高效液相色谱-串联质谱法同时测定中草药
饮料中11 种有毒生物碱

马晓斐1，梁天佐1，宋 炜2，冯浩彬1，张 岩1,*

（1.河北省食品质量监督检验研究院，河北 石家庄 050091；2.河北省食品药品检验院，河北 石家庄 050011）

摘 要：建立同时测定中草药饮料中11 种有毒生物碱（乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、马钱子碱、士的宁、秋水仙碱、喜树碱、阿托品、东莨菪碱、毛果芸香碱和鬼臼毒素）的高效液相色谱-串联质谱分析方法。试样直接过0.22 μm滤膜，经Kinetex C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）分离后，在多反应监测模式下定性及定量分析。结果表明：11 种有毒生物碱在在其线性范围内与其峰面积线性关系良好（＞0.999 0），方法检出限为0.05～0.5 μg/L，
在低、中、高3个添加水平范围内的平均回收率为75.0%～88.4%，相对标准偏差均小于7.6%。该方法操作简便、灵敏度高、重复性好、定性定量准确，适用于中草药饮料中有毒生物碱的测定。

关键词：饮料；高效液相色谱；质谱；有毒生物碱

Simultaneous Determination of 11 Poisonous Alkaloids in Chinese Medicinal Herbal Beverages by
Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

MA Xiao-fei1, LIANG Tian-zuo1, SONG Wei2, FENG Hao-bin1, ZHANG Yan1,*

(1. Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050091, China;

2. Hebei Provincial Institute for Food and Drug Control, Shijiazhuang 050011, China)

Abstract: A method for the simultaneous determination of 11 poisonous alkaloids (aconitine, hypaconitine, mesaconitine, brucine, strychnine, colchicine, camptothecin, atropine, scopolamine, pilocarpine, and podophyllotoxin) in Chinese medicinal herbal beverages was developed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Samples were filtered through a 0.22 μm microporous membrane. Qualitative and quantitative analyses were carried out by mass spectrometry under the MRM mode after the chromatographic separation on a Kinetex C18 (2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) column. All the 11 poisonous alkaloids showed a good linearity with correlation coefficients (r) no less than 0.999 0 within their linear ranges. The limits of detection for these poisonous alkaloids were in the range of 0.05 to 0.5 μg/kg. The mean recoveries at three spiked levels were 75.0%–88.4%
and the relative standard deviations were less than 7.6%. This method is simple, sensitive, accurate and suitable for the simultaneous analysis of poisonous alkaloids in Chinese medicinal herbal beverages.

Key words: beverage; liquid chromatography; mass spectrometry; poisonous alkaloids

中图分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0226-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408045

含有毒生物碱的植物分布极其广泛，在各科各属中均有分布，它们能引起摄食者轻微的肝损伤，会出现发冷、出虚汗、乏力、面黄肌瘦、犯困等症状，严重时可能对神经系统、消化系统造成损害，甚至出现内分泌失调等症状[1]。目前，因生物碱中毒死亡案例时有发生，严重危害消费者的身心健康[2]。

目前，越来越多的饮料中开始添加中草药成分，提高饮品保健功效，逐渐成为消费者选择产品的重要关注点。但是这些中草药中除了有益于人体的天然成分外，可能还会引入对人体有害的生物碱类物质，长期使用会给消费者的身体健康带来极大伤害。

生物碱的检测方法主要有高效液相色谱（high perforamance liquid chromatography，HPLC）法[3-6]、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[7-8]和液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法[9-25]。HPLC检出限高，很多情况下不能满足生物碱鉴定的需要，且仅以保留时间进行定性分析存在风险，当目标物浓度较低时基质干扰严重、选择性差，易出现假阳性。GC-MS分析有毒生物碱则需要衍生化后才能进行分析，操作过程复杂。HPLC-MS-MS法同时具备液相色谱高效的在线分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度的检测能力，可以同时得到化合物的保留时间、分子质量以及特征结构碎片等丰富的信息，其多反应监测技术兼具有选择离子扫描的灵敏度和二级质谱的特征性，在痕量分析方面具有很大的优势。

目前生物碱的检测主要针对血液等生物检材中，对食品中有毒生物碱的研究较少，而且检测项目单一、检测方法灵敏度较低。目前未见对中草药饮料中有毒生物碱的测定方法，本实验建立了同时测定饮料中11 种有毒生物碱的HPLC-MS-MS检测方法，方法操作简单，结果稳定可靠，可为监管部门提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Fisher Scientific公司；甲酸、乙酸铵（均为优级纯） 美国Sigma-Aldrich公司；乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、马钱子碱、士的宁、秋水仙碱、喜树碱、阿托品、东莨菪碱、毛果芸香碱、鬼臼毒素标准物质（纯度≥95%） 中国食品药品检定研究院；去离子水由Millipore公司超纯水器制得。

1.2 仪器与设备

Shimadzu-20A液相色谱仪 日本岛津公司；AB SCIEX Q TRAP 5500气相色谱-质谱仪（配有电喷雾离子源、Analyst 1.6软件） 美国AB SCIEX公司；CT15RT高速冷冻离心机 上海天美公司；SK-1涡旋混匀器 江苏中大仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

样品摇匀后取5mL于离心管中，10 000 r/min离心3 min，吸取1.0 mL经0.22 μm滤膜过滤，滤液供HPLC-MS-MS测定。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Kinetex C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流动相A为0.1%甲酸溶液（含10 mmol/L乙酸铵）；流动相B为乙腈；流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～2 min，10%B；2～6 min，10%～30%B；6～10 min，30%～40%B；10.1～15 min，10%B；柱温35 ℃；进样量2 μL。

