液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法筛查食品中
6 种人工合成甜味剂

王建华1，杨 君2，刘 琳1，颜冬云2，李 立3，刘靖靖1

（1.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东 青岛 266002；2.青岛大学化学科学与工程学院
（环境科学与工程学院），山东 青岛 266071；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

摘 要：应用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱建立固体样品中甜味剂的筛查。样品经前处理后采用Eclispe XDB-C18色谱柱，以0.1%甲酸-10mmol/L甲酸铵溶液-甲醇为流动相，梯度洗脱，电喷雾负离子模式分析检测。在全扫描采集模式下，以准分子离子峰的峰面积定量，以化合物精确分子质量定性。各化合物在0.02～2.0 mg/L范围内均呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.998。样品平均添加回收率为74.5%～120.1%，相对标准偏差均小于10.4%。本方法可满足现行法规的限量要求。

关键词：液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱；人工合成甜味剂；筛查；食品

Analysis of 6 Synthetic Sweeteners in Foods by Liquid Chromatography-Quadrupole-Time-of-Flight Mass Spectrometry

Wang Jian-hua1, Yang Jun2, liu Lin1, Yan Dong-yun2, LI Li3, liu Jing-jing1

(1. Technical Center of Inspection and Quarantine, Shandong Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China;

2. College of Chemical Engineering, Qingdao University, Qingdao 266071, China;

3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

Abstract: A new method was established for the determination of 6 synthetic sweeteners (sodium saccharin, cyclamate, acesulfame-K, aspartame, neotame, and sucralose) in food samples by using liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (LC-Q-TOF-MS). The extract was measured directly by LC-Q-TOF-MS with electrospray ionization in the negative mode. The compounds were separated by an Eclispe XDB-C18 column with acetonitril-10 mmol/L ammonium formate-0.1% formic acid as the mobile phase. A detailed fragmentation study for these 6 synthentic sweeteners was carried out by time-of-flight. The 6 compounds behaved linearly in the concentration range of 0.02–2.0 mg/L, with a correlation coefficient > 0.998. The recoveries were 74.5%–120.1%, with relative standard deviation below 10.4%. The method illustrated is suitable for routine qualitative and quantitative analyses of synthetic sweeteners in food samples.

Key words: liquid chromatography quadrupole-time of flight mass spectrometry; artificial sweeteners; screening; food

中图分类号：TS252.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0181-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408036

甜味剂是一类重要的食品添加剂，按其来源可以分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。人工合成甜味剂在人体内不进行代谢吸收、不提供热量或因用量低产生的热量少，但甜度高，不仅能够赋予食品良好的口感，而且还可以取代蔗糖作为糖尿病人和肥胖病人的替代品，因而在广泛应用于各类食品中[1]。到目前为止，世界各国已获批准的人工甜味剂有20 种，其中得到多数国家批准使用的品种主要有安赛蜜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精、三氯蔗糖等[2]。然而科学研究表明，人工合成甜味剂能致使某些动物产生肿瘤[3]，因此为避免其对人体产生潜在危险，限制食品饮料中甜味剂的用量是必要的。美国、欧盟、日本等国对食品中甜味剂的使用有严格规定[4]，中国卫生部2011年发布的GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》中也严格了规定甜味剂在不同食品基质中的限量[5]。杨君等[6]综述了近几年食品中甜味剂的检测方法，主要有高效液相色谱法[7-11]、液相色谱-质谱法[12-14]、液相色谱-串联质谱法[15-20]、气相色谱法[21,22]、气相色谱-质谱法[23]、毛细管电泳-电导法[24]、分子吸收分光光度法[25]等。

