微型丝网印刷电极快速检测克仑特罗的方法

梁 桦1，宋 伟2，许丹科2，刘 英3，钟文英1,*

（1.中国药科大学理学院，江苏 南京 211198；2.南京大学化学化工学院，江苏 南京 210093；

3.南京祥中生物科技有限公司，江苏 南京 210022）

摘 要：研制能用于96孔酶标板快速检测的微型丝网印刷电极，并建立克仑特罗的电化学分析方法。通过间接竞争免疫反应与计时电流法相结合实现克仑特罗的残留量的定量测定。实验中考察并优化免疫反应与酶催化反应的条件。结果表明：在优化的条件下，克仑特罗标准溶液质量浓度在0.025～2.0 μg/L范围内呈现良好线性关系（r为0.9992）。采用本实验方法检测猪肉和猪尿中克仑特罗的结果与商品化ELISA试剂盒一致。本方法检测限分别为0.18 μg/L和0.05 μg/L，比ELISA试剂盒检测限低一个数量级。

关键词：微型丝网印刷电极；克仑特罗；计时电流法；电化学免疫传感

On-site Electrochemical Detection of Clenbuterol Based on Mini-Screen Printed Electrodes

LIANG Hua1, SONG Wei2, XU Dan-ke2, LIU Ying3, ZHONG Wen-ying1,*

(1. School of Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China;

2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093, China;

3. Nanjing Xiang Zhong Biotechnology Co. Ltd., Nanjing 210022, China)

Abstract: An electrochemical sensing method for the detection of clenbuterol (CLB) was developed based on mini-screen printed electrodes and 96-well microtiter plate. Clenbuterol residues were indirectly detected by combined use of indirect competitive immunoreaction and chronoamperometry. The immune reaction and enzymatic reaction conditions were investigated. Under the optimized conditions, the results showed that the electrochemical immunosensor produced a linear range of 0.025–2.0 μg/L with a correlation coefficient of 0.999 2. The analytical results of CLB residues in pork and swine urine samples were consistent with those obtained with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plate. The detection limits for pork and swine urine samples were 0.18 μg/L and 0.05 μg/L, respectively, showing a decrease of one order of magnitude in comparison with those of ELISA.

Key words: mini-screen printed electrode; clenbuterol; chronoamperometry; electrochemical immunosensor

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0099-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408019

克仑特罗（clenbuterol）俗称瘦肉精，属于β-兴奋剂，近年来被非法添加到饲料中以促进动物骨骼肌的生长和提高瘦肉率，因其添加剂量是治疗剂量的5～10 倍，并且在动物体内残留量过高而给消费者带来危害，所以对食品中克仑特罗的检测尤为重要[1-2]。目前克仑特罗检测方法主要有色谱方法和免疫分析技术。高效液相色谱法[3-4]具有灵敏、准确的特点，但仪器成本高，不适合样品筛选和现场快速检测。免疫分析技术包括胶体金试纸条[5-6]和酶联免疫法[7-8]。胶体金试纸条具有测定简单、快速、成本低等特点，但难于准确定量。酶联免疫分析方法具有灵敏度高、可定量检测，适合样品快速筛选分析，然而由于目前酶联免疫检测中采用光学酶标仪体积较大，一般不适宜携带进行现场的快速检测。

电化学分析方法具有灵敏度高、仪器易于小型化、操作简单等特点，获得了广泛的关注。电化学分析中计时电流方法已在商业产品中得到成功应用。例如，基于计时电流法的电化学酶传感器已经成功用于便携式血糖仪的研制，具有操作简单、成本低等的优点[9-10]。在此基础上，近年来免疫电化学分析方法也得到了广泛关注[11-15]。免疫电化学的方法就是将电化学分析检测与免疫学特异性分析方法相结合的一种生物传感检测方法，以电化学原理实现对免疫反应形成的抗原-抗体复合物的特异性检测[16-17]。

