GC-MS法测定烟熏腊肉中的甲醛含量

芮露明，彭增起*，汪 敏，张 露，姚 瑶，王复龙，张雅玮，惠 腾，李君珂

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

摘 要：以烟熏腊肉为研究对象，经过条件优化，建立用气相色谱-质谱测定烟熏肉制品中甲醛含量的方法。结果表明，最优的衍生化处理与萃取的条件为：加入0.3 mL 2,4-二硝基苯肼，衍生化温度60 ℃，衍生化时间30 min，用二氯甲烷进行萃取，萃取2 次；根据已建立的烟熏腊肉中的甲醛检测方法，低、中、高3 个水平的平均回收率依次为79.8%、84.0%以及89.4%；重复性相对标准偏差为2.89%，检出限为0.50 mg/kg。该方法简便快速、结果准确、灵敏度高，可作为测定烟熏肉制品中甲醛的有效方法。

关键词：甲醛；气相色谱-质谱；萃取；衍生

Determination of Formaldehyde Content in Smoked Meat by GC-MS

RUI Lu-ming, PENG Zeng-qi*, WANG Min, ZHANG Lu, YAO Yao, WANG Fu-long, ZHANG Ya-wei, HUI Teng, LI Jun-ke

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract: A method was developed for the determination of formaldehyde in smoked meat using gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS). The optimal derivatization and extraction conditions were determined as the follows: derivatization with 0.3 mL of 2,4-dinitrophenylhydrazine at 60 ℃ for 30 min, and two repeated extractions with dichloromethane. The average recoveries at low, moderate, and high spiked levels were 79.8%, 84.0% and 89.4%, repeatability. The repeatability expressed as relative standard deviation was 2.89%, and the detection limit was 0.50 mg/kg. The method is simple, rapid, accurate, and sensitive and can be used for the determination of formaldehyde in smoked meat.

Key words: formaldehyde; gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS); extraction; derivatization

中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0142-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408028

甲醛是一种高毒性物质，具有致癌、致畸性。相关研究表明，甲醛对人体免疫系统和呼吸道均有较大影响，长期接触低剂量甲醛会引起慢性呼吸道疾病、鼻咽癌、脑瘤、结肠癌等，还会导致新生儿染色体异常、白血病，以及引起青少年记忆力和智力的下降等严重后果[1-3]。此外，甲醛的基因遗传毒性已在人工培养的哺乳动物细胞的体内实验与动物实验被证实[4-6]。美国环境保护署鉴于其危害性确立了甲醛的参考剂量为0.2 mg/（kg•d），当暴露量逐渐大于参考剂量时，会增加对健康造成不利影响的风险[7]。

甲醛作为一种很多生物可以产生的一种代谢产物，却在许多食品如香菇中出现，且甲醛含40～380 mg/kg不等。而在食品保藏中人工甲醛的非法使用导致了甲醛的严重超标，极大地损害了人们的身体健康。在福州、大连、广州、武汉、上海等地的一些独立研究发现，一些采用甲醛非法处理来进行保藏的海产品，甲醛含量超过300 mg/kg，更有甚者达到4 250 mg/kg[8-10]。而熏肉制品表面也会含有大量甲醛[11-12]，这主要是木材在缺氧状态下干馏所得，吸附聚集在产品的表面。甲醛具有一定的抗菌作用，可在一定程度上防止熏肉腐败，与此同时也给烟熏肉制品带来的极大的安全隐患。

关于水产品、香菇及啤酒等食品中的甲醛检测方法已有报道[13-16]，而作为中国传统特色的烟熏腊肉中甲醛测定的研究几乎没有，且在肉制品中也缺乏关于甲醛限量的标准，所以有必要建立一种快捷、高效、准确的方法，来测定烟熏肉制品，尤其是烟熏腊肉中甲醛含量，为标准的建立提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

