毛细管电泳分离检测茶叶中5种多酚类化合物

马晓年1,2，邵娅婷1，李 菲1，熊 杰1，曹秋娥1,*

（1.云南大学化学科学与工程学院，教育部自然资源药物化学重点实验室，云南 昆明 650091；

2.云南省疾病预防控制中心，云南 昆明 650022）

摘 要：利用高效毛细管区带电泳，建立一种同时分离测定茶叶中儿茶素、表儿茶素、槲皮素、山奈酚和杨梅素的方法。在含有10 mmol/L Na2B4O7、5 mmol/L β-环糊精及8%（v/v）乙腈的运行缓冲溶液（pH 9.11）中，采用20 kV的分离电压、25 ℃的毛细管柱温和200 nm的检测波长，儿茶素、表儿茶素、槲皮素、山奈酚和杨梅素可以在14 min实现有效分离与检测，将方法用于不同茶叶样品中这5 个组分的测定，相对标准偏差在4.0%以内，回收率为95.4%～104.6%。本方法简单、快速、线性范围较宽、重复性好，可用于茶叶中这5 个组分的测定。

关键词：毛细管电泳；儿茶素；表儿茶素；槲皮素；山奈酚；杨梅素；茶叶

Separation and Determination of Five Kinds of Polyphenolic Compounds in Tea by Capillary Electrophoresis

MA Xiao-nian1,2, SHAO Ya-ting1, LI Fei1, XIONG Jie1, CAO Qiu-e1,*

(1. Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Nature Resource, Ministry of Education, School of Chemical Science and Technology, Yunnan University, Kunming 650091, China; 2. Yunnan Center for Disease Prevention and Control, Kunming 650022, China)

Abstract: Objective: To develop a method for simultaneous separation and determination of catechin, epicatechin, quercitin, kaempferol and myricetin in tea. Methods: High performance capillary zone electrophoresis was used. Results: Catechin, epicatechin, quercitin, kaempferol and myricetin could be effectively separated and determined within 14 min in a running buffer solution (pH 9.11) containing 10 mmol/L Na2B4O7, 5 mmol/L β-CD and 8% (v/v) acetonitrile with the applied voltage of 20 kV, capillary temperature of 25 ℃ and detector wavelength of 200 nm. The relative standard deviation and recovery of the proposed method for these five compounds in tea were below 4.0% and in the range of 95%-105.6%, respectively. Conclusion: This method possesses the advantages of simple operation, rapid determination, high reproducibility and wide detection range. It can be used for the determination of catechin, epicatechin, quercitin, kaempferol and myricetin in tea.

Key words: capillary electrophoresis; catechin; epicatechin; quercitin; kaempferol; myricetin; tea

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0129-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408025

茶在中国已有3000余年的食用历史，是目前世界上最为流行的饮料之一。茶叶中不仅含有丰富的维生素和矿物质，而且含有许多对人体有保健作用的功效成分，如茶蛋白、茶多酚、茶多糖、咖啡碱、茶叶皂苷、氨基酸、茶色素等，其中对人体健康最有益的物质之一是茶多酚。茶多酚是茶叶中酚类物质及其衍生物的总称，主要包括儿茶素类、黄酮、黄酮醇类、花青素类、花白素类和酚酸及缩酚酸类，具有强抗氧化性和降糖、减肥、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗辐射等作用[1-4]，目前其肿瘤化学预防作用及抗HIV作用也引起了人们的广泛关注[2-6]。

茶叶中多酚类物质的测定已有不少研究[7-10]，采用的方法包括原子吸收光谱法[11]、紫外-可见分光光度法[12]、近红外光谱法[13-14]、色谱法[15]与毛细管电泳法[16]等，但现有这些方法都没有涉及茶叶中儿茶素、表儿茶素、槲皮素、山奈酚和杨梅素的同时分离分析。肖俊松[17]、孙晓莉[18]、邸羿[19]、付静[20]、Peres[21]和Bonoli[22]等分别采用高效液相色谱、超高效液相色谱和毛细管电泳测定了茶叶中的儿茶素类成分，但都没有涉及山奈酚、杨梅素和槲皮素的分析；李家华等[23]建立了测定茶中杨梅素、槲皮素和山奈酚的高效液相色谱法，但没有研究儿茶素和表儿茶素的检测；López等[24]用毛细管胶束电动色谱测定了茶叶中7 种儿茶素类化合物和槲皮素、百里香酚，但没有测定山奈酚和杨梅素；衷明华等[25]建立了茶叶中4 种有效成分的毛细管区带电泳法，但只涉及了本研究中的5 种成分中的表儿茶素。因此，本研究采用毛细管区带电泳模式，在优化电解质溶液与仪器工作条件的基础上，建立了一种同时分离测定儿茶素、表儿茶素、槲皮素、山奈酚和杨梅素的新方法，该方法简单快速、重复性好、线性范围宽，可用于茶叶中这5 种组分的同时测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准对照品儿茶素、表儿茶素、槲皮素、山奈酚、杨梅素 中国食品药品检定研究院；β-环糊精 美国Sigma Aldrich公司；Na2B4O7、乙腈、甲醇（均为分析纯） 上海化学试剂有限公司；水为艾柯纯水器UP级水。

