蛋白质组学在果实成熟衰老机理方面的研究进展

李 欣，毕 阳*，王军节，龚 迪

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

摘 要：利用蛋白质组学技术，可以从蛋白质表达水平上揭示果实成熟衰老的分子机理。本文综述蛋白质组学在跃变型和非跃变型果实成熟衰老机理方面的研究进展，根据生物信息学对差异积累的蛋白质进行的功能分类表明，果实的成熟衰老普遍涉及基础代谢、能量生成、防卫和胁迫反应等重要生理过程。同时，分析蛋白质组学在果实成熟衰老机理研究中存在的不足，并对今后的发展方向进行展望。

关键词：蛋白质组学；果实；成熟；衰老；基础代谢；能量生成

Advances in the Application of Proteomics in Researching the Mechanisms of Fruit Ripening and Senescence

LI Xin, BI Yang*, WANG Jun-jie, GONG Di

(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Abstract: Proteomic technique has already been utilized to unravel the molecular mechanisms of fruit ripening and senescence by investigating the change of protein expression profiles involved in these processes. This paper reviews the recent advances in the application of proteomics in researching the mechanism of ripening and senescence of climacteric and non-climacteric fruits. The bioinformatics-based functional classification of differentially accumulated proteins indicates that the important physiological processes involved in fruit ripening and senescence include basic metabolism, energy production, defense and stress response are. The disadvantages of proteomic technique and its future prospects are also discussed.

Key words: proteomics; fruit; ripening; senescence; basic metabolism; energy production

中图分类号：TS255.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0243-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407048

果实的成熟衰老是高度协调、不可逆转的复杂过程，涉及大量基因表达和生理生化等代谢[1]，这些过程不仅受生长发育阶段和激素水平的影响，还受采后处理和贮藏条件的调控[2-3]。成熟衰老作为果实发育的最后阶段，直接影响着果实的采后寿命和品质[4]。

蛋白质组学是近年来发展起来的一项新技术，可系统地研究果实生理生化以及与成熟衰老相关的功能性蛋白或者基因的变化，动态描述蛋白水平的表达差异，并鉴定出与其具体变化相关的蛋白或基因，分析不同生长时期、不同环境条件对果实生命过程的影响，从蛋白质水平上揭示各种生理过程的分子机理，为果实成熟衰老机理的研究提供全新的技术方法[5-7]。因此，蛋白质组学的应用对于从更深层次揭示果实的成熟衰老及品质形成机制具有重要意义。本文综述了蛋白质组学在跃变型和非跃变型果实成熟衰老机理方面的研究进展，并提出了存在的不足及今后的发展趋势。

1 跃变型果实

1.1 番茄

作为模式植物，番茄被广泛用于成熟衰老机理的研究。Rocco等[8]利用比较蛋白质组学研究了两个当地品种在成熟过程中蛋白质的变化，鉴定出83个蛋白点，其中涉及氧化还原控制、防卫胁迫反应、碳代谢、能量生成及信号转导等重要生理反应，该研究首次表征了番茄果实在成熟过程中的蛋白组变化图谱。Faurobert等[9]
利用双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）分析了樱桃番茄果皮在6个不同发育阶段的蛋白质变化，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）和液相色谱质谱联用（liquid chromatogram-mass spectrometer，LC-MS）鉴定出90种蛋白质。结果表明，幼果中与氨基酸代谢和蛋白质合成的蛋白点主要在细胞分裂期表达，之后下调；在细胞膨大期，与光合作用和细胞壁形成的蛋白点暂时性增加；相反，涉及到碳化合物和糖代谢以及氧化过程的蛋白质却在此过程中下调，而在成熟果实中其丰度达到最大，与胁迫响应和果实衰老相关蛋白点的变化规律也同上述结果一致，该研究从蛋白组水平上丰富了果实成熟衰老的分子基础。Barsan等[10]研究了红番茄果实中有色体的蛋白质组学，通过Western blotting分析鉴定出988个蛋白点，涉及到参与香气物质合成的脂氧合酶途径的所有蛋白、淀粉合成和降解的蛋白、叶绿素降解的蛋白、卡尔文循环和磷酸戊糖途径的全套蛋白，但缺少叶绿素合成的蛋白以及关于类囊体转运机制的蛋白，这些结果为研究番茄有色体的代谢特点以及解释果实的成熟机理提供了新的思路。Konozy等[11]运用蛋白组学技术十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、
LC-MS/MS）研究了3种成熟番茄果实蛋白质组，并比较了它们的质地特性，鉴定出25种细胞壁蛋白，分别参与了多糖、脂质、氧化还原等代谢，为揭示果实的成熟衰老提供了重要线索。

