高效液相色谱法测定糜子中酚酸类化合物

鹿 茸1，田 琴1，孙 楠1，乔治军2，张丽珍1,*，牛 伟3，单 璐1，冀佩双1

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；

2.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室

山西 太原 030006；3.山西省农业科学院，山西 太原 030006）

摘 要：为探索糜子麸皮和糜米中酚酸类物质的成分和含量，采用福林-酚法和高效液相色谱法测定比较糜子麸皮和糜米中自由酚含量和酚酸类物质的种类。结果表明：不同品种糜子麸皮之间自由酚含量差异不显著，糜米之间自由酚法差异极其显著（P＜0.01）。同一品种糜子麸皮和糜米之间自由酚含量差异显著（P＜0.05），糜子麸皮自由酚含量远高于糜米。赤糜2号麸皮和糜米中自由酚含量最高，麸皮中为159.22 mg没食子酸/100 g，糜米中为47.98 mg没食子酸/100g。糜子中检测到的酚酸类物质有绿原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸。

关键词：麸皮；糜米；酚酸类物质；高效液相色谱法

Determination of Phenolic Compounds in Proso Millet by High Performance Liquid Chromatography

LU Rong1, TIAN Qin1, SUN Nan1, QIAO Zhi-jun2, ZHANG Li-zhen1,*, NIU Wei3, SHAN Lu1, JI Pei-shuang1

(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Institute of Germplasm Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030006, China; 3. Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030006, China)

Abstract: The Folin-Ciocalteu method was used to assay the free phenolic content of proso millet. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to analyze its phenolic composition. The results showed that free phenolic content was not significantly different among different varieties of millet bran, but significantly different (p ＜ 0.01) in the debranned grain. Free phenolic content was significantly different (p ＜ 0.05) between the bran and grain from the same variety, and the bran had much higher free phenolic content. The highest free phenolic content was found in both bran and grain from proso millet Chimi 2, with 159.22 mg gallic acid equiv/100 g bran, and 47.98 mg gallic acid equiv/100 g grain. Chlorogenic acid, syringic acid, vanillic acid, p-coumaric acid and ferulic acid were the major phenolic acids in proso millet.

Key words: bran; proso millet; phenolic compound; high performance liquid chromatography

中图分类号：S515 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0152-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408030

糜子（Panicum miliaceum L.）属禾本科（Gramineae）黍属（Panicum L.），又称黍、稷和穄，属特色小杂粮[1]。起源于中国黄河流域的黄土高原地区，具有耐盐碱、耐冷、耐旱、耐贫瘠的特点，是干旱、半干旱地区主要的粮食作物，也是我国主要的制米作物[2]。糜子果实为颖果，脱壳后称为糜米。随着人民生活水平不断提高，业界对全谷物食品关注度增加，作物品质越来越受到人们关注，小杂粮的育种栽培及功能成分的研究也得以快速发展。流行病学研究表明增加糜子及其加工产品的摄入量可以降低一些慢性病的风险，如血液中胆固醇[3]、心血管疾病[4]、Ⅱ型糖尿病[5]和肝损伤[6]。因此进一步探明糜子中对健康起促进作用的物质有着重要的意义。

植物多酚是指分子结构中有若干个酚羟基的植物成分的总称[7-8]，其苯环上的羟基极易失去电子，可以作为良好的电子供体，具有抗氧化功能。植物多酚广泛存在于植物的皮、根、叶和果实中，其含量仅次于纤维素、半纤维素以及木质素[9]。近年来植物多酚的研究成为植物代谢产物研究的热点之一，但有关的研究多集中在水果[10-12]、蔬菜以及茶叶中[13]。研究发现谷物中含有多种酚酸类物质[14]，如阿魏酸[8,15-18]、香豆酸[19]等。谷物中酚酸类物质的种类与含量和果蔬相当[7-8,20]，某些活性物质含量甚至要高于果蔬。张莉等[21]研究表明添加麸皮生成的食醋中的总多酚和总抗氧化能力均优于未添加麸皮的食醋。臧盛等[22]发现不同品种糜子间多酚含量差异较大。本实验针对糜子麸皮和糜米中的多酚物质，采用高效液相色谱法分析其酚酸成分和含量，为拓宽糜子麸皮的利用价值及其为麸皮用于天然抗氧化剂的开发提供依据，为培育与选用高生理活性物质含量的糜米谷物食品加工原料提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糜子样品（赤黍2号、粘丰7号、齐黍1号、粘丰5号、白糜子、黄糜子、赤糜2号）均由山西省农业科学院农作物品种资源研究所提供，样品保存于该所的作物种质资源中期贮存库，2012年产于山西。