1.2 仪器与设备

P/ACETM MDQ型高效毛细管电泳仪（配有二级管阵列紫外检测器） 美国Beckman Coulter公司；未涂层石英毛细管（57 cm×50 cm，75μm） 河北省永年锐沣色谱器件有限公司；pHS-2C型pH计 上海雷磁仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

标准溶液：儿茶素、表儿茶素、槲皮素、山奈酚、杨梅素储备液（1.0 mg/mL）均用甲醇配制，4 ℃保存。样品溶液：参照文献[23]，称取一定量经干燥粉碎后的茶叶样品或添加了一定量目标物标准品的茶叶样品，加入40 mL甲醇和4 mL盐酸，85 ℃水浴回流1.5h，过滤并用少量甲醇多次洗涤残渣，合并滤液与洗涤液，减压蒸馏至近干，残渣用甲醇溶解并定容到50 mL。所有溶液在使用前均用0.45μm滤膜过滤。

1.3.2 毛细管电泳条件

运行电解质溶液：含有10 mmol/L Na2B4O7、5 mmol/L
β-环糊精、8%（v/v）乙腈的缓冲溶液（pH 9.11）；电泳仪器条件：分离电压20 kV；毛细管柱温25 ℃；二级管阵列紫外检测器（经3D全波长扫描，最终选择检测波长为200 nm）；采用压力（0.5 psi，3447.38 Pa）进样5.0 s。

为确保重复性，毛细管柱每天在运行前及2次运行之间均依次用0.1 mol/L NaOH、去离子水和运行缓冲溶液分别冲洗3、2、4 min。数据处理采用32Karat软件。

各组分的相对迁移时间（tR）定义为组分的迁移时间（tm）与内标物（即溶剂甲醇）峰的迁移时间（ts）之差。

2 结果与分析

2.1 电泳条件的优化

2.1.1 缓冲液pH值及硼砂浓度对分离度的影响

由于被测组分均含有羟基，可以与硼原子络合并电离而带负电荷，因此实验选择了毛细管区带电泳分离模式和硼砂缓冲溶液为电解质溶液。在固定缓冲溶液中硼砂浓度为10 mmol/L的条件下，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl在pH 8.0～9.5范围内调节溶液的pH值，研究电解质溶液的pH值对分离的影响。由图1可知，儿茶素和表儿茶素在所测定pH值范围内并没有得到有效分离，但当电解质溶液的pH值达到9.11时，这2 个组分的分离度达到最大。因此实验选择电解质溶液的pH值为9.11。

1.儿茶素；2.表儿茶素；3.山奈酚；4.杨梅素；5.槲皮素。下同。

图 1 pH值对5种多酚类化合物相对迁移时间的影响

Fig.1 Effect of pH on relative migration time for five kinds of polyphenolic compounds

固定电解质溶液的pH值为9.11后，研究了硼砂浓度（5.0～15.0 mmol/L）对分离度的影响。图2表明，随电解质溶液中硼砂浓度的增加，组分之间的分离度有所增加，但迁移时间明显延长，而且在硼砂浓度大于15 mmol/L后，基线噪音严重，检测灵敏度下降。为缩短分析时间、降低基线噪音，选用10 mmol/L的硼砂缓冲体系（pH 9.11）为分离缓冲溶液。

图 2 硼砂浓度对5种多酚类化合物相对迁移时间的影响

Fig.2 Effect of Na2B4O7 concentration on relative migration time for five kinds of polyphenolic compounds

2.1.2 β-环糊精浓度对分离度的影响

图 3 β-环糊精浓度对5 种多酚类化合物相对迁移时间的影响

Fig.3 Effect of β-CD concentration on relative migration time for five kinds of polyphenolic compounds

因为儿茶素和表儿茶素在仅含硼砂的电解质溶液中不能得到有效分离，所以实验考虑在电解质溶液中添加β-环糊精，利用其对立体异构体具有不同的包合能力来改善儿茶素和表儿茶素的分离效果。由图3可知，β-环糊精的加入不仅能缩短分析时间，而且能明显改善儿茶素和表儿茶素的分离度。当β-环糊精的添加浓度为5 mmol/L时，各组分之间的分离度理想，而且迁移时间较短。因此，实验选择在电解质溶液中添加5 mmol/L的环糊精。

