基于纳米金电化学免疫传感器测定牛奶中的青霉素G

李建龙,潘道东*,朱浩嘉,顾愿愿,赵紫微,朱珊珊

(宁波大学海洋学院,浙江 宁波 315211)

 

摘 要:利用吸附法将青霉素G抗体固定于纳米金修饰的玻碳电极表面,制备用于检测青霉素G的电化学免疫传感器,建立高度灵敏的一步直接电化学免疫法。纳米金的强吸附和导电作用,提高了青霉素G抗体的固定量和电化学灵敏度。在优化条件下,该传感器的响应电流与青霉素质量浓度的对数在0.04~40.00 ng/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.988 4,检测限为2.49 ng/mL,该法成功的实现了对牛奶中青霉素G的检测。

关键词:纳米金;青霉素;电化学免疫传感器

 

Determination of Penicillin G in Milk by Gold Nanoparticles Based Electrochemical Immunosensor

 

LI Jian-long, PAN Dao-dong*, ZHU Hao-jia, GU Yuan-yuan, ZHAO Zi-wei, ZHU Shan-shan

(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

 

Abstract: An amperometric immunosensor was fabricated by co-immobilizing penicillin G polyclonal antibody (Ab*) on the surface of a gold nanoparticle modified glassy carbon electrode through electrostatic adsorption. A highly sensitive one-step direct electrochemical immunoassay was established due to the strong adsorption and conductive capacity of gold nanoparticles, thus raising the amount of fixed penicillin G antibody and electrochemical sensitivity. Under optimized conditions, the current response of the sensor showed a good linear relationship with logarithmic penicillin concentration in the range of 0.04-40.00 ng/mL with a correlation coefficient of 0.988 4 and the detection limit was 2.49 ng/mL. The method was able to detect penicillin in milk successfully.

Key words: gold nanoparticles; penicillin; electrochemical immunesensors

中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)08-0111-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408021

青霉素和一些β-内酰胺类抗生素,经常用于兽医、食品和药物治疗中去预防细菌感染,在奶牛中常常要加入抗生素去治疗牛乳腺炎等疾病,然而由于人们的不合理使用,会导致其奶中抗生素大量残留,人们长期饮用抗生素超标的牛奶,会增加体内细菌的耐药性,甚至可能会引起一部分过敏反应[1-4],因此,对奶牛中的青霉素的残留检测显得非常重要。欧盟法规508/1099明确规定在食品中抗生素的最大残留量是4 ng/mL[5]。目前,常用的青霉素检测方法有:微生物法[6-8]、高效液相色谱法[9-11]、免疫荧光法[12] 等,但这些方法有一个共同的缺点就是:费时费力、价格昂贵或者需要专业的技术人员操作。近年来电化学免疫法既结合了传统的抗原抗体的特异性,又结合了电化学的高度灵敏性及其快速响应性[13],从而在食品[14]、医学方面受到了广泛的应用。

本实验通过在玻碳电极(glassy carbon electrode,GCE)表面吸附纳米金从而间接吸附青霉素抗体制成了青霉素电化学传感器,创新地将纳米金的强吸附性[15]和抗原抗体的特异反应结合起来,具有操作简单、响应时间短、稳定性好等优点。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

无抗生素牛奶 市售。

0.2 mol/L pH7.0磷酸缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)溶液(含有8 g NaCl、0.2 g KCl、1.15 g Na2HPO4•12H2O和0.2 g KH2PO4)、铁氰化钾、青霉素抗体(Ab*)2 mg 北京奥博森生物技术有限公司;牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA) 美国Sigma公司;氯金酸1 g 国药集团化学试剂有限公司;所有实验用水均为超纯水。

CHI660B电化学工作站(实验采用三电极:玻碳电极为工作电极;饱和甘汞电极为参比电极(以下实验电位均相对于饱和甘汞电极);大面积铂丝为对电极) 上海辰华仪器公司;MilliQ-型水纯化系统 美国Millipore公司;SB5200双频超声波清洗机 宁波新芝生物科技有限公司;移液器(规格1 mL、500µL和10µL等) 德国Eppendorf公司;青霉素粉末(用水配制成1000 ng/mL溶液) 美国Amresco公司;CS501-SP型超级数显恒温器 重庆四达实验仪器有限公司;DHG-9108A型电热恒温鼓风干燥机 上海精密实验设备有限公司;H2500-R-2型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GCE/Au/Ab*青霉素传感器的制备

