丝瓜多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质

吴海霞1，曹雨舟2

（1.运城学院生命科学系，山西 运城 044000；2.山西昭鑫电力科技有限公司，山西 运城 044000）

摘 要：从丝瓜中分离纯化出多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），并对其部分酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级盐析、透析、DEAE-Cellulose DE-52离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化丝瓜PPO。纯化所得酶的比活力为957.9 U/mg，纯化倍数为28.3，酶活力回收率为18.5%；十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）检测结果显示该酶蛋白呈单一条带，为单亚基蛋白，其分子质量约为67.8 kD，且无同工酶；该酶最适pH 6.0，最适温度30 ℃，以左旋多巴（L-dopa）为底物，其米氏常数（Km）为1.32 mmol/L，最大反应速率（Vmax）为0.22 OD475nm/min。

关键词：丝瓜；多酚氧化酶；分离纯化；酶学特性

Isolation, Purification and Some Enzymatic Properties of Polyphenol Oxidase from Loofah

WU Hai-xia1, CAO Yu-zhou2

(1. Life Sciences Department, Yuncheng University, Yuncheng 044000, China;

2. Shanxi Zhaoxin Electric Power Technology Co. Ltd., Yuncheng 044000, China)

Abstract: Polyphenol oxidase (PPO) from loofah was extracted, and some of its kinetic properties were studied. The PPO was purified by ammonium sulfate precipitation, dialysis, DEAE-Cellulose DE-52 ion-exchange and Sephadex G-75 gel filtration. The specific activity of the purified PPO was 957.9 U/mg, which exhibited a purification fold of 28.3 and an activity recovery of 18.5%. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and native-polyacrylamide gel electrophoresis (Native-PAGE) showed that the enzyme was homogeneous as a monomeric protein. Its molecular weight was estimated to be 67.8 kD and it had no isozymes. The kinetic properties of the enzyme showed that the optimal pH and temperature were pH 6.0 and 30 ℃, respectively. The Km and Vmax towards the substrate L-dopa were
1.32 mmol/L and 0.22 OD475 nm/min, respectively.

Key words: loofah; polyphenol oxidase (PPO); purification; enzymatic properties

中图分类号：S642.4；TS255.36 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0187-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407037

丝瓜（Luffa cylindrica L. Roem）为葫芦科丝瓜属一年生攀缘性草本植物，在我国南北各地普遍种植[1]。中医认为，丝瓜性凉、味甘，具有清热凉血、顺气健脾、化瘀解毒等功效，是一种具有良好保健功效的蔬菜[2]。丝瓜在加工过程中易发生褐变，这主要是由于在受到机械损伤或处于不良环境时丝瓜体内的多酚类物质会在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的催化作用下氧化而呈现褐色，这在一定程度上降低了丝瓜的感官品质、营养价值和商品价值[3]。PPO是植物体内普遍存在的一类含铜元素的金属蛋白酶，能催化植物酚类物质为醌类，醌经自身缩合或与细胞内的蛋白质反应，产生黑色或褐色沉积物，是引起果蔬发生酶促褐变的主要酶类[3-4]。
国内外对果蔬中PPO的研究主要集中在苹果[5-6]、香蕉[7]、马铃薯[8]、茄子[9]、蘑菇[10-12]、莲藕[13]、绿豆[14]等，有关丝瓜PPO的研究仅黄树苹等[3]采用粗酶提取物对其部分酶学特性进行了报道。本实验以新鲜丝瓜为试材，对其中的PPO进行分离纯化及纯度鉴定，并对其部分酶学特性进行研究，以期为进一步研究果蔬褐变机理、调控丝瓜加工条件及采用抗褐变措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售新鲜丝瓜，经剥皮后用粉碎机破碎，备用。

