电化学纳米免疫传感器在食品安全检测中的应用展望

鲁丁强，庞广昌*

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

摘 要：电化学纳米免疫传感器具有检测快速、灵敏、操作简单等优点，在医药、食品、环境及生命科学等领域显示了巨大的应用潜力。本文分析比较了电化学纳米免疫传感器与分析化学仪器检测、免疫检测、以聚合酶链式反应为基础的分子生物学测定技术和基于表面等离子共振、生物薄膜干涉技术的检测方法的优缺点，讨论了电化学纳米免疫传感器本身所面临的免疫结合信号放大处理和商业化应用的两个关键问题，最后，概述了纳米材料在免疫传感器中的应用及电化学纳米免疫传感器在食品检测中的应用并对其在食品检测领域的未来发展作了展望。

关键词：电化学；纳米材料；免疫传感器；食品检测；抗体

Recent Development and Application of Electrochemical Nanometer Immunosensors in Food Detection

LU Ding-qiang, PANG Guang-chang*

(Tianjin Key Laboratory of Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,

Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Abstract: Electrochemical nanometer immunosensor has the characteristics of simple operation, accuracy, high sensitivity and good selectivity, where biological sensing chips are used to detect the interaction between antigen and antibody. It has a wide range of applications in the fields of medicine, food, environmental monitoring, drug screening and life science. In this paper, we compare electrochemical nanometer immunosensor with instrumental analysis, immunological detection, polymerase chain reaction (PCR)-based molecular biology detection techniques and surface plasmon resonance (SPR)- and biolayer interferometry (BLI)-based detection techniques for their advantages and drawbacks. We also discusse the two key issues electrochemical nanometer immunosensor itself is facing: immune binding signal amplification processing and commercial application. Finally, we overview the current applications of nanomaterial in the immunosensor and those of electrochemical nanometer immunosensor in food detection, and discuss its future prospects in this area.

Key words: electrochemical; nonmaterial; immunosensor; food detection; antibody

中图分类号：TS252.7；O657.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0006-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408002

随着科学技术的不断进步，食品安全检测技术已经取得了举世瞩目的成就，但是现有的检测方法大多集中在分析化学仪器检测、免疫检测、以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的分子生物学测定技术等方面。其中化学测定除对仪器设备的依赖性很大外，因其选择性不强，往往需要对原始样本进行预处理，从而限制了这些方法的广泛使用。而PCR方法的灵敏度高，特异性强，但需要对靶分子进行级联放大后才能检测，耗时较长，而且难以实现真正意义上的定量测定。传统的免疫测定方法特异性强、灵敏度高、不需要对原始样本进行特殊处理，但是本质上属于定性或半定量方法，而且不能实现在线或即时检测。生物传感器方法具有特异性强、定量、可以即时和在线检测等优点，但是除酶传感器以外，大多数还停留在研究阶段。尽管基于表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）和生物薄膜干涉（biolayer interferometry，BLI）技术的仪器已经上市，但是要真正用于食品安全检测尚需努力，而且其相应的仪器设备精密度和成本偏高，难以适应真正意义上的定量测定，特别是快速和在线检测。电化学免疫传感器是基于抗原与抗体的反应进行特异性的半定量或者定量测定的一种以与电化学的传感单元直接接触的抗体或者抗原作为分子识别单元，而且通过传感单元把化学物质的浓度信号转换成相应的电信号的自给式集成元件[1]­，通过纳米材料及酶等的信号放大作用，具有特异性强、种类多、测试耗费低、灵敏度高、准确性好、适用面宽等特点。在食品检测、基础和应用电化学研究、环境分析、材料分析及医疗分析与诊断等领域应用广泛[2]。

1 生物传感器概述

生物传感器由于其识别元件是酶、受体、抗体等具有特异性识别能力的生物大分子，所以其特异性识别作用或快速催化作用的特点恰恰可以满足快速、特异性，能够实现即时和在线检测的要求。目前，国内外在生物传感器的研究方面都投入了大量的精力。例如利用酶的识别作用研制出可以检测乙醇、乳糖、蔗糖、乳酸等食品成分的酶生物传感器。同时还有检测甲醇、甲醛等可用于安全检测的酶传感器。生物传感器最活跃的一个领域应该数免疫传感器的研究。免疫传感器的特异性识别分子是抗体，从理论上讲，所有可以作为抗原的生物大分子，如蛋白质、微生物等，以及作为半抗原的化合物，如抗生素、激素、毒素、农药等都可以制备其特异性的识别抗体，从而实现特异性、快速、即时和在线检测。广义的免疫传感器包括酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫技术和免疫胶体金试纸条技术。事实上，这方面的研究与成果已经得到了极其广泛的应用。但是由于ELISA和试纸条技术实际上只能进行定性或半定量检测，再加上数据处理和加样方式的限制，要实现即时、准确定量和在线检测几乎是不可能的。所以免疫传感器的研究更多地集中在如何准确定量测定到抗原抗体结合的信号变化及其处理方面。根据其信号转换方法，免疫传感器大致分为4 类：电化学、光学、压电和测热免疫传感器[3]­。

