MPa及以上的压力处理，副溶血性弧菌原始菌株全部致死。说明副溶血弧菌原始菌株所能耐受的最高压力250 MPa。耐压菌株的菌落总数为8.8 （lg（CFU/mL）），经100、200、250 MPa高压处理后菌落总数分别降至8.6、8.0、6.3（lg（CFU/mL））。经250 MPa的压力处理后，耐压菌的存活数量较原始菌株提高了2（lg（CFU/mL）），说明该分离得到的菌株比原始菌株对超高压有更强的耐受性。

2.2 原始菌株与耐压菌株温度耐受性差异分析

A.低温；B.高温；0h.初始菌落总数。

图 2 原始副溶血弧菌与耐压菌株的温度耐受性

Fig.2 Temperature tolerance of pressure-sensitive and pressure-resistant Vibrio parahaemolyticus

由图2可知，经－1、1、2、3、4、5 ℃培养24 h后，原始菌株的生长速率分别为－0.04、－0.03、
－0.03、－0.02、－0.01、－0.01，耐压菌株的生长速率分别为－0.02、0.01、0.03、0.04、0.06、0.07，比较可知，原始菌株在4 ℃以下低温都处于负生长，而耐压菌株在1 ℃时仍有存活，并且在3、4、5 ℃生长良好，说明耐压菌株比原始菌株对低温更具耐受性（图2A）。经44、45、46、47、48、49 ℃培养24 h后，原始菌株的生长速率分别为0.14、0.09、－0.24、－0.41、－0.58、
－0.79，耐压菌株的生长速率分别为0.13、0.13、0.12、－0.01、－0.01、－0.04，原始菌株在46 ℃以上生长速率为负值，说明原始菌株在46 ℃以上高温不能生长，而耐压菌株在46 ℃生长良好，47、48 ℃的生长速率接近0，说明其在48 ℃仍能存活，故耐压菌株比原始菌株更能耐受高温胁迫（图2B）。

从实验结果可以得到，耐压菌株不仅对压力有很好的耐受性，对低温和高温的耐受性也增强。Huang Weishen等[9]研究了耐高浓度氯化钠的副溶血性弧菌，在高温、胆盐、乙酸等逆境胁迫下，与原始菌株相比有更好的耐受性，与本实验得到的结果一致。

V. parahaemolyticus属于低温敏感型细菌，在低温贮藏过程中可培养细胞数逐渐下降[10-12]，本实验结果也表明，在生产实践中，为有效减少水产品中的副溶血弧菌，可以选择1 ℃以下的温度贮存海产品。在烹饪过程中，也可采取48 ℃以上的温度短时间处理水产品，并结合超高压处理工艺，不仅保留了水产品的原始风味，也能保证水产品的卫生安全。

2.3 原始菌株与耐压菌株氯化钠耐受性差异分析

A.低质量浓度NaCl；B.高质量浓度NaCl；0h.初始菌落总数。

图 3 原始副溶血弧菌与耐压菌株的氯化钠耐受性

Fig.3 NaCl tolerance of pressure-sensitive and pressure-resistant Vibrio parahaemolyticus

由图3可知，经0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 mL的NaCl培养2 4 h 后，原始菌株的生长速率分别为－0.30、0.02、0.12、0.13、0.16、0.17，耐压菌株的生长速率分别为－0.38、0.03、0.13、0.14、0.17、0.18。NaCl质量浓度为0.2 g/100 mL时，原始菌株的生长速率大于0，而耐压菌株为负生长，说明在该体积分数下，原始菌株比耐压菌株耐受性强。而当NaCl质量浓度在0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 mL时，耐压菌株的生长速率均比原始菌株大，说明在这些质量浓度下耐压菌株的耐受性大于原始菌株（图3A）。经10、10.5、11、11.5、12、12.5 g/100 mL的NaCl培养24 h后，原始菌株的生长速率分别为0.17、0.11、－0.10、－0.27、－0.57、－0.78，耐压菌株的生长速率分别为0.08、0.01、0.01、－0.01、
－0.36、－0.28，NaCl质量浓度为11 g/100 mL时，原始菌株几乎全部死亡，而耐压菌株仍有部分存活，故耐压菌株的高质量浓度NaCl耐受性较原始菌株更强（图3B）。