DE-52 英国Whatman公司；SephadexG-75 美国Pharmacia公司；低相对分子质量标准蛋白质Maker为预染蛋白；PEG-20000、PEG-4000 美国Ameresco公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Lambda 35紫外-可见分光光度计 美国Perkin Eimer公司；2-16k台式高速冷冻离心机 美国Sigma公司；Alpha 1-2 LD plus冷冻干燥机 德国Christ公司；mini电泳仪、电泳槽 美国Bio-Rad公司；PB-10 pH计 德国Sartorius公司；BT1-100E 恒流泵、QT-58A智能紫外检测仪、DBS-100-LCD全自动部分收集器 上海琪特分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质含量测定

采用Bradford染色法[4]。以牛血清蛋白作为标准蛋白，绘制标准曲线，并计算蛋白质含量。其回归方程为y=5.2171x＋0.0038，R2=0.9993。

1.3.2 多酚氧化酶（PPO）酶活力的测定

取2.4mL 20 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl缓冲液（TBS）于试管中，45℃预热3 min，加入0.5 mL 30 mmol/L L-Dopa溶液，预热2 min，加400 μL酶液，反应6 min后，迅速取出测定OD475nm。以煮沸10 min后的酶液取代原酶液作为空白对照。1个PPO活力单位（U）定义为：测定条件下每分钟引起OD值变化0.001所需的酶量[6,10]。比活力（U/mg）定义为：指酶液中每毫克蛋白的酶活力。纯化倍数是指纯化后所得酶液的比活力与粗提酶液比活力的比值。

1.3.3 丝瓜PPO粗酶液的提取

采用磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）提取法[8-9]。取200g新鲜丝瓜，剪碎后，以料液比1∶1（m/V）加入4 ℃预冷的pH5.5 PBS中，并加10g聚乙烯吡咯烷酮及0.5g VC，匀浆，于4 ℃静置浸提12h，过滤，滤液于4℃、10000 r/min离心20 min，上清液即为PPO粗酶液。

1.3.4 丝瓜PPO的分离纯化

1.3.4.1 分级盐析

在粗酶液中，加入30%饱和硫酸铵，4℃静置6h，10000r/min离心20min，上清液测量体积后再加入40%的饱和硫酸铵、静置、离心。同上，依次用50%、60%、70%、80%的不同饱和度硫酸铵进行盐析。测定每次盐析后上清液中的酶活力，以粗酶提取液的酶活力为100%，二者相比得相对酶活力 [9]。实验重复3次。

1.3.4.2 透析除盐

将经盐析所得蛋白溶于PBS，于4℃冰箱透析约12～18h，其间每3～4h更换蒸馏水。BaCl2饱和溶液检查透析是否完全。

1.3.4.3 聚乙二醇浓缩

透析后的酶液采用 PEG4000浓缩后，过DEAE-cellulose DE52离子交换柱；收集的酶液采用 PEG20000浓缩后进行Sephadex G-75凝胶过滤。

1.3.4.4 DEAE-cellulose DE-52离子交换层析

取4mL浓缩后的酶液上样于经0.02 mol/L、pH7.0 TBS平衡的DE-52离子柱，用0.02 mol/L、pH7.0的TBS（含0～1 mol/L NaCl）连续线性洗脱，流速0.5 mL/min，每管收集1.5 mL。测定各管的OD280 nm、OD475 nm及酶活力，合并收集酶活性峰。PEG20000浓缩、离心备用[6-9]。

1.3.4.5 Sephadex G-75凝胶过滤层析

将经DE-52初步纯化的粗酶液12000 r/min高速离心5 min，取上清1mL上样Sephadex G-75凝胶柱，用0.05 mol/L、pH7.0的TBS（0.l mol/L NaCl）洗脱，流速0.25 mL/min，每管收集1.0 mL。隔管检测OD280 nm和OD475 nm及酶活力，合并收集酶活性峰。真空冷冻干燥，备用[6-9]。

1.3.5 SDS-PAGE和Native-PAGE检测[15]

1.3.5.1 SDS-PAGE电泳

采用分离胶12%、浓缩胶4%，电极缓冲液为pH 8.3的Tris-Gly-SDS缓冲液。初始电压80V，待溴酚蓝指示染料前沿进入分离胶后，电压调至120V。以溴酚蓝在电泳凝胶片的前沿位置作参数，计算各标准蛋白与样品的相对迁移率Rf值，以lgMr对Rf值作标准曲线，计算PPO的相对分子质量。回归方程为y=－1.3614x＋2.6465，R2=0.9623。