1.2 桃

Prinsi等[12]分析了两个品种的桃在不同果肉硬度时期的差异蛋白表达情况，53个蛋白点在成熟过程中发生了显著变化，其中39个用LC-ESI-MS/MS鉴定出来，这些蛋白质既参与了基础代谢（糖类、有机酸、氨基酸）和乙烯合成，又涉及了次级代谢和胁迫反应。研究发现，1-氨基环丙烷-1-羧基氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）在果实从呼吸跃变前期向跃变期转化的过程中丰度变化较大，其他参与乙烯代谢的相关蛋白，如硫腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）合成酶和β-氰丙氨酸合成酶也被鉴定出来。同时，蔗糖合成酶和α-淀粉酶的丰度变化暗示了两个品种的成熟桃果实在糖代谢活力方面存在差异性。另外，一些典型的活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除酶在两个品种之间也呈现差异积累。Hu Hao等[13]分析了桃果实内果皮和中果皮在花后28～59d的差异蛋白质，结果表明，68种蛋白质在此过程中差异表达，其中大多数参与了初级和次级代谢；内果皮中的大多数参与初级代谢的蛋白质表达量下调，但丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）丰度却增加，而且，其表达模式与木质素含量的增加呈线性正相关，表明PDH在木质化作用中发挥着重要作用。同时数据显示涉及木质素和黄酮类代谢的相关酶类在内果皮发育过程中的表达具有时空性，且这两种途径存在竞争性。此外，氧化胁迫蛋白只在内果皮中观察到，推测其在激活木质化作用和后续程序性细胞死亡中发挥作用。Qin Guozheng等[14]利用2-DE结合Immunoblotting研究了桃果实衰老过程中线粒体蛋白的变化，结果显示个别线粒体蛋白、三羧酸循环酶、抗氧化蛋白的氧化损伤与线粒体生物学功能的丧失密切相关，最终导致果实衰老。

1.3 苹果

Guarino等[15]通过经典的蛋白质组学技术（2-DE、MALDI-TOF-MS和μLC-ESI-IT-MS/MS）分析了苹果果肉中主要可溶性化合物，利用相关数据库最终鉴定出44个蛋白点，涉及到28种蛋白质，分别参与了能量生成、成熟和胁迫响应等重要生理过程。Qin Guozheng等[16]研究了苹果衰老过程中线粒体蛋白质组的动态变化，并深入分析了活性氧对衰老的影响，此研究表明ROS可能是通过改变一些线粒体蛋白的表达并使其生物学功能丧失来调控果实的成熟衰老。

1.4 香蕉

Toledo等[17]应用双向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）研究了香蕉果实在成熟过程中蛋白的变化，共鉴定出26个蛋白点，丰度最大的是几丁质酶，热激蛋白、异黄酮还原酶、果胶裂解酶、苹果酸脱氢酶、淀粉磷酸化酶及乙烯合成相关酶也有所积累。此研究提供了关于香蕉果实成熟过程中与风味、质地、防卫、乙烯合成、表达调控、蛋白质折叠有关的蛋白质变化信息。