熏肉、熏肠购自湖南益阳市安化县以及重庆涪陵区当地农贸市场。

2,4-二硝基苯肼溶液（1g/L）：称取0.1 g 2,4-二硝基苯肼溶解于24 mL浓盐酸中，加水定容至100 mL，过滤离心备用；缓冲溶液（pH 5）：称取2.64 g乙酸钠，以适量水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL，用pH计测定其pH值，必要时进行酸碱调节；甲醛标准溶液（纯度＞99%）：100 mg/L；二氯甲烷和甲醇均为色谱级；磷酸（浓磷酸与水按体积比1∶9配制）。

1.2 仪器与设备

旋涡混合器、LFS-15流量计、320-MS气相色谱-质谱联用仪 德国Brüker公司；HY-04B粉碎机 北京环亚天元机械有限公司；AL104电子天平 梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；T25分散机 德国IKA公司；台式超速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；水蒸气蒸馏装置。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

移取10、20、50、70、100 μL甲醛溶液（100 mg/L）
置于5 mL具塞比色管中，分别加入0.30 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，置60 ℃水浴30 min，然后在流水中快速冷却，加入2 mL二氯甲烷，用旋涡混合器振荡萃取1 min，4 000 r/min离心5 min使溶液分层，取上清液再用1 mL二氯甲烷萃取1 次，合并2 次萃取的下层黄色溶液，将萃取液经无水硫酸钠柱脱水，60 ℃水浴蒸干，冷却。取1.0 mL甲醇溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤后上机分析。制作甲醛标准曲线，确定标准曲线范围。

1.3.2 熏肉样品的前处理

采用水蒸气蒸馏法进行前处理，具体参照朱易等[17]的方法并稍作修改。

1.3.3 样品衍生化与萃取

取蒸馏液1.0 mL，置于5 mL具塞比色管中，分别加入0.30 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，置60 ℃水浴30 min，然后在流水中快速冷却，加入2 mL二氯甲烷，用旋涡混合器振荡萃取1 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液再用1 mL二氯甲烷萃取1 次，合并2 次萃取的下层黄色溶液，将萃取液经无水硫酸钠柱脱水，60 ℃水浴蒸干，冷却。取1.0 mL色谱纯甲醇溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤后作分析用。

1.3.4 气相色谱-质谱分析条件

1.3.4.1 气相色谱条件

色谱柱：DB-5弹性石英毛细管柱；柱温60 ℃；进样口温度260 ℃；程序升温：以10 ℃/min升温速度升至150 ℃，然后升温至260 ℃，恒温5 min；载气He；柱前压40 kPa；分流比10∶1；溶剂延迟5 min；进样量1 μL。

1.3.4.2 质谱条件

电子电离源；电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；电子倍增器电压1.02 kV；接口温度250 ℃；选择离子检测m/z 79、210。

1.3.5 加标回收率

取3 种不同肉样（本底不含甲醛）粉碎，准确称取2.0 g，分别加入10、20、30 mg/kg不同含量的甲醛，按实验方法衍生、萃取、上机检测，根据标准曲线计算样品以及不同加标水平下的甲醛提取量。

1.3.6 重复性实验

在腊肉样品中（本底不含有甲醛）加入相当于样品5 mg/kg的甲醛标准溶液，样本量为6，按实验方法前处理、衍生、萃取、上机测定，考察方法的精密度。

1.3.7 检出限

方法的检出限定义为产生3倍信噪比（RSN=3）的化合物的质量浓度，选取空白肉样（本底不含甲醛），样本量n=6，分别加入10 μL的甲醛标准溶液，然后进行衍生、萃取、上机检测，得出检出限。

1.4 统计分析

数据以平均值±标准偏差表示，用Microsoft Excel统计处理，用SPSS 18.0统计软件进行线性分析和邓肯多重比较，P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 衍生反应

醛类物质可在酸性介质中与2,4-二硝基苯肼反应形成较稳定的希夫碱，本实验中生成的2,4-二硝基苯腙，反应式如下：

衍生剂用量和酸性是影响衍生反应的重要因素。适量的酸有助于促进甲醛与2,4-二硝基苯肼的反应[18-19]，然而过多的酸将会损坏毛细管柱。称取0.1 g 2,4-二硝基苯肼溶解于24 mL浓盐酸中，加水定容至100 mL。

