食物过敏原重组蛋白的研究进展

孟轩夷1,2，李 欣1,3，高金燕1,3，陈红兵1,2,*

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；

3.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330047）

摘 要：食物过敏原蛋白单一组分的品质是制约食物过敏研究的关键因素之一。通过大肠杆菌、酵母表达系统生产出的过敏原重组蛋白，具有产量高、纯度高、均一性好等优点，已在过敏原蛋白标准物质的制备、食物过敏原的检测、低致敏性蛋白的生产以及其他基础研究等方面得到了具体的应用。食物过敏原重组蛋白作为天然过敏原提取物的替代物显示了巨大的发展潜力。总之，DNA重组技术是制备高品质过敏原蛋白的一条崭新途径。

关键词：食物过敏原；基因表达系统；重组蛋白

Research Progress in Recombinant Proteins of Food Allergens

MENG Xuan-yi 1,2, LI Xin1,3, GAO Jin-yan1,3, CHEN Hong-bing1,2,*

(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;

2.Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China;

3. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract: The quality of single component of the food allergen protein plays a key role in food allergies research. Recombinant proteins prepared by E. coli or yeast expression system have a number of advantages, such as high efficiency, high purity, good homogeneity and so on, which have been applied in the preparation of reference material, allergen detection, the production of hypoallergenic protein and laboratory research. Recombinant food allergens used as the substitutes for natural allergen extracts have shown great potential to provide a new way to produce standard allergen proteins with high quality.

Key words: food allergens; gene expression system; recombinant protein

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）07-0276-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201407054

食物过敏是指人体摄入食物中某种成分，即变应原或过敏原后，机体对之产生的异常免疫反应，导致机体生理功能的紊乱和/或组织损伤，进而引发的一系列临床症状。近年来，全球食物过敏的发生率已呈上升趋势，已经严重地影响了部分人群的生活质量甚至危及生命[1]。据报道，170多种食物能够引起过敏反应，其中，90%以上过敏反应是由八大类高致敏性食物引起，包括牛乳、蛋类、花生、大豆、小麦、坚果、鱼和水生贝壳类动物[2]。因此，对高致敏性食物过敏原的研究迫在眉睫。

目前在食物过敏原研究中用到的主要是天然过敏原的提取物，然而天然提取物存在许多不能克服的缺点[3]。首先，在提取过程中，致敏组分与非致敏组分同时存在，导致提取物中组分复杂，难以制备高纯度的单一过敏原；第二，许多实验表明[4]，提取物中引起过敏症状的致敏原不仅含量不足，而且含量、生物学活性因厂家、批次不同，致使过敏原很难标准化、不具有可比性[5-6]，不仅不利于食物过敏原的检测，也很难找到与特异性IgE抗体相对应的过敏原[7-8]；第三，天然过敏原提取物在加工提取和贮藏的过程中，其中固有的酶也能导致蛋白降解，导致其生物学活性降低。

相比之下，通过重组技术获得食物过敏原重组蛋白是一条崭新的途径，它避免了天然过敏原提取物中的诸多不足。食物过敏原重组蛋白具有分子质量确定、质量稳定、纯度高以及产量高等优点，而且其理化性质和免疫学特性与天然过敏原相似，可以作为天然过敏原提取物的替代品用于食物过敏原的研究[9]。不仅如此，通过基因工程方法还可以对食物过敏原中的序列和结构进行一定的修饰，从而达到降低致敏性的目的[10]。目前研究者已在八大类高致敏性食物过敏原蛋白中进行了尝试，并取得有效的成果。

1 食物过敏原重组蛋白的表达系统

目前通过DNA重组技术表达蛋白已成为一种常规方法，不同蛋白在不同系统中表达水平有显著的差异，生产食物过敏原重组蛋白的主要表达系统是大肠杆菌（E.coli）表达系统和酵母表达系统。

