傅里叶变换近红外光谱技术测定绿茶全氮量

杨 丹，刘 新*，张颖彬，尹 鹏

（中国农业科学院茶叶研究所，农业部茶叶质量监督检验测试中心，浙江 杭州 310008）

摘 要：建立准确性高、稳定性好的绿茶全氮量的偏最小二乘定量分析模型。在4 691～3 959、5 126～4 848 cm－1波段区间内，光谱经过一阶导数与平滑处理后，模型的预测性能最好，外部验证集样品的预测值与实测值的预测均方差（RMSEP）为0.092 5%，相关系数为0.993 9。根据嫩度等级，建立了绿茶全氮量子模型，提高了模型的预测性能。嫩度为3 级的子模型预测结果最好，验证集样品的全氮量的预测值与实测值的RMSEP值最小，为0.037 9%，相关系数为0.996 1。绿茶全氮量近红外光谱检测技术是一种绿色、快速、高效的新型分析技术，能够实现快速测定绿茶全氮量，评价绿茶品质。

关键词：近红外光谱技术；绿茶；全氮量；子模型

Determination of Total Nitrogen in Green Tea by Fourier Transform Near Infrared Spectroscopy

Yang Dan, Liu Xin*, Zhang Ying-bin, Yin Peng

(Tea Quality and Supervision Testing Center, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute of Chinese Academy of
Agriculture Science, Hangzhou 310008, China)

Abstract: A highly accurate and stable calibration model of total nitrogen content in green tea was established based on partial least square regression. The model demonstrated great predictive performance after the first derivative processing and smoothing in the spectral range of 4 691–3 959 cm-1 and 5 126–4 848 cm-1. The correlation coefficient of predicted and chemically measured values in the validation set was 0.993 9 and the RMSEP was 0.092 5%. The prediction performance was improved by developing sub-models of total nitrogen in green tea according to different tenderness. The prediction performance of the tenderness level 3 model was the best. The RMSEP in the validation set was the smallest, 0.037 9%,
and the correlation coefficient was 0.996 1. Thus, near infrared spectroscopy can provide a green, rapid and efficient technique for the detection of total nitrogen in green tea and quality evaluation.

Key words: near infrared spectroscopy; green tea; total nitrogen content; sub-model

中图分类号：TS272.7；O657.33 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0147-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408029

全氮量与绿茶品质密切相关，是重要的品质指标值[1]，绿茶中的总氮主要包括蛋白质、游离氨基酸、生物碱、叶绿素、芳香物质中的含氮化合物等成分中的氮。绿茶中全氮量的传统测定方法以凯氏定氮法[2]为主，此测定方法存在测定时间长、过程繁琐、污染环境等缺陷。近红外光谱技术是一种绿色、快速、高效的新型定性、定量分析技术，目前在农产品[3-4]、食品工业[5-6]等领域已广泛应用，是近年来发展最快的测定技术之一，在茶叶及茶制品的理化检测、品质评价、真伪识别等方面也表现出巨大的潜力。

日本最早开始研究近红外光谱技术在茶叶中的应用，测定绿茶中包括总氮量在内的主要化学成分[7-8]，已研制出专门的近红外分析仪，广泛应用于茶叶的品质检测以及茶叶生产加工过程中的质量管理[9-10]。而我国有关近红外光谱技术还处于实验室研究阶段，主要集中在成品茶[11-12]、茶汤[13-15]、茶鲜叶[3,16]常规理化成分的测定和茶叶种类产地识别[17-19]等方面，关于应用现代近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIR）技术检测绿茶中全氮量的研究报道甚少，与日本相比，我国茶叶因茶树品种、种植地域、加工工艺的不同，绿茶种类繁多，有必要研制出适用于我国茶叶品质检测的实用模型。