1.3.5.2 Native-PAGE电泳

操作方法与SDS-PAGE类似，但上样前样品不煮沸，且上样缓冲液中不含强还原剂β-巯基乙醇。上样样品为检测酶活力逐渐增强的5个收集管内的酶液，每个样品2个平行。电泳结束后，两组样品分别进行活性染色与考马斯亮蓝R-250染色[9]。

1.3.6 丝瓜PPO部分酶学性质

1.3.6.1 最适pH值

按1.3.2节酶活力测定体系，以不同缓冲液调节反应体系的pH值，测定不同pH值（3.0～10.0）范围内PPO的酶活力；以酶液在最适条件下的酶活力作为100%，其余pH值条件下测得的酶活力分别与之相比得相对酶活力[11-12]，每个处理3次重复。

1.3.6.2 最适温度

按1.3.2节酶活力测定体系，分别测定酶液在不同温度（20～70℃）下的酶活力；以酶液最适条件下酶活力作为100%，其余温度条件下测得的酶活力分别与之相比得相对酶活力[11-12]，每个处理3次重复。

1.3.6.3 米氏常数（Km）、最大反应速率（Vmax）的测定

将L-Dopa配制成不同浓度的溶液（2～15 mmol/L），分别测定不同底物浓度下酶的反应速率（用吸光度OD475 nm表示） [14-15]。按Lineweaver-Burk双倒数作图，求出Km、Vmax。

2 结果与分析

2.1 硫酸铵最佳饱和度的确定

图 1 硫酸铵分级盐析

Fig.1 Ammonium sulphate fractional precipitation

为研究不同饱和度硫酸铵溶液沉淀丝瓜PPO的效果，对粗酶液提取液进行分级盐析，结果如图1所示。采用30%～80%的饱和硫酸铵分级沉淀丝瓜PPO时，随着硫酸铵饱和度的增加，其上清液中的相对酶活力逐渐降低。硫酸铵饱和度为30%时，上清液中的酶活力最高，40%与30%差异不明显，但当其饱和度升至50%时，酶活力下降幅度较大，当饱和度达到80%时，上清液中几乎不含酶蛋白，酶活力仅为7%。由此说明，丝瓜PPO主要存在于40%～80%饱和度硫酸铵盐析沉淀中，小于40%的硫酸铵饱和度下沉淀出的蛋白质主要为杂蛋白[11]。为了纯化得到较多的PPO，同时使酶活力得到最大回收，以采用40%～80%饱和度硫酸铵盐析沉淀对丝瓜PPO进行初步纯化最为合适。

2.2 丝瓜PPO的分离纯化结果

表 1 丝瓜PPO纯化结果

Table 1 Purification of PPO from loofah

从表1可见，粗酶液提取液经硫酸铵沉淀、柱层析纯化后，其中的蛋白含量大幅降低，总酶活力明显下降，但酶比活力显著增加。粗酶液经40%～80%饱和度硫酸铵分级沉淀后，去除了72.7%的杂蛋白，酶活力回收率70.5%，比活力比粗酶液提高了2.6倍，可能是在纯化过程中一些PPO活性抑制物被去除[16]。

经硫酸铵沉淀后的PPO采用DEAE-cellulose DE-52柱层析进一步纯化，并选用改变洗脱液离子强度的方法对PPO进行梯度洗脱，NaCl的梯度为0～1.0 mol/L。从图2可以看出，这一步分离纯化过程出现1个大的蛋白质洗脱峰，和3个小的蛋白洗脱峰，其中第1个大的洗脱峰含酶量较少，几乎检测不到PPO活力。而第2个蛋白峰含酶量较高，对应的NaCl洗脱浓度约为0.5 mol/L。从表1及洗脱曲线可以看出，酶活性峰的对应位置蛋白峰较弱，说明离子交换层析可除去大部分杂蛋白，并使酶的比活力较粗酶液提高6.4倍。合并有酶活性的75～78号收集管，采用PEG20000包埋法浓缩，进一步进行Sephadex G-75凝胶柱纯化。