2.2 气相色谱-质谱条件的确定

2.2.1 色谱柱的选择

选用DB-5弹性石英毛细管柱，因其较好的惰性与柔性，吸附和催化性较小，适于目标化合物的分析。

2.2.2 柱温的选择

预实验中发现当选择210 ℃恒温时，衍生物的出峰时间较早，峰形矮胖且分岔，检测灵敏度不高。当采用程序升温，以10 ℃/min升温速度升至150 ℃，然后升温至260 ℃，恒温5 min。出峰时间在18 min左右，峰形与重复性较好，灵敏度也较高。

2.2.3 测定方法与特征离子的选择

由于烟熏腊肉基体复杂，用高效液相色谱或气相色谱法测定基质干扰较大，结果往往偏高。通常需层析柱再进行洗脱净化，操作繁琐。回收率比较低。故选用气相色谱-质谱选择离子检测，这样可消除杂质对检测的干扰，选择性明显提高。灵敏度比全扫描模式提高两个数量级。衍生产物2,4-二硝基苯腙的质谱图见图1。2,4-二硝基苯腙的碎片离子丰度中最大的峰为m/z 63，其次为
m/z 79，且两者差距不大，分子离子峰为m/z 210。根据选择离子的原则，应尽量选择质荷比较大的特征离子，以提高准确度；同时选择丰度较大的离子，以提高检测的灵敏度。如图2所示，选择离子扫描可很好地排除杂质峰的干扰。综上考虑，选择m/z 79和m/z 210为参考检测离子，以消除杂质峰的干扰影响，保证检测的准确性与灵敏度。

图 1 2,4-二硝基苯腙的质谱图

Fig.1 Mass spectrum of 2,4-dinitrobenzene formaldehyde hydrazone

A．总离子流图；B. m/z 79；C. m/z 210。

图 2 总离子流和特征离子色谱图

Fig.2 Total ion current and selected ion chromatograms

2.3 衍生化与萃取处理条件优化（甲醛标液添加量均为50 μL）

2.3.1 衍生剂用量

图 3 峰面积随衍生试剂用量变化的曲线

Fig.3 Peak area vs. derivatization agent dosage

理论上，任何能与羰基反应的大分子有机物质都可以作为本实验的衍生化试剂。综合筛选，本实验选用2,4-二硝基苯肼做为衍生剂，其主要特点是相对分子质量适中，在常温条件下反应完全、快速。由图3可知，衍生产物的峰面积随着衍生化试剂用量的增加，在0.3 mL之前呈上升的趋势，0.3 mL之后呈下降的趋势，幅度较小。在用量0.3 mL处，峰面积最大，所以50 μL甲醛添加量的最佳衍生剂用量为0.3 mL。

2.3.2 衍生化时间

由图4可见，随着衍生化时间的延长，2,4-二硝基苯腙产物的峰面积增大，但并非呈一直增加的趋势。当衍生化时间在30 min以内时，峰面积的响应值随时间的延长而增加，而随后又下降，在30 min处达最高值。所以，衍生化时间选择30 min。

图 4 峰面积随衍生化时间变化的曲线

Fig.4 Peak area vs. derivatization time

2.3.3 衍生化温度

图 5 峰面积随衍生化温度变化的曲线

Fig.5 Peak area vs. derivatization temperature

由图5可见，随着衍生化温度的升高，2,4-二硝基苯腙产物的峰面积增大，但并非是一直增大，当衍生化温度在60 ℃以内时，峰面积的响应值随温度的升高而增加，而随后又下降，在60 ℃条件下达最高值。所以，衍生化温度选择60 ℃。对于更准确具体的最适衍生温度，可以进行进一步的探索。

2.3.4 萃取次数

二氯甲烷的用量和萃取的次数直接影响衍生物萃取率，从而间接影响测定的结果。实验中第1次萃取用2 mL，随后的每次用量为1 mL。如图6显示，2 次萃取后，萃取基本完全。尽管二氯甲烷是色谱级，但过多的萃取剂二氯甲烷仍会多带入一些杂质，从而影响结果的准确性。所以，从检测准确性与成本考虑选择二氯甲烷萃取，第1次萃取用2 mL，随后的每次用量为1 mL，萃取2 次。