1.1 大肠杆菌（E.coli）表达系统

大肠杆菌表达系统是目前最为成熟的表达系统[11]。大肠杆菌具有遗传背景清楚、培养条件简单、生长繁殖快、基因操作容易、表达异源蛋白周期短、价格低廉以及可以快速生产目的蛋白等优点，也是最早应用于外源蛋白表达的菌株。该系统在生产花生、大豆、鱼虾等多种高致敏性食物过敏原重组蛋白中已有很大的进展。如，Kleber-Janker等[12]采用改良后的BL21（DE3）E.coli细胞（BL21-CodonPlus（DE3） -RIL），制备了花生主要过敏原Ara h 2，产率达到30mg/L，比在传统细胞BL21（DE3）E.coli中的表达量高100倍以上；Liu Bin等[13]将大豆过敏原蛋白P34（Gly m Bd 30K）基因成功地在E.coliBL21（DE3）中表达，其表达量达到12 μg/mg；Myrset等[14]将北欧虾主要过敏原Pan b 1（原肌球蛋白）在E.coli Rosetta TM 2（DE3）中进行表达，表达量比之前Albrecht等[15]报道的表达量（5mg/L）高80倍。

虽然大肠杆菌应用广泛，然而大肠杆菌还存在一些局限性，无法对表达蛋白进行正确折叠和糖基化、磷酸化及酰基化修饰；且存在重组蛋白不能有效分泌到胞外，常常在胞内形成不溶性包涵体等缺点[16]。

1.2 酵母表达系统

酵母菌是一种单细胞的低等真核生物，能够完成翻译后的修饰，包括信号序列的处理、折叠加工、二硫键的形成以及脂肪和碳水化合物的添加[17]。与大肠杆菌相比，酵母菌可以对异源蛋白进行糖基化修饰，表达需要糖基化的蛋白[18]。而且酵母具有安全可靠、生长迅速、培养周期短、操作简单等优点，已成为真核生物表达系统中最为普遍的一种[19]。酵母主要包括酿酒酵母和毕赤酵母，其中毕赤酵母表达系统是最常用的酵母表达系统，该系统能使原本在胞内形成不溶性包涵体的重组蛋白以可溶性形式表达，而且还可以克服异源蛋白降解问题[17]。

据报道，已有超过200种外源蛋白成功地在毕赤酵母中得到表达[20-21]。如，Kim等[22]用毕赤酵母高效表达了牛乳中高致敏性过敏原β-乳球蛋白，其产量超过1g/L；Diaz-Perales等[23]在毕赤酵母中表达了桃的主要过敏原Pru p 3，
通过圆二色谱分析，重组Pru p 3的蛋白折叠结构与天然Pru p 3
相同，说明了酵母能对外源蛋白进行正确的折叠。此外，Cregg实验室1993年就建立起了通过毕赤酵母表达外源蛋白的网站[24]。由于毕赤酵母能够对过敏原重组蛋白进行正确的折叠，且能保持与天然蛋白相同的结构，为过敏原致敏性的研究提供了正确的表位，因此，研究毕赤酵母对食物过敏原重组蛋白的表达有重要的发展意义。

2 食物过敏原重组蛋白的应用

目前通过大肠杆菌或酵母表达系统表达出的重组蛋白已经在过敏原标准物质的制备、食物过敏原的检测以及低致敏性蛋白的制备等方面得到了广泛的应用。

2.1 制备过敏原标准物质候选物

众所周知，由于缺乏统一的食物过敏原蛋白标准物质，使得对过敏原成分的定性、定量检测结果无法溯源到一个统一的标准，因此给食物过敏原蛋白的检测造成极大障碍。因此，通过基因工程的手段生产过敏原重组蛋白是制备食物过敏原标准物质的重要途径。