1.3.3 质谱条件

电喷雾电离源；正离子模式；多反应监测模式；离子源温度500 ℃；雾化气压力0.7 MPa；气帘气压力0.4 MPa；辅助气压力0.4 MPa；电喷雾电压5500 V；11 种有毒生物碱的特征碎片离子对、去簇电压和碰撞能量见表1。

表 1 11种有毒生物碱检测质谱条件

Table 1 MS-MS conditions for the detection of 11 poisonous alkaloids

注：*.定量离子。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择及分离条件的优化

对比了2 种色谱柱（Kinetex C18和Agilent Eclipse Plus-C18）对11 种有毒生物碱的分离效果。结果表明，使用Kinetex C18柱时11 种生物碱峰形良好，但乌头碱和次乌头碱没有达到基线分离（图1A），而使用Eclipse Plus-C18柱时，除以上2种目标物没有分离外，阿托品和马钱子碱也重合到一起，而且乌头碱和次乌头碱的峰形展宽，分叉（图1B），最终实验选择Kinetex C18色谱柱。

1.乌头碱；2.新乌头碱；3.次乌头碱；4.鬼臼毒素；5.秋水仙碱；6.马钱子碱；7.喜树碱；8.士的宁；9.东莨菪碱；10.阿托品；11.毛果芸香碱。下同。

图 1 Kinetex C18（A）和Agilent Eclipse Plus-C18（B）
色谱柱的总离子流图

Fig.1 Total ion chromatograms on Kinetex C18 (A) and
Agilent Eclipse Plus-C18 (B)

本研究分别考察了甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸和0.1%甲酸（含10 mmol/L乙酸铵）-乙腈，0.1%甲酸（含10 mmol/L乙酸铵）-甲醇混合溶剂体系作为流动相对有毒生物碱的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，当流动相为乙腈-0.1%甲酸时，仪器信号响应高，且柱压明显低于甲醇-0.1%甲酸，但是目标物的峰形宽，分叉。实验将0.1%甲酸溶液中加入10 mmol/L乙酸铵后，峰形得到明显改善，最终确定选用0.1%甲酸（含10 mmol/L乙酸铵）-乙腈作为流动相。

2.2 质谱条件的优化

11 种有毒生物碱的化学结构中，除鬼臼毒素外，都含有杂环原子，所以在正离子模式下易得到一个H+形成准分子离子峰[M+H]+，所以实验选用正离子模式。分别将11种有毒生物碱储备标准溶液用流动相配制为10ng/mL
的标准溶液，用流动注射泵连续进样方式进行质谱条件的优化。首先采用全扫方式，各标准物质均可得到较高丰度的[M+H]+准分子离子峰。在确定母离子的基础上选择2个以上的子离子。采用子离子扫描方式对子离子及碰撞能进行优化选择，通过改变碰撞能值，使得母离子的强度占最大子离子强度的1/3左右时，同时优化去簇电压值，选择能产生最高丰度子离子的碰撞能作为最佳碰撞能量，最终选定母离子与丰度较高，干扰较小的1对特征子离子进行定性分析，选择其中响应值高的作为定量离子。11种有毒生物碱的标准物质总离子流图见图2。

图 2 11种有毒生物碱标准溶液的总离子流图

Fig.2 Positive ion electronspray ionization mass spectra of
11 poisonous alkaloids

2.3 线性范围和方法检出限

为消除样品基质效应，实验采用空白基质匹配标准溶液法制备标准曲线。取阴性样品按照样品前处理方法操作，制备空白基质溶液，将标准工作液用空白基质溶液逐级稀释得到质量浓度为0.5、1、2、5、10、50、100μg/L的系列标准溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定。本实验采用空白样品加标法以不小于3倍信噪比确定检出限，结果见表2。

表 2 11种有毒生物碱的线性方程、相关系数和检出限

Table 2 Linear equations, correlation coefficients and limits of detection (LOD) for 11 poisonous alkaloids

2.4 方法的回收率和精密度

采用空白样品加标的方法进行添加回收率和精密度实验，在空白样品中添加低、中、高3 个水平的标样后，然后按1.3.1节方法进行操作，每个添加量平行测定6 次。同时配制标准系列溶液，计算回收率和相对标准偏差，结果见表3。结果表明，在高、中、低3 个添加水平的平均回收率在75.0%～88.4%之间，相对标准偏差为4.2%～7.6%。表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。

表 3 11种有毒生物碱的加标回收率和精密度（n=6）

Table 3 Recoveries and precision (RSD) for 6 replicate determinations of 11 poisonous alkaloids (n=6)

2.5 实际样品测定

按照本研究所建立的方法对市场上常见的10 种中草药饮料饮料进行了测定，均未检出有毒生物碱类药物。

3 结 论

本方法中，样品经过滤后，采用HPLC-MS-MS可同时检测中草药饮料中11 种有毒生物碱类药物（乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、马钱子碱、士的宁、秋水仙碱、喜树碱、阿托品、东莨菪碱、毛果芸香碱和鬼臼毒素）含量的方法。本方法的回收率、检出限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法具有操作简便、检出限低、准确度高、污染小的特点，在中草药饮料中有毒生物碱类药物含量的检测与确证方面有着较高的实用价值和应用前景。

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