芦蒿总黄酮提取物的急性毒性及遗传毒性

吴雨龙，华 春*，扶庆权，吴向华

（南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京 211171）

摘 要：目的：研究芦蒿总黄酮提取物的安全性。方法：采用急性毒性实验、小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸形实验、小鼠骨髓染色体畸变实验和Ames试验，观察芦蒿总黄酮提取物的急性毒性和遗传毒性作用。结果：芦蒿总黄酮提取物急性毒性的LD50＞10g/kg，遗传毒性实验为阴性。结论：在本实验条件下，未观察到芦蒿总黄酮提取物对小鼠有急性毒性及遗传毒性作用。

关键词：芦蒿；总黄酮；急性毒性；遗传毒性

Acute and Genetic Toxicity of Total Flavonoids Extract of Artemisia selengensis

WU Yu-long, HUA Chun*, FU Qing-quan, WU Xiang-hua

(School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China)

Abstract: Objective: To evaluate the safety of total flavonoids extract of Artemisia selengensis for consumption. Methods: Acute toxicity test, micronuclear test in polychromatic erythrocytes of bone marrow and sperm abnormality in mice, bone marrow chromosome aberration test in mice and Ames test were conducted to investigate the acute and genetic toxicity of the total flavonoids extract. Results: For the acute toxicity, the LD50 was > 10 g/kg. No apigenin-related genetic toxicity was observed. Conclusion: Under the conditions of this experiment, the total flavonoids extract has neither acute nor genetic toxicity.

Key words: Artemisia selengensis; total flavonoids; acute toxicity; genetic toxicity

中图分类号：R114 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0206-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407041

芦蒿（Artemisia selengensis Turcz.）又名藜蒿、蒌蒿等, 富含黄酮等多种生物活性物质[1-2]。而总黄酮物质在抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等方面都表现出了较好的活性。Silvina等[3]研究表明经常食用富含黄酮的食物能极大提高机体的抗氧化能力，能有效清除羟自由基和超氧阴离子，抑制丙二醛的氧化作用，降低慢性病的发生率。Zheng Weifa等[4]发现从芫花根提取的总黄酮能够保护外周血淋巴细胞的肿瘤诱导的减少，并增加淋巴细胞增殖能力和NK细胞的杀伤活性，而抑制肿瘤的生长和转移。Liu Yuetao等[5]报道从罗萨金樱子果实中提取的总黄酮能够降低血浆中的丙氨酸转氨酶、谷草转氨酶活性和丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽的含量，对肝脏具有很好的保护作用。黄酮的开发与应用已成为食品、医药、生物工程、化工等领域的重要研究方向[6]。但有关芦蒿总黄酮提取物的系统毒性研究尚未见报道。本实验对芦蒿总黄酮提取物进行了急性毒性及遗传毒性研究，为合理开发利用芦蒿总黄酮提取物资源以及临床应用提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦蒿总黄酮提取物由南京晓庄学院生物化工与环境工程学院食品工程教研室提供。

鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型突变株TA97、TA98、TA100和TA102，由南京医科大学应用毒理学研究所提供。

昆明种小白鼠（Ⅱ级），动物合格证号：CXK苏2007700001，体质量18～25g，由南京盛民科研动物养殖场提供。

环磷酰胺（产品批号：06032021） 江苏恒瑞医药股份有限公司；小牛血清 杭州四季青公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

超声波清洗仪KQ.250B 江苏省昆山市超声仪器有限公司；尼康50I荧光显微镜（配CCD和图像分析系统） 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 芦蒿总黄酮提取物的制备

称取适量的芦蒿干粉，加入70%的乙醇，料液比为1∶120（m/V），加入微波仪，微波功率400W，微波时间3 min，得提取液，经抽滤，冷冻干燥得芦蒿总黄酮提取物。以芦丁为标准品通过紫外分光光度法计算得出提取物中总黄酮的含量为4.31%。