经过多年的研究，国外已经在利用光学SPR和BLI技术，通过测定抗体和待测菌的特异性抗原的结合情况检测病原菌方面取得突破性进展，相关的仪器设备也已经上市销售，但是该技术依然是依据ELISA或芯片技术原理进行设计，能够实现对抗原的高通量的测定，广泛用于分子互作研究、药物的高通量筛选和分子生物学研究等，但是不能实现真正意义上的定量分析，而且其仪器设备要求精度高、价格昂贵，不能实现在线检测。尽管如此，该技术在食品安全检测方面仍然具有广泛的应用前景，已经受到科学家和企业家的密切关注，尽管在病原菌检测方面仍然处于研究阶段。

2 电化学免疫传感器概述

电化学免疫传感器是另一个备受关注的研究方向，这主要是因为电化学传感技术已经非常成熟和普及，如果能够将抗原和抗体的结合信号转化成电化学信号，再经过放大和处理，就可以实现利用电化学信号系统对抗原、半抗原或者带有该抗原的病原菌进行快速、特异性定量检测。在这方面面临的关键问题是：抗原和抗体结合的微弱信号如何能够转化成足够强的电化学信号，再进行放大处理[4]。

用来提高抗原和抗体结合后的电化学信号变化的方法有：利用辣根过氧化物酶[3,5]、碱性磷酸酶[6] 、漆酶[7]和葡萄糖氧化酶[8]；利用纳米粒子增加抗体的特异性吸附并提高吸附量和量子点；寡核苷酸和染料用来标记所发生的信号变化[9]。这些方法的单独和联合使用可以大大提高检测抗原抗体结合的灵敏度[10]。Castaneda等[11]设计了一个抗原-抗体结合所产生的信号转化为电化学信号，再通过催化吸附在纳米金粒子上的对硝基酚进行信号放大的传感器。Mao Xun等[12]则利用他设计的基于纳米金免疫传感器成功检测了人IgG。此外，纳米材料和酶可以用来在抗原抗体结合时放大电化学信号，Mackey等[13]通过将抗人IgG进行辣根过氧化物酶标记后吸附到纳米金粒子上制成电化学免疫传感电极，结果使其测定灵敏度高于ELISA，达到260 pg/mL。电化学免疫传感器的另一个关键性问题是如何为电极吸附更多的抗体，最好的方法就是纳米材料的利用。目前这方面已进行了大量研究，所用的纳米材料主要有3 种：碳纳米管[14]、纳米金粒子[15]和石墨[16]，并取得了较为理想的研究结果[17-18] 。

在免疫传感器方面，一个主要的挑战是如何实现商业化应用。因为其商业化应用面临诸多关键问题：1）必须能够实现快速、定量和大规模的样品测定。2）高度的特异性，不能有交叉反应形成明显干扰。3）高质量的操作规范。4）测定费用可以接受。5）重复性和灵敏度足够高[19]。6）再生性能性好，半寿期足够长。解决这些问题主要途径是：1）增加测定灵敏度、提高抗体吸附量以增加其测定样品数量；2）增加纳米免疫电极的半衰期和再生能力。

3 纳米材料在免疫传感器中的应用

3.1 纳米材料

纳米材料[20-21]是一种超细的固体材料，即其在微观结构上至少有一维方向受纳米级尺度（1～100 nm）所调制，具有表面效应、体积效应、量子效应和宏观量子隧道效应。此外，由于纳米材料还具有特殊的光学性质、催化性质、光电化学性质以及良好的吸附能力和生物兼容性等特点，被广泛应用于免疫传感器研究，可显著提高生物分子的吸附量，同时放大电信号，从而使传感器的灵敏度、寿命、稳定性等得以提高[22]。