没食子酸（批号：SLBC5726V，纯度≥98.5%）、绿原酸（批号：SLBD3109V，纯度≥95%）、丁香酸（批号：BCBB6440V，纯度≥95%）、香草酸（批号：BCBF7869V，纯度≥97.0%，色谱纯）、p-香豆酸（批号：91M1197V，纯度≥98.0%，色谱纯）、阿魏酸（批号：STBB8393V，纯度≥99%，色谱纯） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；福林-酚 北京索莱宝科技有限公司；乙腈（色谱纯） 天津市四友精细化学品有限公司；95%乙醇 河北中泰药械有限公司；Na2CO3 天津鹏达化学试剂有限公司；三氟酸（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

JLGJ-45型检验砻谷机 浙江台州市粮仪厂；Cyclotec 1093型旋风式样品磨 丹麦Foss公司；DHG-9040S电热恒温鼓风干燥箱 宁波东南仪器有限公司； BS223S电子天平 德国Sartorius公司；2-16PK高速冷冻离心机 赛多利斯科学仪器有限公司；RE-2000A型旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司；752PC型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；1200型高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的预处理

将糜子样品用检验砻谷机脱壳后，分别将糜子的麸皮和糜米粉碎成粉末状，分装，－20 ℃保存备用。

1.3.2 含水量的测定

准确称取各糜子样品的麸皮及糜米m1，用锡箔纸包好后放在烘箱内，于110 ℃烘干72h，取出后称得烘干后样品质量m2，按式（1）计算样品含水量：

（1）

式中：m1为样品的初始质量/g；m2为样品烘干后的质量/g。

1.3.3 自由酚的提取

将糜子麸皮（或糜米）与95%乙醇溶液按1∶30或
1∶15（g/mL）的比例混匀，充分振荡混合提取5 min后，2500 r/min离心10 min，收集上清液，重复3 次，合并上清液，于75 ℃水浴条件下旋转蒸干，用去离子水定容至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，分装，－20 ℃保存备用。

1.3.4 总酚含量的测定

1.3.4.1 标准液的制备

准确称取没食子酸25 mg溶于25 mL去离子水中，得到标准溶液的母液。将母液稀释至系列质量浓度为0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL的标准液，避光保存。

1.3.4.2 总酚含量的测定

采用福林-酚法测定总酚含量[23]。在玻璃培养管中加入100 μL样品液（或标准溶液）、400 μL去离子水和100 μL福林-酚试剂，充分混匀，反应6 min。再加入1 mL 7g/100 mL的Na2CO3溶液和0.8 mL去离子水，充分混匀，室温条件下避光静置90 min。在760 nm波长处测定吸光度。多酚含量以每100 g样品干质量中对应的没食子酸的质量表示（mg没食子酸/100 g样品）。

1.3.5 高效液相色谱检测样品中多酚的成分和含量

1.3.5.1 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流速0.5 mL/min；进样量10 μL；检测波长280 nm；流动相为乙腈-水（2∶8，V/V，pH3.0）。

1.3.5.2 标准液的配制

准确称取酚酸标准品各30 mg溶于少量流动相中，溶解后移至100 mL容量瓶，用流动相定容至100 mL，得到酚酸标准品的母液。将标准母液稀释至系列质量浓度，以备检测各酚酸的标准曲线。

1.3.5.3 色谱峰分离度的计算

将配制好的标准溶液混合进样，按1.3.5.1节色谱条件分析，按式（2）计算色谱峰分离度R：

（2）

式中：t1为色谱峰1的保留时间/min；t2为色谱峰2的保留时间/min；y1为色谱峰1的峰宽；y2为色谱峰2的峰宽。R＞1.5即为完全分离。

1.3.5.4 加标回收率

将酚酸标准液稀释至一定质量浓度，取100 μL，再加入100 μL待测样品液，充分混匀后检测加标回收率。

1.4 数据分析

以上实验每份样品做3次重复，结果表示为平均值±标准偏差。使用Excel 2010分析数据并绘制柱状图；使用SPSS 19.0进行方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 样品含水量

