应用DPO-PCR技术检测肠出血性
大肠杆菌O157∶H7

徐义刚1，李丹丹2，崔丽春3，刘忠梅1，李苏龙1

（1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江 哈尔滨 150001；2.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
海南 海口 570125；3.东北林业大学研究生院，黑龙江 哈尔滨 150040）

摘 要：利用双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则，以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因为靶基因设计一对DPO引物，经过反应体系的优化，建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DPO-PCR检测方法，其检测灵敏度约为94 CFU/mL。与常规PCR方法相比，所建立的DPO-PCR方法对退火温度不敏感，在引物设计和实验过程中不需要对引物及其退火温度反复优化，同时基于DPO引物的特殊结构又增强了其特异性。DPO-PCR方法设计简易、特异性强，为致病性微生物的快速准确检测提供了新途径。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7；rfbE基因；双启动寡核苷酸引物聚合酶链式反应

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 by DPO-PCR Method

XU Yi-gang1, LI Dan-dan2, CUI Li-chun3, LIU Zhong-mei1, LI Su-long1

(1. Technical Center of Inpsection and Quarantine, Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China;

2. Technical Center of Inpsection and Quarantine, Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Haikou 570125, China;

3. School of Graduate, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Abstract: The aim of this study was to develop a method for the detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 (EHEC O157:H7) using dual-priming oligonucleotide (DPO) PCR technique. Based on DPO primer principle, a pair of DPO primers was designed using the rfbE gene of EHEC O157:H7 as the target. Following the optimization of the reaction system, the DPO-PCR method for the detection of EHEC O157:H7 was successfully developed with a sensitivity of
94 CFU/mL. Compared to the conventional PCR method, the DPO-PCR method was not sensitive to annealing temperature. Thus, it was not required to repeatedly optimize primer and its annealing temperature during primer design and testing. Moreover, the specific structure of DPO primers improved the specificity of conventional PCR method. Therefore, the DPO-PCR method provides a new way for rapid and accurate detection of pathogenic microorganisms.

Key words: Escherichia coli O157:H7 (EHEC O157:H7); rfbE gene; dual-priming oligonucleotide polymerase chain reaction (DPO-PCR) method

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0160-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408032

肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是大肠杆菌的一个亚型，主要致病菌株血清型为O157∶H7，呈全球性分布，可产生志贺氏毒素样细胞毒素[1-2]。畜禽为本病储存宿主和主要传染源，如牛、羊、猪等，以牛带菌率最高。EHEC O157∶H7传播途径复杂多样，主要通过进食被污染的食物、水或与病人接触而传染，出现腹泻、出血性结肠炎、溶血性贫血和溶血性尿毒综合征等临床症状[3-6]。常见被污染的食物有牛肉、牛奶及其制品、禽肉、羊肉、蔬菜和水果等，快餐类食品极易造成暴发性食物中毒。EHEC O157∶H7引起的危害受到广泛关注，建立快速、准确的检测方法对防控该致病菌具有重要意义。

传统的检测方法（分离培养结合生化与血清学鉴定）检测时间长、敏感性差、严重影响检测效率[7-8]。为满足EHEC O157∶H7快速检测要求，研发出了免疫磁珠富集法[9]、生物传感器法[10-12]、蛋白芯片[13]、基因芯片[14]、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[15-20]、实时荧光PCR[21-23]和LAMP[24]等检测方法。其中，PCR方法因检测快速、灵敏度高，成为主要采用的检测方法。引物设计是建立有效PCR方法的关键因素，常规的PCR引物设计，不仅需要反复优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度，而且需要反复比对引物的特异性，以防止非特异性扩增，尤其是涉及多重PCR方法设计时，需要大量的实验以验证方法的特异性，费时又费力。

双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一种新型的引物设计方法：DPO引物分为2个部分，即长5’-端（18～25 bp，Tm＞65 ℃）和短3’-端（6～12 bp，GC含量为40%～80%），两者间用多聚次黄嘌呤连接；基于DPO引物的特殊结构，引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，实验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化，简化了引物设计和实验步骤；扩增时，只要DPO引物5’-端或3’-端有3 个以上碱基发生错配，PCR扩增就会终止，有效地阻断了非特异性扩增，特异性更强[25-28]。本研究利用该技术，建立了EHEC O157∶H7基于DPO引物的PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用实验菌株有：肠出血性大肠杆菌O157∶H7 ATCC 35150、产肠毒素大肠杆菌ATCC 35401、肠侵袭性大肠杆菌ATCC 43893、肠致病性大肠杆菌ATCC 43887、大肠杆菌ATCC 25922、阪崎肠杆菌ATCC 51329、单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19111、嗜水气单胞菌ATCC 7966、空肠弯曲菌ATCC 33560、变形杆菌ATCC 49027、沙门氏菌ATCC 10708、志贺氏菌ATCC 12022、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 9610、粘质沙雷菌ATCC 14756、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、霍乱弧菌ATCC 14035、副溶血弧菌ATCC 27519、溶藻弧菌ATCC 33839和创伤弧菌ATCC 33149 美国典型菌种保藏中心（ATCC）；溶血性链球菌CMCC 32121 中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC）；肠出血性大肠杆菌O157∶H7分离株2 株、拟态弧菌分离株1 株和大肠杆菌分离株2 株由本实验室分离保存。