丝网印刷电极（screen printed electrode，SPE）具有制备简单、易于批量生产、低成本、便携和一次性使用等优点，与传统电化学分析方法相比，丝网印刷电极将工作电极、参比电极、辅助电极高度集成，解决了以往三电极体系分散、不易操作以及表面无法更新等问题。本实验设计与制备了可直接插入多孔板中进行测量的小型丝网印刷电极，提高操作的方便性，并以克仑特罗为检测目标，建立了基于96孔酶标板酶联免疫反应的微型丝网印刷电极快速检测方法。本方法对猪肉和猪尿中克仑特罗进行了测定，结果与ELISA试剂盒检测结果一致，为现场检测克仑特罗残留的方法提供了新的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉购自南京某农贸市场；猪尿取自南京某养猪厂；微型丝网印刷电极（工作电极和辅助电极为碳浆印制，参比电极为银/氯化银浆印制） 南京祥中生物科技有限公司。

克仑特罗抗原标准品 中国兽医药品监察所；克仑特罗包被抗原和抗体、克仑特罗ELISA检测试剂盒 南京祥中生物科技有限公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG 北京博奥森生物公司；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺 生工生物工程（上海）股份有限公司；过氧化氢尿素（CO(NH2)•H2O2） 天津希恩思生物公司；硫酸、甲醇、浓盐酸、氯化钠（分析纯） 南京化学试剂公司；其他试剂均为分析纯；实验用水均为去离子水（电阻率＞18.3MΩ•cm）。

1.2 仪器与设备

SHZ-82恒温箱 常州智博瑞仪器公司；洗板机 美国BioTek公司；CHI123B电化学分析仪 上海辰华生物有限公司；VORTEX-5振荡器 海门市其林贝尔仪器有限公司；TG16-WS离心机 上海卢湘仪器公司；BS124 S电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；酶标仪（450nm/630nm） 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 SPE的制备

采用聚丙烯塑胶纸印刷丝网电极，每支电极尺寸规格：0.4 mm×7 mm×30 mm。基底根据自行设计的电极结构图（如图1），第1层（图1a）印制银浆作为导电介质，第2层（图1b）印制碳作为工作电极和辅助电极，第3层（图1c）印制银/氯化银浆作为参比电极。每印完一层浆料，在100 ℃条件下固化30 min。最后印制绝缘浆作为绝缘层（图1d），100 ℃条件下烘干1h后，通过各层浆料的叠加，制得微型丝网印刷电极（图1e）。

图1e中的1、2、3号接口分别与对电极导线、工作电极导线和参比电极导线连接，最后将3根导并与电化学工作站接通，电化学站则通过连有USB接口的导线与电脑相连。

图 1 丝网印刷电极印制过程

Fig.1 Schematic illustration of SPE fabrication

1.3.2 微型丝网印刷电极的装置及其检测

基于96孔酶标板免疫反应，微型丝网印刷电极检测的流程示意图如图2所示。整个流程装置包括微型印刷电极（工作电极、辅助电极和参比电极）、96孔酶标板以及便携式电化学分析仪。本实验的电化学分析原理如图3所示。首先，克仑特罗抗原标准品与包被在酶标板上的克仑特罗抗原竞争结合克仑特罗抗体，经过洗涤多孔板后，保留连接在酶标板上的抗原-抗体复合物。随后，向孔板中加入HRP酶标二抗，二抗与酶标板上抗原-抗体复合物反应，最后加入酶底物H2O2和TMB发生酶催化反应，产生电活性物质TMB（ox），加H2SO4终止酶反应。通过插入96孔酶标板中的微型印刷丝网电极，实现对电活性产物TMB（ox）[20-22]的计时电流检测。酶反应方程式和电信号产生的还原反应式如下。