表 1 不同品种糜子的含水量

Table 1 Water contents in different varieties of proso millet

%

如表1所示，糜子麸皮的含水量为7.33%～8.29%，糜米的含水量为10.19%～11.35%，糜子麸皮中水分含量少于糜米，且品种间差异显著（P＜0.05）。

2.2 总酚含量的测定

2.2.1 没食子酸标准曲线

采用福林-酚法绘制没食子酸标准曲线的回归方程为Y=0.0022X＋0.0217，R2=0.9987，可以用于测定酚酸含量。

2.2.2 样品中自由态酚酸含量

**.差异极其显著（P＜0.01）；*.差异显著（P＜0.05）。

图 1 不同品种糜子的自由酚含量

Fig.1 Free phenol contents in different varieties of proso millet

由图1和表2可知，糜子麸皮中自由酚含量为114.57～159.22 mg没食子酸/100 g样品，不同品种糜子麸皮之间自由酚含量没有显著性差异。糜米中自由酚含量为26.84～47.98mg没食子酸/100g样品，不同品种糜子糜米之间自由酚含量差异极其显著（P＜0.01）。赤糜2号麸皮和糜米自由酚含量最高，麸皮159.22 mg没食子酸/100 g样品，糜米47.98 mg没食子酸/100 g样品。粘丰7号麸皮和糜米之间自由酚含量差异显著（P＜0.05），其他品种同一品种间麸皮和糜米的自由酚含量差异极其显著
（P＜0.01），糜子麸皮自由酚含量远高于糜米。

表 2 不同品种糜子的自由酚含量

Table 2 Free phenol contents in different varieties of proso millet

mg没食子酸/100 g样品

2.3 高效液相色谱法分析样品多酚提取物

2.3.1 标准品的测定

将配制好的标准溶液混合进样，按1.3.5.1节色谱条件分析，绿原酸与丁香酸之间分离度为20.90，丁香酸与香草酸之间分离度为2.59，香草酸与p-香豆酸之间分离度为22.11，p-香豆酸与阿魏酸之间分离度为10.69。绿原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸均能良好分离（图2）。

1.绿原酸；2.丁香酸；3.香草酸；4. p-香豆酸；5.阿魏酸。

图 2 混合酚酸类标准溶液分离色谱图

Fig.2 Chromatogram of mixed pheolic acid standards

2.3.2 高效液相色谱加标回收率

表 3 加标回收率

Table 3 Spike recoveries of 5 pheolic acids

由表3可知，5种酚酸标准品的加标回收率为93.2%～104.1%，说明实验方法准确度较高。

2.3.3 高效液相色谱法测定糜子样品多酚含量

由表4可知，糜子中酚酸类物质有绿原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸，种类丰富。麸皮和糜米中均含有丁香酸和p-香豆酸，其含量分别为丁香酸0.85～1.63 mg/100 g样品（麸皮）、丁香酸0.39～1.00 mg/100 g样品（糜米）、p-香豆酸1.33～2.06 mg/100 g样品（麸皮）、p-香豆酸0.57～0.84 mg/100 g样品（糜米）。白糜子、黄糜子、赤糜2号麸皮中均含有以上5种酚酸，其中绿原酸含量较高，分别为：白糜子2.94 mg/100 g样品、黄糜子6.89 mg/100 g样品、赤糜2号8.05 mg/100 g样品。不同品种的糜子中酚酸类物质成分和含量均不相同，相同品种麸皮和糜米中酚酸的种类和含量差别明显。

表 4 样品中酚酸类成分及含量

Table 4 Phenolic acids identified in different varieties of proso millet expressed as mg per 100 g sample

mg/100 g样品

注：ND.未检测到。

3 结 论

本实验对比了糜子麸皮和糜米中自由酚含量的差别，并利用高效液相色谱对糜子中酚酸类物质的种类和含量进行了研究。结果表明，不同品种糜子麸皮之间自由酚含量差异不显著，不同品种糜子糜米之间自由酚含量差异极其显著（P＜0.01）。赤糜2号麸皮和糜米中自由酚含量最高，麸皮中159.22 mg没食子酸/100 g样品；糜米中47.98 mg没食子酸/100 g样品。比徐元元等[24]报道的糜子自由酚含量高，可能是由于糜子品种不同。可见不同品种糜子多酚含量存在差异，有些品种的抗氧化潜力有待发掘，日后应进一步优化多酚的提取工艺。粘丰7号麸皮和糜米之间自由酚含量差异显著（P＜0.05），其他品种同一品种间麸皮和糜米自由酚含量差异极其显著
（P＜0.01），糜子麸皮自由酚含量远高于糜米。这与汪海波等[25]对燕麦中抗氧化成分的研究结果相似（燕麦麸皮抗氧化成分高于胚乳）。

5种酚酸标准品的加标回收率为93.2%～104.1%，说明本实验方法准确度较高。糜子中酚酸类物质有绿原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸，种类丰富。麸皮和糜米中均含有丁香酸和p-香豆酸，白糜子、黄糜子、赤糜2号麸皮中均含有绿原酸。不同品种糜子的酚酸类物质种类和含量不尽相同，相同品种糜子麸皮和糜米中酚酸类物质种类和含量差别明显。结果表明，糜子麸皮中酚酸类物质含量丰富，有较高的利用价值，但在生产中往往都被废弃，今后需要对糜子中酚酸类物质提取工艺和作用机制进行深入研究，以期为生产实践提供依据。

参考文献：

[1] 王星玉, 王纶, 温琪汾, 等. 黍稷的名实考证及规范[J]. 植物遗传资源学报, 2010, 11(2): 132-138.