四极杆-飞行时间质谱（quadrupole-time-of-fight mass spectrometry，Q-TOF-MS）属于高分辨质谱，可根据化合物离子的精确分子质量对其进行准确定性分析，它获得的全扫描谱图可以用于建立化合物质谱数据库，因此在没有标准品的情况下也可对未知样品中的化合物进行准确定性。目前国内没有使用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（high performance liquid chromatography-Q-TOF-MS，HPLC-Q-TOF-MS）检测食品中甜味剂的报道，而国外已有报道使用该技术检测食品中3 种甜味剂[3]。因此本研究通过优化前处理条件、色谱和质谱条件，首次建立了HPLC-Q-TOF-MS同时检测固体食品中安赛蜜（acesulfame-K）、糖精钠（sodium saccharin）、甜蜜素（cyclamate）、三氯蔗糖（sucralose）、阿斯巴甜（aspartame）、纽甜（neotame）6 种常用人工合成甜味剂的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲酸、乙酸铵、甲酸铵（均为色谱纯） 美国Honeywell Burdick & Jackson Muskegon公司；实验室用水由Milli-Q纯水系统制备；糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖（纯度均为99.0%） 德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱仪、6520 Accurate Mass Q-TOF LC-MS、Eclispe XDB-C18色谱柱、Eclispe plus-C18 美国Agilent公司；3-18K台式冷冻离心机 美国Sigma公司；PL303电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-500DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取标准品各0.050 0 g于50 mL棕色容量瓶中，用纯水溶解并定容，配制成1 mg/mL的混合标准储备液，置于冰箱中4 ℃（可保存1 个月）。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Eclispe XDB-C18色谱柱（150 mm×
2.1 mm，5 μm）；流动相A甲醇；流动相B 0.1%甲酸-10mmol/L甲酸铵溶液；梯度洗脱程序：0～1.0 min，98% B；1.0～5.0 min，98%～20% B；5.0～7.0 min，20% B；7.1 ～20.0 min，98% B；流速：0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

1.3.3 质谱条件

电喷雾源离子源；负离子模式；干燥气温度350 ℃；干燥气流速12 L/min；雾化气压力348.3 kPa （50 psi）；毛细管电压4000 V；锥孔电压140 V；参比离子m/z 121.9856、1033.9881；质量扫描范围m/z 100～1 100。

1.3.4 样品处理

准确称取经均质的样品1.0 g至50 mL容量瓶中，加入20mL纯水，超声500 Hz提取10 min，用纯水定容至刻线，摇匀后将样品转入离心管中，以7 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 µm尼龙滤膜，滤液供测定。

1.3.5 基质效应计算

基质是样品中被分析物以外的组分，常对分析物的分析有显著干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应[26]。为研究甜味剂在不同基质中的基质效应，实验选取4 类基质，配制成不同质量浓度（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的基质标准溶液及溶剂标准溶液，分别建立标准曲线，比较2 条标准曲线斜率的差异，从而判断基质效应的强弱。

基质效应/%=（1－B/A）×100

式中：A为溶剂标准曲线的斜率；B为基质标准曲线的斜率。

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

固体样品的提取溶剂主要有纯水[7-8]、甲醇-水[9,12,17]、流动相[11,13]等，提取方法有超声提取[7,9,12-13,17]、微波提取[8]等。由于实验所研究的6 种甜味剂均可溶于水，因此采用纯水超声提取的方法。多数文献采用提取液直接过0.22μm微孔滤膜净化的方法，只有少数研究[7,10]采用固相萃取法（solid phase extraction，SPE）净化，而本实验采用SPE净化样品时效果不佳，故采用提取液直接过0.22 μm微孔滤膜的方法净化。

对固体样品进行分析一般需要均质，才能使待测物质更充分地被提取出。本实验比较了均质和不均质对含有甜蜜素和糖精钠的阳性样品提取效率的影响，按照1.3.4节所述方法进行提取，经均质的样品中甜蜜素含量为1023.7 mg/kg，糖精钠含量为165.5 mg/kg；未经均质的样品中甜蜜素含量为222.7 mg/kg，糖精钠含量为44.6 mg/kg。这说明甜味剂已浸入样品内，不均质的样品中甜味剂没有被完全提取出来，因此固体样品检测需要经过均质。

2.2 色谱和质谱条件的优化

由于固体样品成分复杂，因此本实验对色谱柱和流动相进行了详细的考察。分别考察了Eclispe XDB-C18和Eclispe plus-C18 2种色谱柱，结果发现在Eclispe XDB-C18色谱柱上6 种化合物的分离效果和峰形更好、灵敏度更高。

对流动相体系进行了优化，考察了0.1%甲酸-10mmol/L乙酸铵溶液-甲醇和0.1%甲酸-10mmol/L甲酸铵溶液-甲醇体系，发现0.1%甲酸-10mmol/L甲酸铵溶液-甲醇体系分离响应高、峰形好，故选作为流动相。对同一浓度标准溶液采用不同梯度洗脱程序进行分析，最终优化的梯度洗脱程序的分析灵敏度比其他洗脱程序高10.5%～23.4%，故采取1.3.2节的梯度洗脱程序进行试样分析。

图 1 正、负模式下化合物响应值的比较

Fig.1 Comparison of the responses of target compounds in positive and negative modes