1.5 芒果

Andrade等[18]应用2D-DIGE对比了芒果果实在呼吸跃变前期和呼吸跃变时的蛋白质丰度变化，利用LC-MS/MS
鉴定出47个差异蛋白点。结果显示，与激素合成相关的蛋白质丰度下降，而与分解代谢和胁迫反应有关的蛋白质在成熟过程中呈积累趋势。

1.6 番木瓜

Nogueira等[19]比较了番木瓜果实在呼吸跃变前期和呼吸跃变时的蛋白质组变化。运用质谱技术鉴定了37个显著差异的蛋白点，其中27种蛋白质被分为六大类，分别为糖代谢、次级代谢、乙烯的合成与调控、能量代谢、胁迫反应、贮藏蛋白。

1.7 杏

Ambrosio等[20]利用1D和2D技术分离了杏果实3个不同成熟阶段的蛋白质，在2D图谱上106个蛋白点呈现差异性积累，进一步运用MALDI-TOF-PMF和nanoLC-ESI-LIT-MS/MS对其进行鉴定，结果表明，大部分蛋白质作为酶类涉及糖类和能量代谢、有机酸代谢、乙烯的生物合成、细胞壁重建、胁迫响应等生化过程，另外一些与果实的感官品质密切相关，该研究提供了杏果实成熟过程的初步相关信息。

2 非跃变型果实

2.1 葡萄

Negri等[21]利用LC-ESI-MS/MS鉴定出葡萄皮中的69个蛋白点，这些蛋白质参与了胁迫反应（38%）、糖酵解和糖异生（13%）、碳化合物和糖代谢（13%）、氨基酸代谢（10%）等生理过程。在不同的成熟时期，葡萄皮中的蛋白质呈现差异分布，涉及光合作用、糖代谢和胁迫反应的蛋白质在颜色变化初期过表达，而在颜色变化后期，参与花青素合成的蛋白质过表达，在采收期，关键的防卫反应蛋白质丰度上调。需要特别指出的是，发现几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的丰度上调，与这些酶在成熟过程中的活性增加相一致[22]。Sarry等[23]提取了6个不同品种葡萄中果皮里的主要可溶性蛋白，在2D图谱上发现了大约300个蛋白点，利用MALDI-MS鉴定出67种蛋白质，分别参与了能量代谢（34%）、防卫和胁迫响应（19%）、初级代谢（13%）等过程，2-DE分析发现，脱水蛋白、蔗糖酶以及病程相关蛋白在成熟果实中大量积累，同时观察到乙醇脱氢酶和己糖转运蛋白在6个品种中的表达存在显著差异。Wang Wei等[24]运用蛋白质组学方法分析了β-1,3-葡聚糖酶在葡萄果实不同组织中的表达情况，结果表明，果皮中的β-1,3-葡聚糖酶丰度高于果肉中，说明其表达具有组织特异性，同时也暗示β-1,3-葡聚糖酶可能与葡萄果实的成熟有关。Zhang Jiangwei等[25]研究了葡萄原生质膜蛋白在成熟过程中的表达情况，鉴定出了62个蛋白点，包括ATP合成酶、GTP结合酶等，参与了转运、代谢、信号转导、蛋白质合成等反应。在果实成熟过程中，发现原生质膜蛋白总量逐渐下降，泛素水解蛋白和细胞骨架蛋白丰度上调，泛素结合酶E2-21丰度下调。Giribaldi等[26]的研究结果证明了在葡萄成熟过程中，大多数蛋白质与能量、代谢、蛋白质合成有关，少数与胁迫反应相关的蛋白质及多数与细胞结构相关的蛋白质进行了差异表达。