参照文献[16-19]的方法处理电极:玻碳电极依次用0.3、0.05 µm的Al2O3粉末抛光至镜面,然后分别用超纯水、无水乙醇分别超声5 min,之后用氮气吹干。将经过预处理的电极浸入到0.1% HAuCl4溶液中,然后在0.5~
-0.5V工作电位下,扫描20圈,之后用超纯水多次洗涤并氮气吹干。将电极浸入一定质量浓度的青霉素抗体溶液中6h,取出后洗涤干净并氮气吹干,最后在电极表面滴加20µL 5%的BSA 1h以封闭其活性位点从而减少非特异性吸附,从而制得了GCE/Au/Ab*青霉素免疫传感器,最后用超纯水洗净,放置于4 ℃冰箱中备用。

参考武海[20]的方法稍作改动对牛奶样品进行除脂:在牛奶样品中加入不同量的青霉素,然后加入适量硫酸铵(6 g/20 mL牛奶),于4 ℃以8000r/min离心30 min,滤取其上清液用于传感器测定。

1.2.2 循环伏安法测试

将制备的传感器用超纯水洗净,氮气吹干,30 ℃时置于100µL的青霉素标准溶液中,30 min后取出充分冲洗干净,在含有0.2 mol/L PBS(含5 mmol/L K3Fe(CN)6和
0.1mol/L KCl)溶液中进行循环伏安法测试,以上过程如图1所示。

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图 1 免疫传感器的组装和检测

Fig.1 Procedures for the assembly and detection of the immunosensor

2 结果与分析

2.1 青霉素传感器的电化学行为

传感器在0.2 mol/L pH7.0 PBS(含5 mmol/L K3Fe(CN)6)溶液不同扫描速率下在中的循环伏安图,见图2。由图2可知,峰电流之比Ipa/Ipc≈1,峰电位在低扫描速率条件下基本不变,且可逆性良好。氧化峰和还原峰电流在20~100mV/s扫描速率时呈正比(图2插图),相关系数为0.994,这表明此电极反应呈现表面控制氧化还原过程。

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箭头方向为20、30、40、50、60、80、90、100 mV/s。

图 2 传感器在0.2 mol/L pH 7.0 PBS(含5 mmol/L K3Fe(CN)6)溶液中不同扫描速率下的CV图及其峰电流与扫面速率的关系图

Fig.2 Cyclic voltammogram of the immunosensor in 0.2 mol/L pH 7.0 PBS solution containing 5 mmol/L K3Fe(CN)6 at different scanning rates, inset: Plot of peak current vs. scan rate: 20, 30, 40, 50, 60, 80, 90 and 100 mV/s

2.2 传感器对青霉素抗原的响应

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a.裸玻碳电极;b. a+纳米金;c. b+青霉素抗体;d. c+牛血清蛋白;e. d+0.6 ng/mL青霉素。

图 3 不同修饰电极在K3Fe(CN)6中的响应

Fig.3 Response of different modified electrodes in pH 7.0 PBS solution containing 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L K3Fe(CN)6

由图3可见,曲线a是裸玻碳电极的CV图,可以看出在0.274、0.209V有一对可逆的氧化还原峰,当电极上沉积金之后,还原峰和氧化峰的电流明显偏大,这是由于纳米金粒子的强导电性(曲线b),当电极上结合青霉素抗体时,还原峰电流随之变小,同时也说明了青霉素抗体成功地吸附在纳米金电极表面(曲线c),当电极用BSA温育除去非特异性吸附后电流进一步减小(曲线d),因为BSA为大分子物质,会阻碍铁氰化钾的氧化还原,当电极温育0.6 ng/mL青霉素抗原后,电流明显减小(曲线e),说明抗原抗体形成了免疫复合物,阻碍了电子传输,导致电流进一步下降[21],因此说明传感器对青霉素抗原具有较好的免疫性响应。

2.3 影响传感器的因素

2.3.1 pH值的影响

溶液pH值影响青霉素酶的活性,图4研究了不同pH值条件下温育抗原前后的电流变化,当pH值在5.0~7.0变化时,传感器的电流变化随着缓冲液pH值的增大而增大,随后在pH7.0~8.0开始下降,在pH 7.0时候变化最大,这可能是因为青霉素抗体的活性随着pH值的增大而增强,抗原抗体形成的复合物越稳定,对电子的的传递阻碍作用越明显,因此电流变化相应增大,但当pH值进一步增加时,青霉素酶可能逐渐失活,因此电流变化逐渐变小。综上实验选择pH7.0。

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图 4 pH值对免疫传感器的影响

Fig.4 Effect of pH on CV peak current in PBS solution containing 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L K3Fe(CN)6

2.3.2 温育温度的影响

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图 5 温度对免疫传感器的影响

Fig.5 Effect of temperature on CV peak current in pH 7.0 PBS solution containing 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L K3Fe(CN)6

由图5可见,在温度10~30 ℃范围内,传感器的响应电流变化逐渐增大,在30 ℃达到最大值,在30~40 ℃时候,电流变化变小,这是因抗体酶随着温度的升高而活性增强,但是高温又会引起蛋白质的变性失活,因此实验应该选择30 ℃。