本实验将开展利用傅里叶变换近红外光谱（fourier transform near infrared spectroscopy，FT-NIR）技术检测绿茶全氮量的研究，以期建立稳定性好、精确度高的绿茶全氮量近红外分析模型。全氮量与绿茶嫩度密切相关，鲜叶原料品质的优劣，主要与鲜叶嫩度相关。绿茶的嫩度等级从单芽、一芽一叶、一芽二叶直到较粗老产品，全氮量的变化趋势明显且较易分类，为了进一步提高绿茶全氮量近红外定量分析模型的预测准确度，对绿茶样品进行评审分类，建立绿茶全氮量不同嫩度等级的子模型。希望通过本实验的研究，能推进近红外光谱技术在茶叶成分检测中的应用推广，提高茶叶产品相应的品质检测水平。

1 材料与方法

1.1 材料及制备

选用2011—2012年的具有代表性的绿茶样品425 个，每年分多次取样且所有样品各不相同，不断的增加模型中的样本数量。为了更好的增加稳定性，每个样品均在同一天测定化学值并采集光谱图。样品覆盖全国主要产茶区，包含茶树品种不同（中小叶种、大叶种）、老嫩度差异明显，加工工艺不同（炒青、烘青、蒸青等）的样品。每份样品取30 g左右，选用0.5 mm的筛网，粉碎离心过筛，得到粒度均匀的粉碎样。

1.2 仪器与设备

AntarisⅡ傅里叶近红外光谱分析仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；KJELTEC2300全自动定氮仪 瑞典Foss Tecator公司；ZM200超离心研磨机（0.5 mm的筛网） 德国Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 全氮量的测定

采用凯氏定氮法，称取0.5 g绿茶粉碎样于消化管，加入浓硫酸与催化剂消解，用全自动定氮仪测定每份样品全氮量，同时测定茶样的干物质率，将全氮量以干态质量分数表示。取3 次平行测定的平均值为每个样品的实际测定值。

1.3.2 光谱采集

采用傅里叶近红外光谱分析仪扫描粉碎过筛的样品，每个样品重复装样3 次，装样量（20、10 mL小烧杯）、样品松紧度（金属图章压实），扫描次数64 次，分辨率4 cm－1，光谱采集范围3 800～12 000 cm－1，旋转装样皿，每个样品扫描前均采集背景光谱。

1.3.3 绿茶全氮量校正模型的建立与外部验证

考虑到样品量较大，根据全氮量含量大小排序，平均隔n 个样品选择1 个样品的方式来选择验证集的方法较为繁琐，且前期实验的预测结果比较也与TQ软件自动选择的相当。本实验利用TQ软件自动选择325 个样品作校正集，全谱波段下采用偏最小二乘（partial least square，PLS）回归法建立校正模型。对光谱进行预处理：多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、标准正态变量变换（standard normal variate，SNV）、一阶导数（first derivative，FD）、卷积平滑法（savitzky-golay filter，SG）、Norris导数滤波（norris derivative，ND）。比较对校正模型的影响；选择波段区间：考虑全谱区、避开仪器噪声信号、水分、水蒸气吸收波数区间、选择氮的特征吸收波段区间；对校正模型进行内部交叉验证。

选择余下100 个样品作外部验证集，验证模型的预测性能。所有数据处理均在仪器自带的TQ Analyst软件中进行，以校正集样品的均方差（RMSEC）、交叉验证均方差（RMSECV）、相关系数、因子数为指标来优化模型，以验证集样品的预测均方差（RMSEP）、相关系数和性能指数考察模型的预测准确度。

1.3.4 绿茶样品的嫩度分级与子模型的建立

根据GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》，对425 个绿茶样品进行感官审评，并根据老嫩度的明显差异进行分级：从单芽、一芽一叶、一芽二叶以及较粗老的精制茶等，共6 个等级。

将绿茶样品根据嫩度等级在全谱波段下采用PLS建立绿茶全氮量的子模型，不进行光谱预处理。按全氮量排序，隔n选1的方式，每个嫩度等级分别选出6 个验证集样品，余下的为校正集样品。将各嫩度等级的校正集样品合并，建立全氮量总校正模型。各子模型和总模型预测验证集样品全氮量，评价子模型预测性能。