从实验结果可以得到，NaCl质量浓度为0.2 g/100 mL时，耐压菌株的耐受性比原始菌株弱，但是当质量浓度为0.3 g/100 mL以上时，耐压菌株的耐受性比原始菌株强。而高质量浓度NaCl时耐压菌株比原始菌株耐受性更强。由于耐压菌在不断的压力环境下，细胞的生理或构成上发生改变，使细菌达到与环境相适应，从而对其他的逆境环境耐受性也增强。Chiang等[13]研究了热胁迫下的副溶血弧菌对低质量浓度NaCl 0.1 g/100 mL更具耐受性，而在高质量浓度NaCl20 g/100 mL比原始菌株反而敏感，说明在不同逆境条件胁迫下生存下来的微生物处于其他极端环境时可能会表现出不同的耐受性与抗性。

2.4 原始菌株与耐压菌株pH值耐受性差异分析

A.低pH值；B.高pH值；0h.初始菌落总数。

图 4 原始副溶血弧菌与耐压菌株的pH值耐受性

Fig.4 pH tolerance of pressure-sensitive and pressure-resistant
Vibrio parahaemolyticus

由图4可知，经pH值为3.1、3.4、3.7、4.0、4.3、4.6的培养基培养24 h后，原始菌株的生长速率分别为
－1.00、－1.00、－0.86、－0.82、－0.70、0.21，耐压菌株的生长速率分别为－1.00、－1.00、－0.76、－0.71、
－0.64、0.17。pH 4.3以下，原始菌株与耐压菌株不能存活，pH 4.6时，原始菌株生长速率高于耐压菌株，耐压菌的低pH值耐受性比原始菌株略低，但是差异不显著
（P＞0.1）（图4A）。经pH值为10.6、11.0、11.4、11.8、12.2、12.6的培养基培养24 h后，原始菌株的生长速率分别为0.20、0.19、0.17、0.10、－0.09、－0.80，耐压菌株的生长速率分别为0.17、0.15、0.14、0.05、－0.22、－1.00，在pH值大于12.2时，原始菌株与耐压菌株生长速率均小于0，说明两种菌株对高pH值的耐受性相似（图4B）。

从实验结果可以得到，耐压菌株最低和最高生长pH值均与原始菌株一致，说明耐压菌株对酸性和碱性条件的耐受性并没有发生变化。Lin等[14]研究发现热胁迫后李斯特菌对不同逆境的耐受性因菌株、热胁迫条件以及随后的逆境条件而异。Lin等[15]发现冷胁迫后的副溶血弧菌对乳酸和乙酸更加敏感，Bollman等[16]在对大肠杆菌的研究中同样发现了这种现象。Tetsuro等[17]研究发现，碱胁迫下的副溶血弧菌对其他的逆境环境如结晶紫、过氧化氢的耐受性增强，但是热胁迫下的副溶血弧菌并没有对碱性环境的耐受性增强，Chang等[18]也发现热胁迫下的副溶血弧菌对一些逆境表现出更强的耐受性，但对有些逆境环境反而更加敏感。说明胁迫条件下的交互保护作用并不是一定的。

有报道指出压力可导致微生物细胞脂质成分的变化，可能会影响细胞膜的流动性和渗透力, 当细胞处于高压环境中时，不饱和脂肪酸的含量就会增加[19-21]。这是否是导致上述现象的原因，需要进一步的观察与研究。

2.5 原始菌株与耐压菌株有机溶剂耐受性差异分析

图 5 原始副溶血弧菌与耐压菌株的有机溶剂耐受性

Fig.5 Organic solvent tolerance of pressure-sensitive and pressure-resistant Vibrio parahaemolyticus