分别采用正、负离子模式进行全扫描，由图1可见，三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜在正、负模式下均有响应，且正模式的响应要比负模式强；而安赛蜜、糖精钠、甜蜜素3 种化合物在正模式下没有响应，因而采用负离子模式进行检测。

在Q-Tof-MS检测中，锥孔电压是一项关键参数，通过优化使目标化合物有较高的灵敏度和较少的碎片离子。本实验优化了90～200 V的锥孔电压，以阿斯巴甜为例，其裂解途径和质谱图见图2，分子离子峰[M—H]－（m/z 293.1138）在高、中、低3 个电压条件下（90、140、200 V）均会产生碎片[M—H—O—CH4]－（m/z 261.087 5）和[M—H—C6H5—CH3]－
（m/z 200.0433）。当电压为90V时产生的分子离子峰和碎片离子的响应值较低，200 V时产生的杂峰较多，不利于定性分析，实验发现响应值随着锥孔电压的增加，各甜味剂的响应值逐渐升高，到达某一电压时最高；再升高电压时，响应值降低或不变，经综合考虑选择140 V作为最佳锥孔电压。

图 2 阿斯巴甜在90（A）、140（B）、200（C）V
锥孔电压下的质谱图及裂解途径图（D）

Fig.2 TOF-MS spectra and fragmentation elucidation of aspartame

本实验还对干燥气流速、雾化气压力、干燥气温度进行了单因素优化。在0.3 mL/min流速下，研究了不同的干燥气流速对响应值的影响，结果见图3。实验表明，对于所研究的6种甜味剂，氮气流速过低时响应值较差，大部分甜味剂在氮气流速为10～13 L/min时质谱响应值达到最高，故经过综合考虑实验将干燥气流速设置为12 L/min。

图 3 干燥气流速对雾化效果的影响

Fig.3 Effect of drying air flow rate on the nebulization

在干燥气流速为12 L/min时，研究了不同雾化气压力对雾化效果的影响，结果见图4。实验表明，喷雾压力对质谱响应值有一定影响，大部分甜味剂在喷雾压力为50～60 psi时质谱响应值较高，故经综合考虑将雾化气压力设为50 psi。

图 4 雾化气压力对雾化效果的影响

Fig.4 Effect of nebulizer gas pressure on the nebulization

图 5 干燥气温度对雾化效果的影响

Fig.5 Effect of drying air temperature on the nebulization

由图5可知，质谱信号随着干燥气温度的上升而增强，到达一定温度后不再上升，这是因为本实验的研究对象为水溶性化合物，色谱分离时使用的水相比例较高，因此需要较高的干燥气温度进行雾化，结合仪器的实际情况及响应值，将干燥气温度设置为350 ℃。

在优化好的色谱和质谱条件下对6 种甜味剂进行分析，分子离子峰精确分子质量的理论值和测量值以及偏差见表1，分子特征离子提取色谱图及质谱图见图6。

表 1 各化合物理论分子质量、实测分子质量和匹配结果

Table 1 Calculated mass and experimental mass measurements of molecular ions of the target compounds

A.安赛蜜；B.糖精钠；C.甜蜜素；D.三氯蔗糖；E.阿斯巴甜；F.纽甜。

图 6 6种甜味剂的提取离子色谱图及其质谱图

Fig.6 Extracted ion chromatograms and mass spectra of 6 sweeteners

2.3 目标化合物的定性分析

结合甜味剂自身分子结构和电喷雾负离子模式去H的机理，根据分子离子峰精确分子质量的理论值与测量值的质量偏差小于5ppm以及特征碎片离子，可对该化合物进行准确定性。

通过二级质谱图可进一步获得母离子的特征碎片离子的精确分子质量。在负离子模式下，进行一级质谱图扫描，得到母离子的精确分子质量，再对母离子进行二级质谱图扫描，得到母离子碎片特征离子的精确分子质量。由图2可知，阿斯巴甜一级图谱母离子的精确分子质量为293.1138，二级图谱的2个特征离子的精确分子质量为261.0875和200.0433。母离子293.1138到子离子261.0875丢失的碎片离子的分子质量为32.0263，刚好为—OCH4的分子质量，由此可知在电喷雾电离源作用下，阿斯巴甜在烷氧基键处易断裂。安赛蜜的母离子（分子质量为161.9861）失去—OSO2得到分子质量为82.0303的碎片离子，再进一步失去2个H得到分子质量为77.9655碎片离子；糖精钠的母离子（分子质量为181.9911）失去苯环得到分子质量为105.9600的碎片离子；甜蜜素母离子失去—C6H12得到分子质量为79.9575的碎片离子；三氯蔗糖由于带有—Cl，其母离子失去—Cl得到分子质量为359.0242的碎片离子，进一步失去—OCH，得到分子质量为330.9771的碎片离子；纽甜断裂—OCH4得到分子质量为345.1813的碎片离子。表2列出了各甜味剂二级质谱的理论、实测分子质量及碰撞能量。