2.3.3 温育时间的影响

由图6可知,在10~30 min时传感器的响应电流随时间的升高而减小,在30 min之后电流基本变化不大,这是因为电极表面形成的免疫复合物阻碍了K3Fe(CN)6的电子传递因此电流减小,在30 min时电极上的抗体吸附抗原已经达到饱和因此电流基本变化不大。综上,所以实验选择温育最佳时间为30 min。

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图 6 温育时间对免疫传感器的影响

Fig.6 Effect of incubation time on CV peak current in pH 7.0 PBS solution containing 0.1 mol/L KCl and 5 mmol/L K3Fe(CN)6 and
0.6 ng/mL penicillin

2.4 传感器对牛奶中青霉素抗原的响应

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箭头方向为0.04、0.08、0.20、0.40、0.60、2.00、5.00、10.00、20.00、40.00 ng/mL。

图 7 免疫传感器的工作曲线

Fig.7 Decrease in reductive peak current with increasing penicillin concentration in milk in the range of 0.00–40.00 ng/mL

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图 8 免疫传感器对青霉素质量浓度对数的线性关系图

Fig.8 Linear relationship between reductive peak current and logarithmic penicillin concentration in the range of 0.04–40.00 ng/mL

由于牛奶中的青霉素抗原与电极表面的青霉素抗体形成了抗原抗体免疫复合物,从而阻碍了电子传输,因此会导致响应峰电流减小,以还原峰电流对青霉素质量浓度作图,从而实现了对青霉素的痕量检测。由图7、8可以看出,当青霉素质量浓度在0.04~40.00 ng/mL范围内,传感器对青霉素质量浓度的对数有良好的线性关系,其中电流改变量ΔI=3.3002lg(c(Ab*)/(ng/mL))+
26.247,相关系数为0.9884,检测限为2.49 ng/mL,低于欧盟的4 ng/mL。这是因为在一定范围内电极表面积较小,抗体固载量较小,牛奶中有其他物质的干扰,另外形成的抗原抗体复合物可能阻碍了进一步与抗原的结合,因此在较高的范围内灵敏度较低。

2.5 重复性和稳定性

分别采取同一支电极测定不同质量浓度的青霉素标液和同一批制备的6支电极测定同一质量浓度的青霉素标液,测定其传感器的重复性。结果表明,传感器的分析内相对标准偏差小于4%,传感器的分析间相对标准偏差小于8%,说明此传感器具有较好的重复性。

另外,将制备的传感器保存于4 ℃的冰箱中,20d后测定2 ng/mL的青霉素,响应电流仅仅下降了6%,说明此传感器具有较好的稳定性。

2.6 特异性

在PBS溶液中加入相同质量浓度的青霉素和其他抗生素,分别为氨苄青霉素、左氧氟沙星、罗红霉素、克林霉素、氟康唑对传感器的特异性进行了测定。结果显示上述添加的其他物质对青霉素的检测影响比较小(图9),由此说明传感器具有较好的特异性。

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图 9 免疫传感器的特异性

Fig.9 Specificity of the enzyme immunosensor

2.7 回收率的测定

在牛奶样品中分别添加1、2、3 ng/mL的青霉素,经盐析处理后用所制备的传感器和ELISA法分别对样品进行检测,其测定结果如表1所示。由表1可知,此方法和ELISA测定的结果没有明显差异,说明此传感器可以实现对实际样品中青霉素的检测。

表 1 牛奶中青霉素的检测结果(n=4)

Table 1 Comparison of the results obtained by the method and ELISA for the determination of penicillin in milk (n = 4)

样品

青霉素含量/(ng/mL)

本法RSD/%

本法回收率/%

本法

ELISA法

1

0.96

0.95

3.20

96.00

2

1.94

1.96

3.40

97.00

3

2.90

2.93

4.42

96.67

 

3 结 论

本实验通过在玻碳电极表面镀金,再吸附一定量的青霉素抗体,从而制备了电流型电化学免疫传感器,通过测量电流变化从而实现青霉素的定量检测。该传感器既具有抗原抗体的特异性和高效性,又具有电化学的高度灵敏性和快速响应性。通过和ELISA法比较可知,其结果比ELISA的结果相差较小,但是该传感器具有制备简单、稳定性强、灵敏度高、反应时间短等优点,从而能够满足对牛奶中微量青霉素的快速检测要求。

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收稿日期:2013-05-15

基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAK08B01);宁波市创新团队项目(2012B82017);

宁波市人事局人才基金项目(ZX2012000380)

作者简介:李建龙(1988—),男,硕士研究生,研究方向为食品安全与检测。E-mail:lijianlong142733@163.com

*通信作者:潘道东(1964—),男,教授,博士,研究方向为畜产品加工及质量控制技术。E-mail:daodongpan@163.com