1.3.2 小鼠经口急性毒性实验

取小鼠50只，雌雄各半，体质量18～25g，在室温（22±3）℃，湿度30%～70%，自由摄食、饮水的饲养条件下，适应性饲养5d后，随机分成5组，每组10只，其中第Ⅰ～Ⅳ组为实验组，第Ⅴ组为空白对照组，正式给药前禁食8h，不禁水。称量各组小鼠体质量，记录。采用改良寇氏法，根据预实验的剂量，Ⅰ～Ⅳ组分别以1.5、3、6、12 g/kg，4个不同剂量组进行灌胃，分3次灌胃给予溶解于蒸馏水中的芦蒿总黄酮提取物，间隔8h。空白对照组分3次灌服相同体积的蒸馏水。给药后正常饲养，连续观察14d。每天观察小鼠的进食、活动、大小便、精神等全身反应状况及死亡情况，并及时记录。第14天时称量各组小鼠体质量后，剖检存活小鼠，观察主要脏器是否有病变[7-8]。

1.3.3 遗传毒性实验

1.3.3.1 小鼠骨髓细胞微核实验

取小鼠50只，雌雄各半，体质量18～25g，随机分为5组，每组10只，设阴性对照组、阳性对照组和3个实验组。其中阴性对照组经口灌服蒸馏水，阳性对照组采用环磷酰胺45 mg/kg腹腔注射。实验组以芦蒿总黄酮提取物分别按500、3000、12000 mg/kg进行灌胃给药。连续给药2次，间隔24h。在第2次给予受试药物后6h，将小鼠脱颈处死，取小鼠两侧股骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉碎片，剪去股骨两端，用注射器吸取小牛血清约0.05 mL反复冲洗骨髓腔数次[9]。将冲洗液滴在载玻片上推片。每个股骨推片5张，自然干燥。在干燥的玻片上滴加1滴甲醇，自然干燥。将固定好的涂片用1∶10的姬姆萨氏-磷酸盐缓冲液（pH6.4）染色25 min，用蒸馏水冲洗，干燥备检。嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟正染红细胞呈红色。每只小鼠需计数2000个嗜多染红细胞，并计算含微核的嗜多染红细胞数，取其平均值,在一个细胞中出现两个或多个微核，仍按一个微核细胞计算。微核率按式（1）计算[10]，并以千分率表示。

嗜多染红细胞微核率/‰= ×1000

含微核的嗜多染红细胞数

嗜多染红细胞总数

（1）

1.3.3.2 小鼠精子畸形实验

取雄性小鼠50只，随机分为5组，体质量18～25g，每组10只，设阴性对照组、阳性对照组和3个实验组。实验组采用芦蒿总黄酮提取物经灌胃染毒，染毒剂量分别为500、3000、12000mg/（kg•d）， 每天按时给药，连续5d，阴性对照组灌服同体积蒸馏水，阳性对照组采用环磷酰胺20mg/（kg•d）腹腔注射，每天1次，连续5d。于染毒后第35天取样，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取出二侧副睾，放入盛有1 mL磷酸盐缓冲液的平皿中。用眼科剪将副睾剪碎，静置5 min后轻轻摇动。用4层擦镜纸滤去组织碎片[7-8]。滤液以1000 r/min离心5 min，去除大部分上清液，剩约0.5 mL液体与沉淀物摇匀后，用滴管吸取1滴将其滴于洁净的载玻片上，涂片，每只小鼠涂5张玻片，在空气中干燥后，用甲醇固定5 min。干燥后用2%伊红染色1h，用水轻冲，干燥备检。每张玻片需计数200个精子，取其平均值，精子畸形率按式（2）计算[7]。