酶催化反应：

电信号产生的还原反应：

1.微型印刷电极（包括：2.工作电极；3.对电极；4.参比电极）；5. 96孔酶标板；6.电化学工作站；7.电脑记录仪。

图 2 实验检测装置示意图

Fig.2 Schematic illustration of an analytical system for
detecting clenbuterol

图 3 电化学免疫传感方法示意图

Fig.3 Scheme illustration of electrochemical immunosensing method

1.3.3 酶标板包被克仑特罗抗原

采用CB包被液（0.05 mol/L的碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6）将克仑特罗包被抗原稀释至1/8000 倍，包被酶标板，100 μL/孔，4 ℃冰箱过夜（12 h以上）；使用洗板机（洗涤液：0.1 mol/L磷酸盐-0.05%吐温）将含包被液的酶标板清洗3 次，在吸水纸上拍干，向拍干的各孔加入封闭液（1% BSA，磷酸盐配制）封闭，120 μL/孔，37 ℃温育2.0h[18-19]。

1.3.4 间接竞争免疫反应

将克仑特罗抗原标准品原液倍比稀释后加入酶标板孔内，加入量为50 μL/孔；再将1/8000倍稀释的克仑特罗单克隆抗体加入到酶标板孔内（50 μL/孔），混匀，37 ℃温育。

1.3.5 抗体与酶标二抗反应

使用洗板机将含抗原抗体反应混合物的酶标板清洗3 次，拍干后加入1/10000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠酶标二抗（100 μL/孔），混匀，37 ℃温育。

1.3.6 酶促反应及酶反应的终止

使用洗板机将含有酶标二抗的酶标板清洗3 次，拍干后加入A液（1 mmol/L H2O2）和B液（6 mmol/L TMB）各50 μL/孔，混匀，37 ℃温育。温育后，加入2 mol/L H2SO4，50 μL/孔，混匀。

1.3.7 电化学检测

将微型丝网印刷电极插入已终止反应的酶标板微孔中，采用计时电流法（电压：－0.1V；时间：100s）检测终止反应后产生TMB（ox）的还原峰电流值。

1.3.8 猪肉和猪尿样品的前处理方法

1.3.8.1 猪肉样品

称取（1.00±0.05）g猪肉糜样品至10mL聚苯乙烯离心管中，加入3mL 4% NaCl-0.05 mol/L HCl-99.9%甲醇混合液，用振荡器振荡提取5 min，6660×g以上离心5 min，取50 μL上清液用于分析（样品稀释倍数为4 倍）。

1.3.8.2 猪尿样品

取50 mL清亮尿样按照标准品测定方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 实验条件的优化

2.1.1 温育时间对峰电流响应值的影响

A.酶标二抗与抗体反应的温育时间：30 min，酶反应的温育时间：15 min；B.抗原抗体竞争反应的温育时间：30 min，酶反应的时间：15 min；C.抗原抗体的竞争反应时间、二抗与抗体反应时间都为30 min。

图 4 间接免疫反应的温育时间（A）、酶标二抗与抗体反应的温育
时间（B）和酶反应的温育时间（C）对电流响应值的影响

Fig.4 Effect of incubation time for indirect competitive reaction (A), the reaction between HRP-goat anti-mouse IgG and antibody (B), and enzymatic reaction (C) on current value

首先考察了竞争反应温育时间对计时电流响应值的影响，结果见图4A，可看出，随着竞争反应温育时间的延长，电流响应值也相应增加；当反应时间达30 min之后，电流响应值的增加幅度逐渐减小。酶标二抗与抗体反应的温育时间对计时电流响应值的影响参见图4B，考虑到快速检测的需要，在满足一定的线性范围与检测限要求的前提下，尽量缩短温育时间，并参考ELISA检测方法温育时间的选择，实验中选取30 min分别作为竞争反应的温育时间以及二抗与抗体反应的温育时间。底物与酶反应的温育时间对计时电流响应值的结果见图4C。当反应时间达到15 min时，电流响应增速达到最大，综合考虑反应时间的需要，实验选取选15 min作为底物与酶的温育时间。