1.1.2 试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；Taq DNA Polymerase、dNTP、MgCl2 日本TaKaRa公司；复合增菌培养基BPW 北京兰伯瑞生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因为靶基因，经BLAST分析，选取rfbE基因保守区域设计DPO引物，详见表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

表 1 引物序列

Table 1 Primers used in this study

1.2.2 细菌DNA提取

将1.1.1节中的菌株分别接种于5mL BPW培养基中，培养过夜，取1mL菌液，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，－20 ℃保存备用。

1.2.3 DPO-PCR反应体系优化

反应体系为25 µL：10×PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 µL；Mg2+（25 mmol/L）用量范围为0.5～5.0 µL，以0.5 µL递增；dNTP（2.5 mmol/L
for each）用量范围为0.25～2.5 µL，以0.25 µL递增；Taq DNA Polymerase （5 U/µL）用量范围为0.05～0.5 µL，以0.05 µL递增；DPO引物（上、下游各10 µmol/L）用量范围为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 µL；细菌DNA 模板1 µL，去离子水补充至25 µL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57.5 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30 个循环；72 ℃终延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

1.2.4 DPO-PCR退火温度不敏感性实验

将退火温度范围设为45～65 ℃，进行DPO-PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果，并与常规PCR引物进行比较。

1.2.5 DPO-PCR灵敏度实验

将菌体浓度约为9.4×106 CFU/mL的EHEC O157∶H7进行10倍梯度稀释，提取每级稀释度EHEC O157∶H7的基因组DNA，以此为模板进行DPO-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测确定检测灵敏度。

1.2.6 DPO-PCR特异性实验

利用建立的DPO-PCR方法检测1.1.1节所示菌株以及小鼠、鸡、鹅和猪肠道细菌（经检测不含EHEC O157∶H7）宏基因组，以验证本方法的特异性，并与常规PCR引物进行比较。

1.2.7 方法验证实验

将建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法应用于检验检疫实践工作中，以检验检疫行业标准（SN/T 0973—2010《进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7检测方法》）检测结果作为参照，验证其可靠性。

2 结果与分析

2.1 EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法的建立

以EHEC O157∶H7 rfbE基因为靶基因，设计一对DPO引物，经反应体系的优化，建立了EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法，优化后的反应体系为（25 µL）：10×PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 µL，Taq DNA Polymerase（5U/µL）0.1 µL（图1A中2泳道），Mg2+（25mmol/L）2.5 µL（图1B中5泳道），dNTP（2.5mmol/L）1.5 µL（图1C中6泳道），上、下游DPO引物（10µmol/L）各0.5 µL（图1D中5泳道），DNA模板1 µL，去离子水补充至25 µL。

A. Taq DNA 聚合酶（5 U/µL）浓度优化；1～10. 用量范围为0.05～0.5 µL，每0.05 µL递增；B. Mg2+ （25 mmol/L）浓度优化，1～10. 用量范围为0.5～5.0µL，每0.5 µL递增；C. dNTP浓度优化，1～10. 用量范围为0.25～2.5 µL，每0.25 µL递增；D. DPO引物（10 µmol/L）浓度优化，1～6. 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 µL；M. DNA marker 2000。

图 1 EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法的建立

Fig.1 Development of DPO-PCR method for the detection of
EHEC O157∶H7

2.2 DPO-PCR退火温度不敏感性

退火温度设为45～65 ℃时，利用DPO引物进行PCR扩增，扩增效率随着退火温度的变化基本保持一致，而利用常规引物进行PCR扩增时，扩增效率随着退火温度的升高逐渐增加后下降（图2），表明DPO引物的退火温度范围较宽。

1～12. 44.9、45.3、46.6、48.5、50.8、53.4、56.1、58.7、61.1、63.1、64.5、65.1 ℃；M. DNA marker 2000，左边1～12. 常规PCR引物扩增结果，右边1～12. DPO引物扩增结果。