如，Himly等[25]通过SDS-PAGE、等电点聚焦以及脱酰胺基对制备的重组桦树花粉过敏原Bet v 1.0101 Y0487进行分析，表明该重组蛋白的均一性大于99.9%；通过人血清IgE ELISA显示Y0487与天然Bet v 1的IC50一致；通过IgE和IgG免疫印迹发现Y0487与天然Bet v 1在诱导嗜碱性细胞和T细胞活化方面具有相同的作用。以上说明重组Bet v 1.0101 Y0487具有稳定性高、免疫活性和单体结构与天然Bet v 1相同的优点，可以作为标准Bet v 1的候选物。尽管有成功的研究，但目前国内外对于食物过敏原蛋白标准物质的研究尚处起步阶段，其中标准化的重组过敏原种类不多。如，由欧盟资助的CREATE项目仅仅确定了3种重组过敏原（rBet v 1、rPhl p 5a和rDer p 2）可以作为有证标准物质候选物。但早期的研究工作为以后食物过敏原重组蛋白标准化的研究奠定了基础，提供了有利的借鉴作用[26-27]。因此，继续通过分子克隆技术得到食物重组过敏原，与天然过敏原进行比对成为候选标准物质，进而作为标准物质的研究具有很大的发展意义[28]。

2.2 食物过敏原的检测

食物过敏原重组蛋白具有产量高、纯度高、性质稳定、均一性好等优点。因此，利用重组蛋白制备单（多）克隆抗体可提高食物过敏原检测的灵敏性与特异性[29]。利用此技术在大豆过敏原检测方面最为常见，如邹菊等[30]以大豆主要过敏原重组蛋白P34（Gly m Bd 30K）为抗原，制备单克隆抗体，并建立双单抗夹心ELISA检测方法，该方法的检出限为4 μg/L，标准曲线在4～125 μg/L的线性良好范围内。之后，Liu Bin等[13]通过重组表达过敏原P34制备多克隆抗体（pAB-P34），利用iELISA法检测出大豆种子和豆粕中P34含量分别为4.62 μg/mg和3.91 μg/mg，且P34重组蛋白重复实验变差系数少于7.77%，说明iELISA法具有很高的重现性和准确性。因此，基于重组蛋白P34制备的单（多）克隆抗体可以对不同大豆品种中主要过敏原P34进行检测。

另外，最近几年蛋白质芯片技术发展很快，具有高通量、检测灵敏、样品用量少等特点，显示了在过敏原检测方面的优越性。如，Lin Jing等[31]通过合成含有牛乳主要过敏原表位的蛋白芯片，建立了运用蛋白芯片技术对牛乳过敏原表位进行定位的方法。该技术不仅重现性与灵敏性较好，而且可以缩短检测时间，还能同时检测出多种过敏原[32]。如，Bublin等[33]利用重组蛋白建立检测猕猴桃中过敏原的蛋白芯片方法，检测结果显示猕猴桃过敏阳性血清IgE抗体能够检测到单一的抗原，包括Act d 1、Act d 9、Act d 7，且阳性检测率分别为45%、27%、13%。

2.3 制备低致敏性的食物过敏原

日常生活中，人们经常食用花生、荞麦、果蔬等多种过敏原，对食物过敏的人群在实践中很难完全避免与食物过敏原的接触。然而天然过敏原具有较强的致敏性，在治疗过程中存在一定的危险性。因此运用重组技术制备低致敏性的食物过敏原重组蛋白具有重要的意义，为过敏反应的临床治疗提供了前提条件。