2.1.2 酶底物浓度的选择

2.1.2.1 H2O2浓度对峰电流响应值的影响

图 5 H2O2浓度与电流响应值关系图

Fig.5 H2O2 concentration vs. current value curve

采用1.3.1～1.3.7节的实验步骤及2.1.1节已优化的各步反应的温育时间，B液浓度为1 mmol/L，H2O2浓度对酶产物TMB（ox）产生的电流值信号的影响结果见图5。可知，在0～3 mmol/L之间酶产物TMB（ox）产生的还原电流信号随着H2O2浓度的增加而增加，在3～9 mmol/L之间，产生的还原电流值基本保持不变。这是因为当酶与底物B液浓度一定时，起初随底物H2O2浓度的增加，酶产物TMB（ox）产生的量增加，产生的还原电流的信号值也增加，但当H2O2达到一定浓度后，酶产物的量不再增加，产生的还原电流信号也基本保持不变。如果电信号基本保持不变后，继续增加H2O2浓度，反而会抑制酶反应，使电流信号值降低（图中未标出）。这是由于H2O2浓度存在一定的最佳值范围，超过此范围时，H2O2表现出一定的底物抑制效应，因为高浓度H2O2可能与酶形成死端复合物，从而抑制酶对TMB的催化[23]。所以根据实验的结果选择6 mmol/L
作为酶反应的最佳H2O2浓度。

2.1.2.2 TMB浓度对峰电流响应值的影响

采用1.3.1～1.3.5节的实验步骤及2.1.1节已优化的各步反应的温育时间，A液选择优化浓度6 mmol/L，考察了TMB浓度在0～2 mmol/L范围内对酶产物TMB（ox）产生的电流值信号的影响，结果见图6。在0～0.9 mmol/L
之间，产生的电流值随TMB浓度的增加而增加，但超过0.9 mmol/L以后，电流值基本不变。这是因为酶和H2O2的浓度是固定的，所以当TMB达到一定浓度时，酶产物TMB（ox）的量也基本不变，产生的还原信号也基本不变。根据实验结果选1 mmol/L作为酶底物TMB的最佳浓度。

图 6 TMB浓度与电流响应值关系图

Fig.6 TMB concentration vs. current value curve

2.2 自制电极的重复性考察

从制备的电极条中随机抽取10片微型丝网印刷电极，采用相同的实验条件，在1 mmol/L铁氰化钾（含0.1 mol/L氯化钾）溶液中进行循环伏安测定，以图谱峰高作为测定标准，结果发现所测定的不同电极间的峰电流相对标准偏差为4.2%（图略），表明所用电极的一致性较好，可用于实验测定。

2.3 克仑特罗标准曲线与检测限的获得

在优化的实验条件下，将克仑特罗标准品1000 μg/L原液倍比稀释得到系列标准溶液进行测定，获得相应的标准曲线（图7）。结果表明，克仑特罗标准溶液质量浓度在0.025～2.0 μg/L范围内，质量浓度的半对数值与标准品的百分电流值比呈现良好线性关系，其线性回归方程为Y=30.11446－35.90156X（R2=0.9985），X为克仑特罗标准溶液质量浓度/的半对数值，Y为标准曲线百分电流值（I/I0×100，I为标准曲线溶液或样本溶液的平均电流值，I0为0 μg/L标准溶液的平均电流值）。

克仑特罗质量浓度为：0.025、0.05、0.15、0.25、0.50、1.0、2.0 μg/L。

图 7 克仑特罗检测的标准曲线

Fig.7 Calibration curve of clenbuterol

取10份克仑特罗空白样品，测定得到峰电流响应值I1、I2、I3…I10，代入克仑特罗标准曲线方程Y=30.114 46－
35.901 56X（R2=0.9985），计算得到10份空白样品含克仑特罗的质量浓度（μg/L）ρ1、ρ2、ρ3…ρ10，检测限的计算公式为LOD=