纳米材料（例如：纳米金）与抗体的结合，一般认为是纳米金表面负电荷和抗体的正电荷基团因静电作用而吸附，并形成Au-S等稳定化学键作用。汤俊琪等[23]报道了免疫酶吸附法评价纳米金对抗体Fc端的吸附效果，表明纳米金吸附主要是在抗体Fc端，且吸附率达到92%，抗原结合部位Fab端裸露在外，可与抗原发生特异性反应，纳米材料的使用不仅可以增大抗体吸附量，同时也保证了传感器的稳定性。

由于纳米材料可以增加其操作的选择性和特异性识别分子的量，所以大大增加检测灵敏度。因为极低水平的致病菌足以造成食品安全隐患，所以各国都规定食源性病原菌不得检出。也就是说，增加测定灵敏度是保证食品安全的关键[24]。此外，纳米免疫技术不仅可以用来提高食源性病原菌的检测限，而且用来提高对毒素、蛋白质营养成分、抗生素、农药等的检测灵敏度[25-26]。在生物传感器中，纳米材料可以大大增加吸附识别分子的特异性和表面，从而增加检测靶分子的灵敏度和测定量，这对于提高测定靶细胞（病原菌）的灵敏度至关重要[27]。研究结果证明应用纳米生物传感器检测E. coli O157∶H7的灵敏度比ELISA或异硫氰酸荧光素灵敏度提高了16 倍[28]。为适应食品安全检测的要求，往往需要测定到单个细菌细胞的水平，显然更需要纳米技术的帮助[29]。

3.2 纳米材料在生物传感器中的应用

通过抗细菌的特异性抗原制备抗体，在经过纳米材料吸附抗体来完成食源性病原菌的测定一直是一个热点领域。病原菌的QDs（量子点）荧光标记被用来测定食源性病原菌，如：单增李斯特菌[30]、致病大肠杆菌
（E. coli O157∶H7）[31]和志贺氏菌（Shigella flexneri）等[32]。
一项对白条鸡洗涤液中鼠伤寒菌的QDs为基础的免疫测定中，灵敏度可以达到103 CFU/mL[33]。这些纳米粒子上结合事件的发生点数和位置可以通过定位性SPR、LSPR（localized SPR）或纳SPR进行测定[34-35]。Marinakos等[36]
用固定了抗体的纳米金粒子同时测定了E. coli鼠伤寒菌的LSPR变化，结果表明，检测限达到102 CFU/mL，比传统检测时间减少30 min，Wang Chungang等[37]用此方法结合抗体连接的纳米金粒子双光子瑞利散射测定E. coli O157∶H7，其检测限达到50 CFU/mL。Andre等[38]
用间接抗沙门氏菌多克隆抗体吸附在纳米磁珠上，然后再和含沙门氏菌样品液（含沙门氏菌的脱脂奶样品）混合培养，通过微分脉冲伏安法进行测定，检测限达到143细胞/mL。并在103～106 细胞/mL呈线性关系。Kang Xinhuang[39]和Wu Hong[40]等研究小组等报道了以天然分子壳聚糖分散石墨烯并结合铂纳米颗粒制备的葡萄糖氧化酶传感器，研究表明，由于石墨烯的加入使得该新型传感器展现出良好的稳定性和抗干扰能力，具有灵敏度高、响应快、检测限低等优点。韩玉花[41]报道了一种基于金包覆磁性纳米粒子的电位型免疫传感器检测小鼠的IgG，该传感器的响应电位与抗原（小鼠IgG）质量浓度的对数在2×10－5～1×104 ng/mL范围内呈良好的线性关系，检测下限为3.1×10－4 ng/mL，响应时间为8 min。该传感器的制备方法简单、无需标记过程、成本低廉、响应灵敏、性能稳定，具有潜在的应用前景，对制备其他类型免疫传感器具有重要参考价值。闵红等[42-43]将金掺杂的四氧化三铁纳米颗粒用壳聚糖交联后制备生物传感器，在检测有机磷农药时发现，在优化条件下，对有机磷农药敌敌畏线性检测范围为8.0×10–13～1.0×10–10 mol/L，
最低检出限达到4.0×10–13 mol/L，远远优于我国GB/T
5009.20—2003《食品中有机磷农药残留量的测定》（0.1 mg/L）。另外，在以壳聚糖为交联剂制备金掺杂的二氧化钛复合纳米粒子修饰电化学传感器对有机磷农药对硫磷进行检测研究时发现，金掺杂二氧化钛复合纳米粒子大的比表面积能增加对底液中对硫磷吸附量，提高检测灵敏度；所制备电化学传感器利用示差脉冲伏安法在最优条件下对对硫磷进行检测，检测范围为1.0～7.0×103 ng/mL，检测限达到0.5 ng/mL。