2.2 柑橘

Katz等[27]利用LC-MS/MS技术及已有的NCBI-nr和柑橘ESTs数据库分析了柑橘蛋白质组，从代谢的角度系统研究了柑橘成熟过程中的蛋白质变化情况。Muccilli等[28]运用2-DE结合LC-MS/MS鉴定出了成熟甜橙果肉中差异表达的55种蛋白质，其中与糖代谢有关的蛋白质在Moro中过表达，而与胁迫反应相关的在Cadenera中过表达，而且证实了在Moro中参与次级代谢和氧化过程的蛋白质在花青素合成的过程中具有重要作用。Pan Zhiyong等[29]通过2-DE结合MALDI-TOF-TOF MS分析了突变体“Hong Anliu”甜橙及其野生型4个成熟阶段果肉的蛋白质组变化，在鉴定出的74种差异表达的蛋白质中，大部分参与了胁迫响应，糖/能量代谢与调控及蛋白质命运、修饰与降解。尤其值得注意的是，在突变体中6种抗氧化酶的表达水平有所改变，分析其相对酶活发现突变体果实的抗氧化能力较强，暗示氧化胁迫对类胡萝卜素的形成有调控作用。钟凤林[30]以琯溪蜜柚汁胞为材料，利用双向电泳、质谱技术，对汁胞的不同发育阶段进行了差异蛋白质组学分析，建立了适合琯溪蜜柚汁胞蛋白质组学研究的技术平台，获得与汁胞发育、成熟和衰老相关的差异蛋白质，共检测到1037±60个蛋白质点，其中有100个蛋白质点在不同发育时期上调表达，217个蛋白质点下调表达，选取50个不同发育时期的汁胞差异蛋白质点进行质谱鉴定和生物信息学分析，根据蛋白质的功能可以把他们划分为调控蛋白、转录因子、能量代谢、细胞骨架、防卫反应、代谢酶等，为揭示琯溪蜜柚汁胞在发育成熟过程中某些关键的生理活动提供了一定的理论依据。

2.3 草莓

Bianco等[31]通过多维液相色谱-串联质谱、单向
SDS-PAGE结合纳升级液相色谱-串联质谱鉴定了蛋白质，利用DIGE技术研究了草莓果实成熟过程中差异积累的蛋白质，其中大多数参与了能量和碳代谢、蛋白质合成与贮藏、蛋白质水解、胁迫反应等过程，并关联了与果实品质相关的蛋白质表达。

2.4 荔枝

李开拓[32]以荔枝品种“乌叶”和“下番枝”果实为实验材料，利用双向电泳和质谱技术对荔枝果实不同成熟时期进行了差异蛋白质组学研究，获得了与荔枝果实成熟衰老相关的差异蛋白。这些蛋白质参与了糖和能量代谢、蛋白质合成与代谢以及稳定、基因表达调控、抗氧化、氨基酸代谢、信号转导等生理过程，该研究为揭示荔枝果实成熟过程中有关生理事件创造了良好的技术平台。

表 1 果实成熟衰老过程中差异表达蛋白质功能分类

Table 1 Functional classification of differentially expressed proteins during fruit ripening and senescence

综上所述，利用蛋白质组学技术鉴定出的果实成熟衰老过程中的相关蛋白质根据其生物学功能主要分为以下几大类（表1）。其中，普遍涉及了基础代谢、防卫胁迫反应和能量生成等过程，因而从蛋白质表达水平上揭示果实的成熟衰老机理提供了有力的依据。另外，线粒体是细胞内数量最多的细胞器，在能量产生以及细胞代谢中起主要作用，研究线粒体蛋白质氧化损伤将为活性氧调控果实成熟衰老的机制提供新的思路。

3 结 语

目前，蛋白质组学在果实成熟衰老研究中主要侧重于鉴定差异表达的蛋白质，并依据其生物学功能进行分类，但对这些蛋白质在其参与的重要生理代谢过程中的变化规律及作用的深入研究相对较少。一些细胞器，如线粒体、叶绿体、细胞核等在果实成熟衰老过程中发挥着重要作用，但对其相关蛋白质组的研究也鲜见报道。由于果实组织的结构特殊，加之种类繁多，成熟衰老过程多样，仅仅利用蛋白质组学技术难以全面揭示其成熟衰老机理。