有机溶剂对细胞的毒性主要是破坏细胞膜的结构和功能[22]，选择极性从大到小的4种有机溶剂（乙醇6.9、丙酮5.4、正丁醇3.7、甲苯2.4）检测副溶血弧菌原始菌株和耐压菌株对有机溶剂耐受性的不同，结果如图5所示。两种菌株对极性系数＞4的有机溶剂（乙醇和丙酮）比对极性系数＜4的有机溶剂（正丁醇和甲苯）的耐受性更强。并且当乙醇体积分数12%、丙酮体积分数9%和甲苯体积分数为0.75%时，原始菌株全部致死，耐压菌株仍有1.5、2.0、0.6（lg（CFU/mL）），因此，耐压菌株对有机溶剂的耐受性强于原始菌株。彭慧等[23]筛选得到一株高乙醇耐受的嗜热细菌对其他有机溶剂（如异丙醇、庚烷、甲醇等）均有更好的耐受性，与本实验结果一致。

2.6 原始菌株与耐压菌株有机酸耐受性差异分析

图 6 副溶血弧菌与耐压菌株的有机酸耐受性

Fig.6 Organic acid tolerance of pressure-sensitive and pressure-resistant Vibrio parahaemolyticus

有机酸作为防腐剂在食品工业中被广泛应用。选择4种常见的有机酸（柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸）检测副溶血弧菌原始菌株和耐压菌株对有机酸耐受性的不同，结果如图6所示。两种菌株的存活率均随有机酸质量浓度的上升而下降，但是耐压菌株耐受4种有机酸的能力均比原始菌株强，其中柠檬酸和乳酸在3 mg/mL和1.5%时，原始菌株全部致死，而耐压菌株仍有1.3、
0.9（lg（CFU/mL）），说明耐压菌株对有机酸有更强的耐受性。Liu Xiaoxiang等[24]研究发现能耐受低剂量茶多酚的绿脓假单胞菌对乳酸、乙酸、丙酸等有机酸也有很好的耐受性，说明绿脓假单胞菌在耐受茶多酚与耐有机酸方面有一定的交互抗性。与本实验结果相似。

3 结 论

本实验表明由原始副溶血性弧菌经多次超高压处理得到的耐高压胁迫菌株经生理生化鉴定为副溶血性弧菌。耐压菌株经超高压250 MPa处理存活量比原始菌株高2（lg（CFU/mL）），原始菌株在逆境条件低温（1 ℃）、高温（48 ℃）、高质量浓度氯化钠（11.5 g/100 mL）、乙醇体积分数12%、丙酮体积分数9%、甲苯体积分数0.75%，柠檬酸3 mg/mL和乳酸体积分数1.5%时，生长速率为零或负值，而耐压菌株在这些逆境条件下仍可保持一定的生长速率，说明耐压菌株对其他逆境的耐受性较原始菌株有不同程度提高。超高压诱导产生耐胁迫菌株的机理目前尚未明确。有研究表明，细菌在亚致死压力胁迫下，会产生一系列应激反应，细菌的细胞结构可能发生相应变化以抵抗压力的胁迫，细菌细胞膜蛋白分子量发生相应变化，细胞膜上不饱和脂肪酸含量升高以及细胞内几种抗氧化酶活力的升高等，细菌可以通过一系列生理反应以适应外界环境的变化，从而提高对高压胁迫的耐受性[25-26]。耐压菌株较原始菌株对逆境的耐受性更强，但在酸性和碱性条件下，耐压菌株与原始菌株的耐受性差异不显著。副溶血性弧菌主要通过水产品传播，因此，在水产品加工处理过程中，为有效杀灭致病性微生物副溶血性弧菌特别是耐压菌株，利用超高压杀菌技术的同时，辅以热处理、冷冻、添加防腐剂等协同方法，从而为有效控制副溶血性弧菌的扩散和污染，使超高压技术更好地应用于水产品的杀菌与保鲜。

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