2.1.3 乙腈添加量对分离度的影响

虽然在含有5 mmol/L β-环糊精的浓度为10 mmol/L的硼砂缓冲溶液（pH 9.11）中，标准品混合溶液中各组分能得到有效分离，但在此电解质溶液中，茶叶中共存的其他组分对待测组分，尤其是儿茶素有干扰，因此实验进一步考虑在电解质溶液中加入乙腈，并研究了乙腈的添加量对分离度的影响。由图4可知，随着电解质溶液中乙腈的体积分数增加，各组分间的分离度有所增加，迁移时间则明显延长。当乙腈的体积分数达到8%时，茶叶中共存的其他组分与待测组分的电泳峰之间不再有重叠，故实验选择乙腈的添加量为8%（v/v）。

图 4 乙腈体积分数对5种多酚类物质相对迁移时间的影响

Fig.4 Effect of acetonitrile concentration on relative migration time for five kinds of polyphenolic compounds

2.1.4 仪器条件对分离度的影响

在上述选定的电解质溶液中，分别研究了分离电压（15～30 kV）、毛细管柱温（15～30 ℃）和0.5 psi（3447.38 Pa）压力下的进样时间（3～10 s）对分离检测的影响。结果表明，随分离电压和毛细管柱温的增加，迁移时间缩短，基线噪音增大，分离度有所下降；随进样时间的延长，检测灵敏度增加，但峰形展宽，柱效下降。实验最终选择分离电压为20 kV、毛细管柱温为25 ℃、压力（0.5 psi，3447.38 Pa）进样时间为5.0 s。

0.溶剂甲醇的峰。

图 5 优化条件下标准品混合溶液（A）和福建产铁观音样品
溶液（B）的电泳图

Fig.5 Electropherogram of standard mixture (A) and Tieh-Kuan-Yin tea (B) under optimized conditions

由图5可知，在上述优化的电泳条件下，不仅5 个组分彼此之间达到了基线分离，而且样品中的其他共存组分与待测组分之间也得到了有效分离。

2.2 工作曲线与精密度

利用上述选定的最佳电泳介质及仪器工作条件对一系列不同质量浓度的儿茶素、表儿茶素、山奈酚、杨梅素和槲皮素的标准品混合溶液进行电泳分离分析，以各组分的峰面积A为纵坐标、对应质量浓度ρ/（μg/mL）为横坐标进行回归分析，求得各组分的工作曲线。此外，实验还对质量浓度均为100μg/mL的标准品混合溶液平行测定了7次，计算了各组分迁移时间tm和峰面积A的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。由表1可知，本方法线性范围较宽、精密度好。

表 1 标准曲线与精密度

Table 1 Calibration curves and precision (expressed as RSD) of the method

2.3 样品分析与回收率

表 2 样品中各组分的含量（n=5）

Table 2 Contents of five polyphenolic compounds in tea determined by the method (n = 5)

注：ND.未检出。

在选定的最佳电泳条件下，分别对福建产铁观音、四川产苦丁茶、四川产竹叶青、云南普洱绿茶、云南普洱红茶中的儿茶素、表儿茶酚、山奈酚、杨梅素和槲皮素进行了分析测定。同时，在茶叶样品中添加一定量的儿茶素、表儿茶素、山奈酚、杨梅素和槲皮素标准品后测定，对各样品进行了加标回收实验。由表2、3可知，本方法测定不同茶叶中的这5 种多酚类物质的相对标准偏差均在4.0%以内，加标回收率均在95.4%～105.6%之间。

表 3 加标回收率（n=3）

Table 3 Spike recoveries of five polyphenolic compounds in tea (n = 3)

%

3 结 论

儿茶素、表儿茶素、山奈酚、杨梅素和槲皮素是茶叶中重要的茶多酚，其中前2 种是茶叶中的代表性儿茶素类物质，后3 种是茶叶中的代表性黄酮，因此同时分析测定茶叶中这5 种组分具有重要意义。本研究所建立的毛细管区带电泳法可以在14 min内实现茶叶中儿茶素、表儿茶素、槲皮素、山奈酚和杨梅素的同时分离分析，其工作曲线的线性范围分别为2.0～210.0、2.0～210.0、1.0～150.0、1.0～150.0 mg/mL和2.0～200.0 mg/mL，对样品检测的相对标准偏差在4.0%以内，加标回收率在95.4%～105.6%。

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