2 结果与分析

2.1 绿茶全氮量的实测值

随着绿茶嫩度的增加，全氮含量越高，结果见表1。特级到2级都属于较嫩的茶，从单芽到一芽二叶，多为名优绿茶。嫩度等级被评为3级的样品以大宗型绿茶居多，炒青较多。嫩度等级被评为4级和5级的样品的全氮量均值为4.48%、3.89%，属于比较粗老的绿茶，如珠茶、眉茶等。

表 1 绿茶全氮量实测值

Table 1 Measured values of total nitrogen content in green tea

2.2 绿茶近红外平均光谱图

从图1可知，波段区间3 900～5 100 cm－1范围内近红外透光率大，信息量丰富。12 000～10 200、3 900～3 800 cm－1处仪器产生的噪声信号较大；在5 100～5 600 cm－1，6 900～7 400 cm－1之间仍会受水蒸气的影响产生了较小的噪声信号。因此在模型建立时需要考虑是否有必要避开这些波数区间。氮的NIR吸收主要与N—H的分子振动相关。有学者研究表明：N—H
键伸缩振动的一级倍频在6 666 cm－1附近，伸缩振动与弯曲振动的组合频在5 000 cm－1附近，带有N—H的杂环芳香化合物，较强的一级倍频出现在6 835 cm－1，组合频出现在4 715 cm－1附近[20]。而蛋白质的特征谱带为10 277～9 804cm－1、6 667～6 536 cm－1的N—H倍频吸收，以及4 878～4 854 cm－1的N—H组合频吸收，4 613～4 587cm－1的N—H与C=O/N—H /C—N组合频[21]。因此在模型建立时需要考虑特征波数区间的选取。

图 1 绿茶近红外平均光谱图

Fig.1 Average near-infrared spectrograms of green tea

2.3 波段选择与光谱预处理对绿茶全氮量模型的影响

采用PLS回归法建立模型，采用TQ软件中的Spectrum Outlier diagnostic排除偏差较大的9 个异常值，最终确定选择316 个样品作校正集，在全谱波段3 814～12 000cm－1范围内建立的绿茶全氮量的PLS校正模型。各波段区间的模型在最佳光谱预处理下的预测结果如表2所示。

表 2 波段区间与光谱预处理选取对全氮量模型预测性能的影响

Table 2 Model statistical parameters for total nitrogen content under different wavebands and spectral pretreatments

以RMSEP为评价指标，从表2可以看出，在4 691～3 959、5 126～4 848 cm－1（序号6）两波段区间内的模型预测性能最好，此区间内包含了主要的N—H键、N—H与C—N键、N—H与C=O键的特征吸收波数，且避开了模型的水分与噪声干扰，光谱经过一阶导数与SG平滑处理后，验证集样品的预测值与实测值的RMSEP为0.092 5%。此外，与在全谱区（序号1）建立的模型相比，当波段区间避开水分、水蒸气吸收、仪器噪声后，模型的预测结果略好，RMSEP由原来的0.098 0%降到0.093 8%（序号2）和0.093 1%（序号8），因子载荷图也降低了一维。实验结果证明，在建模之前根据组分吸收近红外的信息对波数区间进行选择，是一种有效的优化模型方法，有助于减少噪音信号的影响、提高运算速率和模型的稳定性。

2.4 绿茶全氮量校正模型的建立与外部验证

a.校正集样品实际测定值和模型预测值，建模因子数为9，RMSEC为0.088 4，相关系数为0.994 8；b.模型因子载荷图；RMSEC为0.092 5，相关系数为0.993 9；c.验证集样品实际测定值和模型预测值；d.实际测定值和模型预测值的误差。

图 2 绿茶全氮量的校正模型与外部验证结果

Fig.2 Calibration model of total nitrogen content in green tea and external verification results