图 2 DEAE-Cellulose DE-52离子交换层析

Fig.2 DEAE-Cellulose DE-52 ion exchange chromatography

Sephadex G75凝胶层析的洗脱曲线如图3所示。可以看出，洗脱过程中出现3个明显的蛋白吸收峰，经检测第1个峰蛋白含量较高，且对应于酶活性峰，说明该峰即为PPO对应洗脱峰。将对应于第1个洗脱峰的第64～66管洗脱液合并，测定得其蛋白质含量为1.0mg，总酶活力为967.5U，酶比活力为957.9 U/mg，经过此纯化步骤，酶液的比活力较粗酶液提高了28.3倍。在上述整个纯化过程中，酶活力的回收率为18.5%，杂蛋白去除率高达99.4%。

图 3 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析

Fig.3 Sephadex G-75 gel ?ltration chromatography

2.3 丝瓜PPO纯度的鉴定结果

对各步纯化所得酶液分别进行SDS-PAGE变性电泳，并对经Sephadex G-75凝胶层析后的纯化样品进行Native-PAGE非变性电泳，结果如图4、5所示。

由图4可知，经硫酸铵盐析所得样品中含有大量杂蛋白；经DE-52离子交换层析后，杂蛋白明显减少；最后经Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析后，为单一条带，说明该酶蛋白为单亚基蛋白，其分子质量约为67.8kD。

1. 硫酸铵盐析；2. DE-52离子交换层析；3. Sephadex G-75凝胶过滤层析；M. 标准分子质量蛋白。

图 4 丝瓜PPO SDS-PAGE电泳图谱

Fig.4 SDS-PAGE of loofah PPO

a

b

a. 考马斯亮蓝R-250染色；b. 活性染色。

图 5 丝瓜PPO Native-PAGE图谱

Fig.5 Native-PAGE of loofah PPO

由图5可知，对Native-PAGE电泳胶带活性染色后，仅显示1条清晰的随蛋白浓度减小而由深变浅的褐色条带（b），表明丝瓜PPO无同工酶。同时，与其对应的样品进行考马斯亮蓝R-250染色后，得到清晰的蓝色条带（a），且条带强弱均同活性染色条带一致，表明考马斯亮蓝染色条带即为丝瓜PPO蛋白。

2.4 丝瓜PPO部分酶学性质分析结果

2.4.1 最适pH值分析结果

pH值是影响酶活性表达的重要因素，一般是通过改变酶的构象而实现的，pH值不但影响酶活性基团的解离，也会影响底物的解离[12]。由于PPO是含铜酶，pH值较高或较低都会导致Cu2+的解离及蛋白质的变性，而使PPO失去活性。研究报道，不同植物或同一植物不同部位的PPO，其最适pH值可能有所不同，作用底物的不同也会导致最适pH值的变化。以邻苯二酚为底物，曼密苹果PPO为7.0[6]，黑豆PPO最适pH 6.8[17]，栗子PPO最适pH值为5.0[18]。Aydemir[19]分别以愈创木酚、L-Dopa及邻苯三酚为底物研究得出洋蓟PPO最适pH值分别为6.0、8.0和6.5。Arslan等[20]则分别以愈创木酚、儿茶酚及邻苯三酚为底物研究表明桑葚PPO的最适pH值为5.0、7.0和7.5。本实验以L-Dopa为底物研究了丝瓜PPO的最适pH值。由图6可知，该酶促反应适宜的pH值范围较宽，当pH值为3.0～6.0时，随着pH值的逐渐增加，丝瓜PPO的活性逐渐增强，pH值为6.0时活性最高，然后随着pH值的继续增大，酶活力受到抑制，逐渐减弱。由此可知，以L-Dopa为底物时丝瓜PPO的最适pH为6.0。与黄树苹等[3]以邻苯二酚为底物所测得的丝瓜PPO最适pH6.8有差别。这主要是由于实验中PPO作用底物不同而造成，但同时也可能受到丝瓜品种、实验方法等因素的影响。