因此，今后在运用蛋白质组学技术研究果实成熟衰老机理时，应在传统2-DE的基础上，着重利用非电泳分离技术如LC-MS/MS、同位素标记相对和绝对定量技术（isobarictags for relative and absolute quantitation，iTRAQ） [33]、同位素标记亲和标签（isotope-coded affinity tag，ICAT） [34]及Immunoblotting等，并结合EST数据库实现果实亚细胞蛋白质组学和定量蛋白质组学的研究。此外，蛋白质组学还需要与其他生物组学（转录组学[35]、代谢组学[36]）有机结合，才能深入了解关键蛋白质及编码相关蛋白的基因在重要生理活动中的准确作用，更全面和系统地阐明果实成熟衰老的分子机理。

参考文献：

[1] PRASANNA V, PRABHA T N, THARANATHAN R N. Fruit ripening phenomena: an overview[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2007, 47(1): 1-19.

[2] Palma J M, Corpas F J, Río L A. Proteomics as an approach to the understanding of the molecular physiology of fruit development and ripening[J]. Journal of Proteomics, 2011, 74(8): 1230-1243.

[3] BRADY C J. Fruit ripening[J]. Annual Review of Plant Physiology, 1987, 38: 155-178.

[4] 田世平, 罗云波, 王贵禧. 园艺产品采后生物学基础[M]. 北京: 科学出版社, 2011: 418-443.

[5] PARK O K. Proteomic studies in plants[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 37(1): 133-138.

[6] Jorrín-Novo J V, Maldonado A M, Echevarría-Zomeño S, et al. Plant proteomics update (2007—2008): second-generation proteomic techniques, an appropriate experimental design, and data analysis to fulfill MIAPE standards, increase plant proteome coverage and expand biological knowledge[J]. Journal of Proteomics, 2009, 72(3): 285-314.

[7] 张丽, 罗海波, 姜丽, 等. 果实成熟衰老过程中蛋白质组学研究进展[J]. 植物生理学报, 2011, 47(9): 861-871.

[8] Rocco M, D’Ambrosio C, Arena S, et al. Proteomic analysis of tomato fruits from two ecotypes during ripening[J]. Proteomics, 2006, 6(13): 3781-3791.

[9] Faurobert M, Mihr C, Bertin N, et al. Major proteome variations associated with cherry tomato pericarp development and ripening[J]. Plant Physiology, 2007, 143(3): 1327-1346.

[10] Barsan C, Sanchez-Bel P, Rombaldi C, et al. Characteristics of the tomato chromoplast revealed by proteomic analysis[J]. Journal of Experimental Botany, 2010, 61(9): 2413-2431.

[11] Konozy E H E, Rogniaux H, Causse M, et al. Proteomic analysis of tomato (Solanum lycopersicum) secretome[J]. Journal of Plant Research, 2013, 126(2): 251-266.

[12] Prinsi B, Negri A S, Fedeli C, et al. Peach fruit ripening: a proteomic comparative analysis of the mesocarp of two cultivars with different flesh firmness at two ripening stages[J]. Phytochemistry, 2011, 72(10): 1251-1262.

[13] Hu Hao, Liu Yong, Shi Guanglu, et al. Proteomic analysis of peach endocarp and mesocarp during early fruit development[J]. Physiologia Plantarum, 2011, 142(4): 390-406.

[14] Qin Guozheng, Meng Xianghong, Wang Qing, et al. Oxidative damage of mitochondrial proteins contributes to fruit senescence: a redox proteomics analysis[J]. Journal of Proteome Research, 2009, 8(5): 2449-2462.

[15] GUARINO C, ARENA S, SIMONE L, et al. Proteomic analysis of the major soluble components in Annurca apple flesh[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51(2): 255-262.

[16] Qin Guozheng, Wang Qing, Liu Jia, et al. Proteomic analysis of changes in mitochondrial protein expression during fruit senescence[J]. Proteomics, 2009, 9(17): 4241-4253.