采用优选后的波段区间和一阶导数与SG平滑处理，建立了绿茶全氮量的偏最小二乘模型，校正模型的因子载荷图见图2b，在建模因子为9时，RESECV值趋于平缓，已降到最低值，因此选择9个因子建立校正模型。模型因子数为9时，316 个校正集的绿茶样品全氮量的实测值与预测值见图2a；所有校正集样品的绿茶全氮量的实测值与预测值的校正均方差（RMSEC）为0.088 4%，预测误差在0.001 1%～0.325 9%之间（图2d），平均预测误差0.069 2%，相关系数为0.994 8。为了更好的评价模型的预测性能，选择100个样品作外部验证集；用已建立的校正模型对其进行预测，预测结果如图2c所示：验证集样品的全氮量的预测值与实测值的RMSEP为0.092 5%，预测误差在0.191 2%～0.0001%之间（图2d），平均预测误差0.079 3%，相关系数为0.993 9，绿茶全氮量模型的预测结果很好。

将100 个验证集样品全氮量的实测值与模型预测值采用SAS软件进行T检验分析，标准偏差为0.009 9，在0.05显著性水平下，T值为－0.18，P值为0.8598，2 种测定方法无显著性差别，可以应用傅里叶近红外光谱技术快速测定绿茶全氮量。

2.5 绿茶全氮量子模型的建立与外部验证

表 3 全氮量子模型统计参数

Table 3 Statistic parameters of sub-models for total nitrogen content

从表3可以看出，绿茶样品根据嫩度等级分类后，建立的各子模型的校正集样品的RMSEC均有不同程度的降低。与嫩度总模型的预测性能相比，特级、1、3、5级的RMSEP值均值低于总模型。其中3、5级子模型的相关系数均在0.99以上。在校正模型的建立与应用中，根据嫩度等级来建立子模型，可以提高模型的预测性能。3级子模型的对3级验证集样品的预测结果最好，样品的全氮量的预测值与实测值的RMSEP值最小，为0.037 9，相关系数为0.996 1。

各子模型对验证样品的预测值与实测值的比较，见表4。嫩度等级评为特级、1、5级的验证集样品的子模型预测结果（平均偏差分别为0.007%、0.018%、0.026%）均优于总模型的预测结果（平均偏差分别为0.057%、0.041%、0.097%），其中特级样品采用特级子模型预测全氮量时，验证样品的预测值与实测值的平均偏差最小，为0.007%，预测值最接近实测值，而采用中小叶种和总模型预测时，其平均偏差相对较大，分别为0.049%、0.057%。3级验证集样品用总模型和3级子模型预测时，其平均偏差都很小，分别为0.015%、0.018%，预测值接近实测值；因此，对于嫩度较好的样品，采用嫩度相应的子模型对其进行预测，可以提高其预测性能。对于粗老的5级样品，采用5级子模型进行预测，预测结果更好。对于嫩度一般的3级样品，由于总模型中3级样品总量最多，是其他样品的2～3 倍，因此进行预测时，采用子模型与总模型的预测结果相当。这也说明了校正集代表性样品数量的重要性。

表 4 验证集样品的实测值与预测值

Table 4 Actual measured and calculated values of the validation set

%

3 结 论

传统的凯氏定氮法，不仅费时，还需大量试剂，本实验采用偏最小二乘法，结合傅里叶变换近红外光谱仪，建立了近红外光谱技术测定绿茶含氮的定量分析模型，模型能满足绿茶全氮量的快速检测要求。验证集样品的RMSEP为0.092 5，相关系数分别为0.993 9。此外，绿茶种类繁多，嫩度不一，实验根据嫩度等级，建立了绿茶全氮量子模型，提高了模型的预测性能。与总模型的预测性能相比，特级、1级、3级、5级的RMSEP值均低于总模型。嫩度为3级的子模型预测结果最好，样品的全氮量的预测值与实测值的RMSEP值最小，为0.037 9，相关系数为0.996 1。每年可继续添加新样品来优化模型，提高模型的实际检测性能，进一步推广近红外光谱技术在茶叶品质快速检测领域的应用。

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