图 2 DPO引物退火温度不敏感性

Fig.2 Insensitivity of DPO primers to annealing temperature

2.3 DPO-PCR检测灵敏度

将菌体浓度为9.4×106 CFU/mL的EHEC O157∶H7经105 倍稀释后，利用建立的DPO-PCR方法仍能有效扩增出目的基因片段（图3），显示该DPO-PCR方法检测EHEC O157∶H7的灵敏度为94CFU/mL。

M. DNA marker 2000；1. 9.4×106 CFU/mL；2. 9.4×105 CFU/mL; 3. 9.4×104 CFU/mL；4. 9.4×103 CFU/mL；5. 9.4×102 CFU/mL；6. 9.4×101 CFU/mL；7. 9.4×100 CFU/mL。

图 3 EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法检测灵敏度结果

Fig.3 Sensitivity of DPO-PCR method for EHEC O157∶H7

2.4 DPO-PCR检测特异性

利用建立的DPO-PCR方法检测1.1.1节所示细菌以及小鼠、鸡、鹅和猪肠道细菌宏基因组，结果显示：EHEC O157∶H7菌株 （ATCC 35150和2 株分离株）均为DPO-PCR阳性结果，其他为阴性结果，且未见非特异性扩增条带出现，而利用常规PCR引物扩增出现了与目的基因片段大小相近的非特异性条带（图4），表明本研究建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法较常规PCR特异性更强。

A. 常规PCR特异性；B. DPO-PCR特异性。其中，M. DNA marker 2000；1. 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 ATCC 35150；2、3. 肠出血性大肠杆菌O157∶H7分离株；4. 阪崎肠杆菌ATCC 51329；5. 产肠毒素大肠杆菌ATCC 35401；6. 肠侵袭性大肠杆菌ATCC 43893；7. 肠致病性大肠杆菌ATCC 43887；8. 变形杆菌ATCC 49027；9. 空肠弯曲菌ATCC 33560；10. 大肠杆菌ATCC 25922；11、12. 大肠杆菌分离株；13. 单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19111；14. 嗜水气单胞菌ATCC 7966；15. 沙门氏菌ATCC 10708；16. 志贺氏菌ATCC 12022；17. 金黄色葡萄球菌ATCC 29213；18. 小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 9610；19. 霍乱弧菌ATCC 14035；20. 副溶血弧菌ATCC 27519；21. 溶藻弧菌ATCC 33839；22. 创伤弧菌 ATCC 33149；23. 溶血性链球菌CMCC 32121；24. 拟态弧菌分离株；C. 特异性检测。其中，1’～4’. 小鼠、鸡、猪、鹅肠道细菌宏基因组；5’. 粘质沙雷菌 ATCC 14756；6’. 肺炎克雷伯氏菌 ATCC 10031；P. 阳性对照；N. 阴性对照。其中，左边1’～6’. 常规PCR结果，右边1’～6’. DPO-PCR结果。

图 4 EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法特异性结果

Fig.4 Specificity of DPO-PCR method for EHEC O157∶H7

2.5 方法实践验证

利用建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法对228份采集的样本进行了检测，共检测出4份EHEC O157∶H7阳性样本，经检验检疫行业标准法（SN/T 0973—2010）复检，两者检测结果一致，见表2，显示该方法具有良好的实用性。

表 2 方法实践应用

Table 2 Detection of EHEC O157∶H7 in real samples by the
DPO-PCR method

3 结 论

DPO引物与常规PCR引物相比，设计简易，不需要对引物参数进行反复优化，在45～65 ℃的退火温度范围内，DPO引物均能保持高效率扩增。此外，DPO引物中的次黄嘌呤碱基的氢键结合力弱，在DPO引物引导PCR扩增时，如果5'-端或3'-端存在3 个以上碱基错配，DPO引物便会与DNA模板发生脱离，终止PCR反应，有效地阻断非特异性扩增，增加了检测特异性，而且DPO引物自身以及引物间难形成二级结构，提高了扩增效率。实践应用证明，本研究建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR检测方法检测快速、结果准确，具有良好的实用性。

参考文献：

[1] RILEY L W, REMIS R S, HELGERSON S D, et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype[J]. New England Journal of Medicine, 1983, 308(12): 681-685.

[2] ORSKOV F, ORSKOV I. Escherichia coli serotyping and disease in man and animals[J]. Canada Journal of Microbiology, 1992, 38(7): 699-704.

[3] BOLTON F J, CROZIER L, WILLAMSON L K. Isolation of Escherichia coli O157 from raw product[J]. Letters in Applied Microbiology, 1996, 23(5): 317-321.