精子畸形率/%=精子畸形总数/检查精子总数×100 （2）

1.3.3.3 骨髓细胞染色体畸变分析实验

取小鼠50只，雌雄各半，体质量18～25g，随机分为5组，每组10只，设阴性对照组、阳性对照组和3个实验组。其中阴性对照组经口灌服蒸馏水，阳性对照组采用环磷酰胺20 mg/kg腹腔注射。实验组以芦蒿总黄酮提取物分别按1.2、120、12000mg/（kg•d）进行灌胃给药。每天1次，连续5d。在处死动物前2～3h，腹腔注射秋水仙素4 mg/kg。颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取出双侧股骨，去肌肉，擦净血污，剪开两端关节面，用注射器吸磷酸盐缓冲液5 mL冲出骨髓于离心管中，1500 r/min，离心10 min，去上清。加入适量预热37℃ KCl，混匀，37℃低渗15 min，再加固定液2 mL，混匀，1000 r/min离心10 min，去上清。再加入固定液4 mL混匀，室温放置15 min，然后1000 r/min离心10 min，去上清。重复一次，去上清，留约0.5 mL。将细胞悬液滴于冰冻载玻片上，干燥，用10% Giemsa染液染色15 min，用蒸馏水冲洗，干燥备检。每只动物观察100个中期分裂相细胞，计算染色体畸变率。

1.3.3.4 Ames试验

实验菌株为经过鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102。实验采用平板掺入法。芦蒿总黄酮提取物设8、40、200、1000、5000μg/皿
5个组，同时设空白对照组、溶剂对照组（二甲基亚砜）和阳性对照组（2-氨基芴、1,8-二羟基蒽醌、ICR-191、柔毛霉素、叠氮化钠、丝裂霉素C），每种菌株每个测试浓度设3皿平行，在加S9和不加S9条件下进行实验，计数回复突变菌落数，以超过溶剂对照组回复突变菌落数的2倍且有剂量-反应关系作为阳性判断标准[11]。

1.3.4 统计学分析

采用SPSS1010软件进行分析，实验结果以

±s表示，并进行t检验，显著性水准为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 急性毒性分析

在灌服不同剂量的芦蒿总黄酮提取物后各组小鼠外观特征基本正常，未见毛色差、精神萎靡、毛松等异常表现，也未见耳、眼、口、鼻有异样分泌物，呼吸道反应正常，未见咳嗽、哮喘现象，四肢活动和走动正常，实验组与对照组各小鼠状态无明显差异，各组小鼠未见死亡。整个实验过程中未见小鼠出现明显的中毒症状。各组小鼠平均体质量呈增长趋势，实验组与对照组相比差异不显著，见表1。剖解小鼠，实验组与对照组相比主要内脏器官均未出现肉眼可见的明显病变。

表 1 芦蒿总黄酮提取物对小鼠体质量的影响（

x

±s，n=10）

Table 1 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengensis on body weight of mice (

x

±s, n = 10)

2.2 遗传毒性分析

2.2.1 小鼠骨髓细胞微核分析

于第2次染毒后6h将各组小鼠全部处死，取骨髓细胞液涂片，镜检并计算微核率。结果见表2。

表 2 芦蒿总黄酮提取物对小鼠骨髓微核率的影响（

x

±s，n=10）

Table 2 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengensis on mouse bone marrow micronucleus rate (

x

±s, n = 10)

注：*.与阳性对照组比较，有极显著性差异（P＜0.01）。表3、4同。

a

b

图 1 带微核的嗜多染红细胞（a）和不带微核的嗜多染红细胞（b）（×400）

Fig.1 PCE (a) with micronucleus and normal PCE (b) (× 400)

经检测，各实验组与阴性对照组相比差异不显著，各实验组与阳性对照组相比差异极显著，各个实验组之间差异均不显著，见表2、图1。表明在该实验条件下，芦蒿总黄酮提取物无致小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的作用。

2.2.2 小鼠精子畸形分析

于最后一次染毒后第35天将小鼠全部处死，取附睾精子涂片，计算精子畸形率。结果见表3。

表 3 芦蒿总黄酮提取物对雄性小鼠精子的影响（

x

±s，n=10）

Table 3 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengensis on sperm number and quality in male mice (

x

±s, n = 10)

a

b

c

d

a．正常精子；b.无尾精子；c.无钩精子；d.双尾精子。

图 2 不同精子放大图片（×400）

Fig.2 Normal sperm (a), tailless sperm (b), no hook sperm (c) and double tail sperm (d) （× 400）

经检测，各实验组与阴性对照组相比差异不显著，各实验组与阳性对照组相比差异极显著，各个实验组之间差异均不显著，见表3、图2。表明在该实验条件下，芦蒿总黄酮提取物对小鼠精子无致畸变作用。