4 电化学纳米免疫传感器在食品检测方面的应用

电化学免疫传感器由于具有高灵敏度、低成本、灵活便携等优点，在食品安全检测方面有着巨大的应用前景，以下从蛋白分子、细菌、毒素及农药残留几方面简要叙述。

康晓斌等[44]研制的牛IgG电流型纳米免疫传感器定量检测牛初乳制品及乳制品中牛IgG的含量，以响应电流的变化率ΔI对牛免疫球蛋白G的质量浓度的对数做图，结果表明，该传感器在牛IgG质量浓度0.1～10 000 ng/mL范围内呈线性相关关系，与传统检测方法相比较，无需对检测样品进行提取或预浓缩等复杂的前处理，检测灵敏度高，操作简便快捷，但仅仅可以保存15 d左右，寿命较短。

Geng Ping等[45]报道了一种阻抗型电化学免疫传感器检测河水中的大肠杆菌，该传感器线性范围在3.0×103 ～
3.0×107 CFU/mL，最低检测限达到1.0 ×103 CFU/mL，同样也存在寿命较短的问题。Kang Xiaobin等[46]研制的双层纳米金蜡样芽胞杆菌免疫传感器以电流在免疫前后的变化率ΔI与蜡样芽孢杆菌的菌落数 （用甘露醇卵黄多粘菌素培养基进行平板菌落计数）作图，结果该传感器的响应电流与菌浓度在5×101～5×104 CFU/mL范围内呈线性关系，以3 倍空白值的标准偏差计算该传感器的检测限为10 CFU/mL，灵敏度可与PCR检测方法相媲美，几乎达到了细菌检测的极限，但保存20 d后电流响应信号为初始电流的93.56%，表明使用寿命也较短。

Masoomi等[47]报道了一种检测黄曲霉素B1非酶标记电化学纳米金免疫传感器，响应范围0.6～110 ng/mL，
最低检测限为0.2 ng/mL；Zhou Linting等[48]报道了一种检测黄曲霉毒素B1的超灵敏电化学纳米免疫传感器，其响应范围为3.2×10－16～0.32×10－13 mol/L，
最低检测限为1×10－16 mol/L（RSN=3），可稳定保存26周；Li Zaijun等[49]也报道了一种检测蜂蜜中黄曲霉毒素B1的阻抗型免疫传感器，阻抗响应范围为0.1～10 ng/mL，
最低检测限为0.01 ng/mL，在4 ℃保存180 d后仍具有95%的活性，且不受黄曲霉毒素B2、G1、G2和M1的干扰；Gautam等[50]报道了一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的阻抗型免疫传感器，灵敏度可达0.001 ng/mL。对黄曲霉毒素的检测近年来发展迅速，无论是灵敏度或者稳定性上都体现了电化学免疫传感器巨大的应用潜力。

杜淑媛[51]报道的克百威农药残留检测用电化学免疫传感器，在最优条件下其具有较宽的线性范围：0.1 ng/mL～
1 μg/mL，检测限为0.021 ng/mL （RSN= 3），保存15d后响应电流保留了原来的93.5%，尽管农药生物传感器发展速度很快，但商业化产品的研制仍处于初期阶段，还有待于进一步的发展。

5 展 望

电化学纳米免疫传感器是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展起来的具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的生物传感器，同时结合纳米材料良好的吸附能力、表面效应、小尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等特点[51]，大大提高了传感器灵敏度、稳定性和抗体分子吸附量。更重要的是，目前已有抗体（病原体、毒素、肿瘤表面标记物、遗传标记、细胞因子、抗生素、农药）绝大多数都是以Balb/c小鼠制备的单克隆抗体。显然，这可以成为一个针对目前所制备的非常广泛的单克隆抗体的检测平台，因为其抗体来源于一个相同的无性系小鼠，其Fc序列、结构和功能是相同的，因此，其操作和检测方案是基本相同的，而且还可以针对需要随时通过成熟的杂交瘤技术定制待测靶标的单克隆抗体。电化学纳米免疫传感器将在食品检测领域发挥极其重要的作用。但就目前来说，电化学纳米免疫传感器的发展仍面临着多方面挑战，需要在使用寿命、再生性、稳定性等方面投入更多精力，从而推进其商品化应用进程。

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