＋3s（

为ρ1、ρ2、ρ3…ρ10的平均值，s为ρ1、ρ2、ρ3…ρ10的标准偏差），通过测量计算得检测限为0.021 μg/L。

2.4 交叉反应率的研究

由于酒石酸托特罗定、盐酸环仑特罗、盐酸氯丙那林、盐酸妥洛特罗、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富马酸福莫特罗、班布特罗、莱克多巴胺可能与克仑特罗的抗体发生交叉反应，对克仑特罗测定产生干扰，所以将上述9种物质的标准品配制成10 μg/L，分别与克仑特罗抗体竞争包被的克仑特罗抗原，同时与克仑特罗空白样品的检测数据进行比较，得到各物质的交叉反应率，结果见图8。盐酸环仑特罗的交叉反应率约为8%，其他各物质的交叉反应率均小于1%。

A.克仑特罗；B.盐酸环仑特罗；C.沙丁胺醇；D.盐酸妥洛特罗；E.硫酸特布他林；F.酒石酸托特罗定；G.富马酸福莫特罗；H.班布特罗；J.盐酸氯丙那林；K.莱克多巴胺。

图 8 克仑特罗与其各种类似物质的交叉反应率

Fig.8 Cross-reactivity of clenbuterol with other analogues

2.5 猪肉和猪尿中的克仑特罗残留量的检测

分别取适量的猪肉和猪尿克仑特罗阴性样品进行样品前处理后，各检测10份阴性样品，得到峰电流响应值I1、I2、I3…I10，检测限的计算方法同2.3节，得猪肉和猪尿检测限分别为0.18 μg/L和0.05 μg/L。所购克仑特罗ELISA检测试剂盒对猪肉和猪尿的检测限分别为1.00 μg/L
和0.50 μg/L。向猪肉阴性样品中加入克仑特罗标准品，得到分别含1.00、2.00、4.00 μg/L的克仑特罗猪肉样品，检测过程同1.3.1～1.3.5节的实验步骤，测定加标回收率，见表1。同样，猪尿阴性样品中加入克仑特罗标准品，得到分别含0.30、0.80、1.00 μg/L的克仑特罗猪尿样品，测定加标回收率，见表2。

表 1 猪肉中克仑特罗加标回收率的测定

Table 1 Recovery of clenbuterol from spiked pork

表 2 猪尿中克仑特罗加标回收率的测定

Table 2 Recovery of clenbuterol from spiked swine urine

所购克仑特罗ELISA检测试剂盒，标准溶液质量浓度在0.05～1.35 μg/L范围内呈现良好线性关系（r=0.9925），线性方程为Y=0.117 08－0.62519X。应用ELISA方法对克仑特罗加标回收率进行测定，当猪肉阴性样品中加入1.00 μg/L克仑特罗标准品时，实际检测值为（0.99±0.03）μg/L，回收率为（99.13±2.98）%。猪尿阴性样品中加入0.30、0.80、1.00 μg/L克仑特罗标准品，测定加标回收率，见表3。

表 3 ELISA法测定猪尿中克仑特罗加标回收率

Table 3 Recovery of clenbuterol from spiked swine urine by ELISA

分别取适量经过前处理的猪肉和猪尿样品进行检测，检测结果为：猪肉中克仑特罗含0.228 μg/L，猪尿中克仑特罗含0.06 μg/L，都符合国家标准（动物性食品中克仑特罗检出量要小于1 μg/L），认为是阴性样品，与克仑特罗的ELISA试剂盒检测结果一致。

3 结 论

将微型丝网印刷电极与96孔酶标板组成微型生物电化学检测装置，通过间接竞争免疫反应，最后采用电化学检测手段来测定动物性食品中克仑特罗的残留量，该方法特异性高、简单、成本低，装置微型化、便于携带，为现场检测克仑特罗的方法提供了一种新的测定方法。

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