图 6 峰面积随萃取次数变化的曲线

Fig.6 Peak area vs. extraction number

2.4 甲醛质量浓度标准曲线

按照1.3.1节方法，以甲醛质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为y=22 974.8x－0.194 63，R2=0.999 7，在甲醛反应液质量浓度为0.1～15 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 验证实验

2.5.1 加标回收率

在腊肉样品中（本底不含有甲醛）分别加入相当于样品质量分数分别为0.5、1.5、5 mg/kg的甲醛标样进行测定，计算出回收率结果见表1。

表 1 腊肉制品中甲醛加标回收率

Table 1 Recoveries and precision (RSD) for formaldehyde standard added to smoked meat

2.5.2 重复性实验

按照1.3.6节方法处理，重复6 次实验，得到相对标准偏差为2.89%。表明本法具体很好的重复性。

2.5.3 检出限

按上述分析方法，在不含甲醛的样品本底中添加一定量的甲醛标准进行实验，最低检测质量浓度0.01 mg/L，以取样量2.0 g计，本法对样品的检出限为0.50 mg/kg。

2.6 甲醛含量的测定

从重庆与湖南购买4 个品牌的腊肉，每个品牌购买3 袋，按照1.3.2、1.3.3节的方法进行前处理衍生化，按照1.3.4节的色谱条件进行测定，每个样品取表层（表面0.5 cm厚）与内部各3 份，每份平行测定3 次，取平均值，所测样品中甲醛的含量结果见表2。利用所建立的方法对市售腊肉中甲醛含量进行了分析，4 种腊肉表层与内部均存在着一定量的甲醛。从表2可以看出，所检测的熏肉制品中甲醛含量均较高，最高甚至达到了254.52 mg/kg。
烟熏腊肉表层甲醛含量要大于内部。

表 2 不同样品腊肉甲醛的含量

Table 2 Formaldehyde contents of different smoked meats

mg/kg

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

3 讨 论

现在关于食品中甲醛的测定的研究主要集中在啤酒、蘑菇、海产品等样品，李军[20]、王宏华[21]等对啤酒中甲醛含量的测定进行研究，郑斌[22]、迂君[23]等对水产品、海产品中甲醛测定开展相应研究，还有研究者用衍生-液相色谱法检测香菇中的甲醛含量。而熏肉制品中的甲醛检测方法却鲜有报道。熏肉制品由于质地较干硬、存在着脂肪与蛋白质等杂质的干扰，使得甲醛的提取存在着一定的困难。

在酸性环境中，甲醛极易挥发出来，影响测定结果，水蒸气蒸馏可以很好解决这一问题。本实验在传统的水蒸气蒸馏装置的基础上进行了改进，将原来的圆底烧瓶换成了半微量的定氮整流器，有效地降低了样品量，从而提高回收率。实验对衍生化以及萃取处理的条件进行了优化，具体有衍生剂用量、衍生化时间、衍生化温度、萃取次数4 个因素，这些因素直接影响的检测的结果。

衍生剂用量过少，衍生化不充分，过多，因为衍生剂本身的纯度则会给样品带来新的杂质，而衍化时间过长衍生温度过高，则会影响衍生产物的稳定性。混合液萃取2 次以后，峰面积增加不显著。结合实验结果，选择加入0.3 mL 2,4-二硝基苯肼、衍生化温度60 ℃、衍生化时间30 min、用二氯甲烷进行萃取、萃取2 次。

目前在甲醛检测方法的研究中，各研究者所研究的研究对象各不相同，再加上仪器设备条件参差不齐，因此每个方法各有侧重点，也各有优劣。与其他甲醛检测的方法相比，本方法色谱条件更为简单，前处理对样品本身的物理特性依赖性小。从方法学评价结果来看，样品的干扰基质少，具有较低的检测限以及较好的回收率和精密度，能够满足检测的要求。

实际样品中甲醛含量的测定结果表明有些烟熏腊肉的甲醛含量令人堪忧，如何在保留传统烟熏肉制品独特风味的基础上降低或消除甲醛的安全风险，已成为对传统烟熏肉制品发展的一个挑战。

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