[17] Toledoa T T, Nogueiraa S B, Cordenunsi B R, et al. Proteomic analysis of banana fruit reveals proteins that are differentially accumulated during ripening[J]. Postharvest Biology and Technology, 2012, 70: 51-58.

[18] Andrade J M, Toledo T T, NOGUEIRA S B, et al. 2D-DIGE analysis of mango (Mangifera indica L.) fruit reveals major proteomic changes associated with ripening[J]. Journal of Proteomics, 2012, 75(11): 3331-3341.

[19] Nogueira S B, Labate C A, Gozzo F C, et al. Proteomic analysis of papaya fruit ripening using 2DE-DIGE[J]. Journal of Proteomics, 2012, 75(4): 1428-1439.

[20] Ambrosio C D, Arena S, Rocco M, et al. Proteomic analysis of apricot fruit during ripening[J]. Journal of Proteomics, 2013, 78(14): 39-57.

[21] Negri A S, Prinsi B, Rossoni M, et al. Proteome changes in the skin of the grape cultivar Barbera among different stages of ripening[J]. BMC Genomics, 2008, 9: 378-396.

[22] Deytieux C, Geny L, Lapaillerie D, et al. Proteome analysis of grape skins during ripening[J]. Journal of Experimental Botany, 2007, 58(7): 1851-1862.

[23] Sarry J E, Sommerer N, Sauvage F X, et al. Grape berry biochemistry revisited upon proteomic analysis of the mesocarp[J]. Proteomics, 2004, 4(1): 201-215.

[24] Wang Wei, Bianchi L, Scali M, et al. Proteomic analysis of β-1,3-glucanase in grape berry tissues[J]. Acta Physiol Plant, 2009, 31(3): 597-604.

[25] Zhang Jiangwei, Ma Huiqin, Feng Jidong, et al. Grape berry plasma membrane proteome analysis and its differential expression during ripening[J]. Journal of Experimental Botany, 2008, 59(11): 2979-2990.

[26] Giribaldi M, Perugini I, Sauvage F X, et al. Analysis of protein changes during grape berry ripening by 2-DE and MALDI-TOF[J]. Proteomics, 2007, 7(17): 3154-3170.

[27] KATZ E, FON M, LEE Y J, et al. The citrus fruit proteome: insights into citrus fruit metabolism[J]. Planta, 2007, 226(4): 989-1005.

[28] Muccillia V, Licciardello C, Fontanini D, et al. Proteome analysis of Citrus sinensis L. (Osbeck) flesh at ripening time[J]. Journal of Proteomics, 2009, 73(1): 134-152.

[29] Pan Zhiyong, Liu Qing, Yun Ze, et al. Comparative proteomics of a lycopene-accumulating mutant reveals the important role of oxidative stress on carotenogenesis in sweet orange (Citrus sinensis [L.] osbeck)[J]. Proteomics, 2009, 9(24): 5455-5470.

[30] 钟凤林. 琯溪蜜柚汁胞发育过程的差异蛋白质组学研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2009.

[31] Bianco L, Lopez L, Scalone A G, et al. Strawberry proteome characterization and its regulation during fruit ripening and in different genotypes[J]. Journal of Proteomics, 2009, 72(4): 586-607.

[32] 李开拓. 荔枝果实成熟过程中的差异蛋白质组学研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2011.

[33] Wiese S, Reidegeld K A, Meyer H E, et al. Protein labeling by iTRAQ: a new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research[J]. Proteomics, 2007, 7(3): 340-350.

[34] Shiio Y, Aebersold R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry[J]. Nature Protocols, 2006, 1: 139-145.

[35] Hegde p s, White i r, Debouck c. Interplay of transcriptomics and proteomics[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14(6): 647-651.

[36] Hollywood k, Brison d r, Goodacre r. Metabolomics: current technologies and future trends[J]. Proteomics, 2006, 6(17): 4716-4723.