[4] PHILLIPS C A. The epidemiology detection and control of Escherichia coli O157[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999, 79(11): 1367-1381.

[5] 王燕, 谢贵林, 杜琳. 大肠杆菌O157:H7感染流行概况[J]. 微生物学免疫学进展, 2008, 36(1): 51-58.

[6] CALL D R, BORUCKI M K, LOGE F J. Detection of bacterial pathogens in environmental samples using DNA microarrays[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 53(2): 235-243.

[7] 宋宏新, 李宏. 肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测方法进展[J]. 食品科学, 2007, 28(11): 607-610.

[8] 陈苏红, 孙国祥, 王升启. 大肠杆菌O157:H7实验室诊断方法研究进展[J]. 浙江预防医学, 2005, 17(12): 52-54.

[9] 俞顺章, 卢林耿, 张幼展, 等. 快速检测大肠杆菌O157菌株在流行病学上的应用[J]. 中华流行病学杂志, 1999, 20(4): 237-239.

[10] DEMARCO D R, LIM D V. Detection of Escherichia coli O157: H7 in 10 and 25-gramground beef samples with an evanescent-wave biosensor with silica and polystyrene waveguides[J]. Journal of Food Protection, 2002, 65(4): 596-602.

[11] 李杜娟, 王剑平, 盖玲, 等. 快速检测大肠杆菌O157:H7的电化学阻抗免疫生物传感器[J]. 传感技术学报, 2008, 21(5): 709-714.

[12] 斯城燕, 叶尊忠, 王一娴, 等. SPR生物传感器快速检测大肠杆菌O157∶H7的研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2011, 31(10): 2598-2601.

[13] LEE W, PARK K S, KIM Y W, et al. Protein array consisting of sol-gel bioactive platform for detection of E. coli O157:H7[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2005, 20(11): 2292-2299.

[14] CALL D R, BROCKMAN F J, CHANDLER D P. Detecting and genotyping Escherichia coli O157:H7 using multiplexed PCR and nucleic acid microarrays[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 67(1/2): 71-80.

[15] 刘金华, 王蓓蕾, 马路遥, 等. 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、普通变形杆菌和副溶血弧菌多重PCR检测体系的构建[J]. 中国免疫学杂志, 2012, 28(12): 1120-1124.

[16] 曲泽慧, 陈佩佩, 张爱芹, 等. 产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2013, 40(7): 65-68.

[17] FACH P, PERELLE S, GROUT J, et a1. Comparison of different PCR teats for detecting Shigatoxin-Producing Escherichia coli O157 and development of an ELISA-PCR assay for specific identification of the bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 55(2): 389-392.

[18] SCOTTER S, ALDRIDGE M. Validation of a method for the detection of E.coli O157:H7 in foods[J]. Food Control, 2000, 11(2): 85-95.

[19] 巢强国, 杨学明, 葛宇, 等. PCR法检测食品中大肠杆菌O157:H7[J]. 食品科学, 2010, 31(8): 212-215.

[20] 徐晓可, 吴清平, 周艳红, 等. 肉类中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立[J]. 微生物学通报, 2008, 35(4): 619-622.

[21] 胡慧, 陈雅君, 段志刚, 等. 大肠杆菌O157:H7 特异基因的实时荧光定量PCR检测[J]. 食品科学, 2011, 32(12): 278-282.

[22] 陈思, 黄昆仑, 许文涛, 等. 实时荧光定量PCR 方法检测大肠杆菌O157:H7[J]. 农业生物技术学报, 2006, 14(5): 779-782.

[23] 王力均, 许恒毅, 熊勇华, 等. 荧光定量PCR在大肠杆菌O157:H7检测中的应用研究进展[J]. 食品科学, 2013, 34(11): 358-362.

[24] 徐义刚, 崔丽春, 李苏龙, 等. 肠出血性大肠埃希菌O157: H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用[J]. 中国人兽共患病学报, 2010, 26(7): 618-623.

[25] CHUN J Y, KIM K J, HWANG I T, et al. Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene[J]. Nucleic Acids Research, 2007, 35(6): e40.

[26] 刘梅, 黄新, 马占鸿, 等. 应用DPO引物检测马铃薯病毒的多重RT-PCR技术研究[J]. 植物病理学报, 2009, 39(4): 431-434.

[27] 徐焕洲, 平芮巾, 季汝武, 等. 应用DPO 引物技术同时检测5 种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2012, 35(2): 73-75.

[28] WOO H Y, PARK H, KIM B I, et al. Evaluation of dual priming oligonucleotide (DPO)-based multiplex PCR for detection of HBV YMDD mutants[J]. Archives of Virology, 2008, 153(11): 2019-2025.