目前，在制备过敏原重组蛋白过程中，通过基因突变制备低致敏蛋白是一种全新的策略，将其分子中的IgE结合表位通过定点突变诱导的方法进行修饰，使其致敏性降低或消失。如，Bannon等[34]通过对花生过敏原（Ara h 1、
Ara h 2和Ara h 3）的IgE结合表位进行定点突变得到重组的花生过敏原蛋白，经过免疫印迹分析，rAra h 1、rAra h 2和rAra h 3的IgE结合能力分别降低了35%、71%和41%。Yang Zhenhuang等[35]则利用定点诱变技术得到苦荞麦主要过敏原Fag t 1的3个重组产物（Fag t 1-rs1、Fag t 1-rs2和Fag t 1-rs3），通过iELISA法分析，Fag t 1与天然Fag t 1相比，其IgE结合能力非常弱（P＜0.001）；与rFag t 1
相比，其免疫活性至少降低90%。Tordesillas等[36]发现香瓜中主要过敏原Cuc m 2中一个构象性表位可与许多花粉抑制蛋白发生交叉反应，通过定点诱变该特异性Cuc m 2表位中丙氨酸，得到2个突变体（Mut 1和Mut 2）。经过BAT（嗜碱细胞活化实验）和SPT（皮肤点刺）实验发现，Mut 1比天然Cuc m 2的IgE结合能力低，而且其免疫活性与rCuc m 2很相似；而Mut 2的IgE结合能力降低为原来的57%，而且Mut 2和rCuc m 2在诱导T细胞增殖和细胞因子方面具有相同的作用。Bolhaar等[37]对苹果主要过敏原Mal d 1中的5个位点（T10PI30V、T57N、T112C和I113V）进行突变，得到低致敏性rMal d 1的突变体，通过RAST分析显示，rMal d 1mut的IgE活性比野生型分子的活性降低了1/2，同时SPT和BHR分析rMal d 1mut的生物学活性降低幅度为1/2～1/200。

近几年通过重组技术制备低致敏性食物过敏原的种类日益增加，这些过敏原主要作为特异性免疫治疗的替代品[38]。为了更大程度地提升特异性免疫治疗的安全性和疗效，利用低致敏性食物过敏原制备的免疫疫苗将是未来有效治疗食物过敏反应的发展方向[39]。

2.4 其他应用

食物过敏原重组蛋白的应用很多，不仅仅局限于以上所介绍的方面。利用重组技术定位过敏原蛋白的表位就是一个重要的研究方向，已在坚果、虾、水果等多种食物过敏原方面得到广泛应用。如，Sharma等[40]通过重组山核桃主要过敏原Car i 4发现，该重组蛋白的酸性亚基序列的强活性肽处于3个独立的表位区域（118～132，208～219，238～249）；Reese等[41]对虾主要过敏原Pen a 1
中8个主要IgE结合表位中的12个氨基酸进行突变，得到重组蛋白VR-9/1，通过介质释放实验表明，小鼠模型中VR-9/1过敏反应的效价在小鼠IgE 抗体的主要结合表位处显著降低；Rodriguez-perez等[42]以重组桃过敏原Pru p 3的2个亚型Pru p 4.01和Pru p 4.02为实验材料，探索其与Bet v 2
的交叉反应，结果发现植物食品和花粉过敏性抑制蛋白的相似程度大于70%。不仅如此，重组蛋白还可以很好地应用在过敏原结构研究中。如，Tatsumi 等[21]利用重组技术得到了β-乳球蛋白亚型A的3个特异性糖基化位点（D28N、D137N/A139S和P153A）的突变体，通过内荧光、圆二色谱以及单克隆抗体的酶联免疫吸附实验分析表明，3个特异性糖基化位点由于被高甘露糖链位点所覆盖，使得β-乳球蛋白亚型A的结构没有本质上的破坏，展示了重组的3个糖基化突变体与野生型β-乳球蛋白有相同的β-折叠结构。

3 结 语

过去10年通过重组DNA技术生产的过敏原重组蛋白已得到应用，很大程度上提高了我们对食物过敏原的认识。通过基因表达系统得到的重组蛋白，具有高产量、高品质以及均一的物理、化学和免疫学特性等优点，可以很好地作为天然过敏原的替代物，用于解决食物过敏问题。

但是，不同的食物过敏原蛋白氨基酸组成结构不一样，并且具有不同的线性表位和构象性表位等特点，需要选择不同的表达系统来满足个性化需求。另外，科研、医疗和工业生产中需要大量过敏原蛋白，因此高产量表达并降低制备成本是过敏原重组蛋白需首要突破的两个问题。

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