表 2 各化合物二级质谱的理论分子质量、实测分子质量、
匹配结果及碰撞能量

Table 2 Calculated mass and experimental mass measurements of molecular ions of the target compounds in MS-MS mode

实验对6种甜味剂分别建立了精确分子质量数据库和谱图库。精确分子质量数据库包括化合物的名称、分子式、精确分子质量及保留时间。通过分子离子峰精确分子质量的理论值与测量值的质量和保留时间对样品中的甜味剂进行检测。谱图库包括化合物所有碎片离子信息，可通过实际测定样品的谱图与谱库中碎片离子信息的镜像比对对甜味剂进行定性确证。

分别采用标准溶液和基质标准溶液对本实验建立的精确分子质量数据库和谱图库进行验证，标准溶液和基质标准溶液与精确分子质量数据库和谱图库的匹配率的得分超过70分的甜味剂比例均超过97%。结果表明2个数据库的准确性良好，可以应用到实际样品的筛查过程中。

2.4 基质效应评价

表 3 6种甜味剂在果脯、饼干、肉类及糖类中的基质效应

Table 3 Matrix effects of 6 sweeteners in preserved fruit, biscuits,
meat and candy

%

注：负数表示抑制效应。

如表3所示，4种基质中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖均为基质增强效应，只有阿斯巴甜或纽甜会出现基质抑制效应。不同固体样品体现了不同的基质效应，并且甜味剂以基质增强效应为主。由于基质效应明显，本方法最终采用基质匹配外标校准曲线对样品中的甜味剂进行定量，以抵消基质效应的影响。

2.5 线性关系、回收率、精密度及定量限

表 4 6种人工甜味剂的线性方程、相关系数、添加回收率、
精密度及定量限

Table 4 Linear equations, correlation coefficients, recoveries, precisions and limits of quantification (LOQ) of 6 synthetic sweeteners

将阴性饼干样品按1.3.4节方法处理，配成0.02～2.0 mg/L质量浓度范围内的基质标准溶液。由表4可见，基质标准溶液的质量浓度x与峰面积y呈良好的线性关系，相关系数均大于0.998。

通过向阴性的饼干和调味黄瓜样品中添加0.5 mg/L的甜味剂混合标准溶液测定回收率和精密度，每个样品平行分析5次。由表4可见，回收率在74.5%～120.1%之间，相对标准偏差（RSD）为0.9%～10.4%。

2.6 实际样品的测定

根据已建立的数据库，对各类市售食品中的甜味剂进行谱图库确证，得到固体大麦茶、葡萄干、调味黄瓜、点心的碎片离子图，与数据库的谱图镜像对比不符，确定其中不含所测的甜味剂。采用基质匹配外标校准曲线对筛查出的甜味剂进行定量，西梅中糖精钠含量为151.9 mg/kg、甜蜜素为1 083.2 mg/kg；蟹肉棒中糖精钠含量为1.3 mg/kg、甜蜜素为2.7 mg/kg；白砂糖中糖精钠含量为111.6mg/kg、甜蜜素为325.3 mg/kg；红油金针菇中安赛蜜含量为143.8 mg/kg；绿茶梅中糖精钠含量3.8 mg/kg、
甜蜜素为82.4 mg/kg、三氯蔗糖为360.9 mg/kg、
阿斯巴甜为128.1 mg/kg、纽甜为33.8mg/kg；燕麦片中阿斯巴甜含量为534.7 mg/kg。以上结果均满足GB 2760—2011规定的各类食品中甜味剂的限量要求。

3 结 论

建立了食品中糖精钠、甜密素、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖6 种人工合成甜味剂的高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱快速分析方法，优化了固体样品前处理方法和质谱条件，建立了四极杆-飞行时间质谱的精确分子质量定性的谱库。本方法简便快捷，灵敏度可满足现行法规的限量要求，可为食品安全监管提供有效保障。

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