2.2.3 骨髓细胞染色体畸变分析

每只小鼠观察100个中期分裂相细胞，结果见表4。

表 4 芦蒿总黄酮提取物对小鼠骨髓细胞染色体
畸变率的影响（

x

±s，n=10）

Table 4 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengensis on chromosome aberration rate of bone marrow cells in mice (

x

±s, n = 10)

a

b

c

a.正常骨髓染色体；b.骨髓染色体数目减少；c.骨髓四价染色体。

图 3 骨髓染色体放大图片（×400）

Fig.3 Normal bone marrow chromosome (a), bone marrow chromosome number reduction (b), and bone marrow tetravalent chromosome (c) (× 400)

经检测，各实验组与阴性对照组相比差异不显著，各实验组与阳性对照组相比差异极显著，各个实验组之间差异均不显著，见表4、图3。表明在该实验条件下，芦蒿总黄酮提取物对小鼠骨髓细胞染色体无致畸作用。

2.2.4 Ames试验结果分析

表 5 芦蒿总黄酮提取物对鼠伤寒沙门氏菌回变菌落数的影响

Table 5 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengensis on Salmonella typhimurium revertant colonies

注：*.与空白对照组比较，P＜0.01；#. 与溶剂对照组比较，P＜0.01。

由表5可知，在加或不加S9的条件下，不同剂量受试物的回复突变菌落数与溶剂对照组相近，均未达到溶剂对照组的2倍，阳性对照物显示出明显的诱变性。表明在实验剂量范围内，在加或不加S9的条件下，芦蒿总黄酮提取物对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型4株菌株均无致突变作用。

3 讨 论

芦蒿富含黄酮等活性物质，对降血压、降血脂、缓解心血管疾病均有较好的食疗作用，是一种典型的保健蔬菜[12]。总黄酮作为芦蒿的主要活性成分，具有抗过敏、抗致癌、抗糖尿病、抗肿瘤和保肝作用[13-16]。深化总黄酮的研究，将有助于进一步开发总黄酮在食品保健和抗癌、心血管保护等作为治疗药物方面的应用前景，带来更大的社会效益和经济效益。

急性毒性实验研究是评价药物安全性的一项重要指标，本实验采用改良寇氏法通过小鼠经口给药设计了急性毒性实验，观察了芦蒿总黄酮提取物的急性毒性。灌胃的最大剂量达到12 g/kg体质量，超过了安全剂量10 g/kg体质量以上，小鼠没有发生死亡情况且生长情况良好，体质量呈增长趋势，由此证明芦蒿总黄酮提取物未干扰小鼠代谢系统，未影响食物的吸收利用。剖检存活小鼠后，未见心、肝、脾、肺、肾等主要内脏器官出现肉眼可见的病变， 由此证明短期内芦蒿总黄酮提取物对小鼠安全，可认为该受试物急性毒性实验是安全的，不必测定其半数致死量（LD50），表明芦蒿总黄酮提取物属于实际无毒类[7]。

小鼠骨髓细胞微核实验和染色体畸变实验可以反映受试物对哺乳动物骨髓细胞染色体的作用能力，以检测致突变物对遗传物质的损伤情况[17-19]。小鼠精子畸形实验可以用来判断受试物是否造成了精子功能障碍，反映了生殖系统在外来诱变剂作用下的变异现象。这3项遗传毒性实验结果均为阴性，表明芦蒿总黄酮提取物对体细胞和生殖细胞没有致突变性。

Ames 试验根据遗传学终点分属于基因突变，它是检测环境诱变剂一组实验中的首选实验，广泛应用于致突变化学物的初筛[20]。在加或不加S9的条件下，芦蒿总黄酮提取物Ames 试验的结果都为阴性，说明芦蒿总黄酮提取物既没有间接诱变活性，也没有直接诱变活性。

综上所述，芦蒿总黄酮提取物对小鼠无急性毒性及遗传毒性作用，在食品保健和治疗药物方面很有开发前景。

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