图 6 丝瓜PPO最适作用pH值

Fig.6 Optimal pH of loofah PPO

2.4.2 最适温度分析结果

温度对酶催化反应的影响是双重的，一方面是酶作为一种生物催化剂，随着温度的升高，其活化分子数增多，催化效率提高，酶促反应速率加快；另一方面则是随着反应温度的升高，酶蛋白变性程度不断加深，逐步丧失其催化活力，同时不适宜的温度也会破坏酶活性部位三维结构的完整性和稳定性[17,21]。如图7所示，在10～30 ℃随着温度的上升，丝瓜PPO活性逐渐增强，30 ℃时活性最高，可能是在此温度范围内第一种效应起主导作用，温度的适度提高，可使酶朝着有利于与底物发生作用的催化构象转变；随着温度的继续升高，酶活力有所下降，但当升高至65 ℃时还有60%以上的相对酶活力，这说明温度的继续升高虽然会使酶的催化活力下降，但效果并不明显。因此说明，丝瓜PPO的最适反应温度虽是30 ℃，但在实际的贮藏、加工过程中，并不能单独采用持续升温的措施来控制褐变，而需与其他的控制酶活力的方法相结合。

图 7 丝瓜PPO最适作用温度

Fig.7 The optimal temperature of loofah PPO

2.4.3 Km、Vmax的测定结果

米氏常数（Km）是反应达到最大反应速率一半时的底物浓度，可以反映酶与底物亲合力的大小。Km越小，酶与底物的亲合力越大。酶的Km值范围很广，大多数酶的Km值在10-6～10-7 mol/L[4]。不同植物来源PPO的Km不同，同一种PPO作用底物不同，其Km也不同。Palma-Orozco等[6]以儿茶酚和邻苯三酚为底物，得出曼密苹果PPO的Km分别为44、1.3 mmol/L。以L-Dopa为底物时洋蓟PPO的Km及Vmax分别为37.7 mmol/L、
5865U/（mL•min）[19]。本实验以L-Dopa为底物，据Lineweaver-Burk双倒数作图原理，得线性方程y=5.9956x＋4.5496，推知丝瓜PPO的Km为1.32mmol/L、Vmax为0.22 OD475 nm/min。比较洋蓟PPO与丝瓜PPO，发现作用于同一底物L-Dopa时，其Km的差异很大，可能是由于不同来源PPO的酶蛋白组成、结构不同，其与底物结合的能力强弱不同，从而造成其Km不同。

3 结 论

丝瓜PPO的分离纯化过程表明，采用40%～80%的硫酸铵分级沉淀，可以去除粗酶提取液中72.7%的杂蛋白，酶活回收率达70.5%；经透析、PEG浓缩，依次上样DE-52和Sephadex G-75进一步纯化后，酶比活力达957.9 U/mg，酶活力回收率为18.5%，纯化倍数为28.3。SDS-PAGE凝胶电泳显示单一条带，为单亚基蛋白，分子质量约为67.8 kD，Native-PAGE结果表明此酶无同工酶。

丝瓜PPO酶促反应在pH5.0～7.0酶活力较高，pH4.0～5.0和pH7.0～8.0酶活力受到抑制，其最适pH6.0。在10～30 ℃随着温度的升高，酶活逐渐增强，在30 ℃时酶活最高；大于30 ℃时，随着温度的升高，酶活逐渐减弱，其最适温度30 ℃。以L-Dopa为底物时，该酶的Km值为1.32mmol/L，Vmax为0.22 OD475 nm/min。在丝瓜的贮藏、加工过程中可采用调节pH值在强酸性或偏碱性环境并结合适当升温的方法来保持酶活性在较低的水平，从而达到控制丝瓜褐变的目的。

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