[2] 王星玉, 王纶, 温琪汾, 等. 山西是黍稷的起源和遗传多样性中心[J]. 植物遗传资源学报, 2009, 10(3): 465-470; 474.

[3] NISHIZAWA N, FUDAMOTO Y. The elevation of plasma concentration of high-density lipoprotein chloesterol in mice fed with protein from proso millet[J]. Biosciences Biotechnology and Biochemistry, 1995, 59(2): 333-335.

[4] KUMARI K S, THAYUMANAVAN B. Characterization of starches of proso, foxtail, barnyard, kodo and little millets[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 1998, 53(1): 47-56.

[5] DENERY-PAPINI S, NICOLAS Y, POPINEAU Y. Efficiency and limitation of immunochemical assays for the testing of gluten-free foods[J]. Journal of Cereal Science, 1999, 30(2): 121-131.

[6] NISHIZAWA N, SATO D, ITO Y, et al. Effects of dietary protein of proso millet on liver injury induced by D-galactosamine in rats[J]. Biosciences Biotechnology and Biochemistry, 2002, 66(1): 92-96.

[7] DYKES L, ROONEY L W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits[J]. Cereal Foods World, 2007, 52(3): 105-111.

[8] LIU Ruihai. Whole grain phytochemicals and health[J]. Journal of Cereal Science, 2007, 46(3): 207-219.

[9] 宋立江, 狄莹, 石碧. 植物多酚研究与利用的意义及发展趋势[J]. 化学进展, 2000, 12(2): 161-170.

[10] WOLFE K, WU Xianzhong, LIU Ruihai. Antioxidant activity of apple peels[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(3): 609-614.

[11] 李建新, 王娜, 王海军, 等. 苹果多酚的减肥降脂作用研究[J]. 食品科学, 2008, 29(8): 597-599.

[12] SUN Jie, CHU Yifang, WU Xianzhong, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of common fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(25): 7449-7454.

[13] 李富华, 郭晓晖, 夏春燕, 等. 全谷物酚类化合物抗氧化活性研究进展[J]. 食品科学, 2012, 33(13): 299-304.

[14] 郝杰, 张长虹, 曹学丽. 七种谷物麸皮中的酚酸类成分分析[J]. 食品科学, 2010, 31(10): 263-267.

[15] FARDET A, ROCK E, REMESY C. Is the in vitro antioxidant potential of whole-grain cereals and cereal products well reflected in vivo?[J]. Journal of Cereal Science, 2008, 48(2): 258-276.

[16] KIM K H, TSAO R, YANG R, et al. Phenolic acid profiles and antioxidant activities of wheat bran extracts and the effect of hydrolysis conditions[J]. Food Chemistry, 2006, 95(3): 466-473.

[17] VAHER M, MATSO K, LEVANDI T, et al. Phenolic compounds and the antioxidant activity of the bran, flour and whole grain of different wheat varieties[J]. Procedia Chemistry, 2010, 2(1): 76-82.

[18] Abdel-Aal E S M, RABALSKI I. Bioactive compounds and their antioxidant capacity in selected primitive and modern wheat species[J]. The Open Agriculture Journal, 2008, 2: 7-14.

[19] MCDONOUGH C M, ROONEY L W. Structure and phenol content of six species of millets using fluorescence microscopy and HPLC[J]. Cereal Foods World, 1985, 30(8): 550-550.

[20] OKARTER N, LIU Ruihai. Health benefits of whole grain phytochemicals[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2010, 50(3): 193-208.

[21] 张莉, 李志西. 小麦麸皮对不同原料食醋抗氧化性的影响[J]. 麦类作物学报, 2009, 29(5): 915-918.

[22] 臧盛, 杨联芝, 王敏, 等. 15 种糜子壳粉的多酚类化合物的抗氧化活性[J]. 西北农业学报, 2010, 19(9): 139-143.

[23] ZHANG Mingwei, ZHANG Ruifeng, ZHANG Fangxuan, et al. Phenolic profiles and antioxidant activity of black rice bran of different commercially available varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(13): 7580-7587.

[24] 徐元元, 国旭丹, 贺丽霞, 等. 常见6 种杂粮与2 种主粮的抗氧化活性比较研究[J]. 食品科学, 2012, 33(7): 20-25.

[25] 汪海波, 谢笔钧, 刘大川, 等. 燕麦中抗氧化成分的初步研究[J]. 食品科学, 2003, 24(7): 62-67.