高分子微球免疫吸附剂的制备及其对
黄曲霉毒素M1的吸附性能

张小舟1，甄玉萍2，高建伟2，王 岩2，裴世春2,*

（1.齐齐哈尔大学材料科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；

2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

摘 要：制备用于牛乳中吸附黄曲霉毒M1的免疫吸附剂。以乙醇和水溶液为反应介质，聚乙烯吡咯烷酮为分散剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用分散聚合法制备苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物微球。利用微球表面的环氧基团将抗黄曲霉毒M1的单克隆抗体固定在微球表面，获得免疫吸附剂。制备的微球粒径约为1.7μm，微球中环氧基量在67.2%～71.6%之间，制备的免疫吸附剂对乳中黄曲霉毒素M1的吸附量达1.2µg/g以上。该免疫吸附剂对乳中黄曲霉毒素M1的选择性吸附较好，是去除乳中黄曲霉毒素M1较理想的免疫吸附材料。

关键词：共聚物微球；黄曲霉毒素M1；免疫吸附剂；吸附

Preparation of Solid Polymer Microsphere Immune Adsorbent and Its Adsorption Performance for Aflatoxin M1

ZHANG Xiao-zhou 1, ZHEN Yu-ping2, GAO Jian-wei2, WANG Yan2, PEI Shi-chun 2,*

(1. College of Materials Science and Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China;

2. College of Food and Biological Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)

Abstract: In this paper, immune adsorbents were prepared for the adsorption of aflatoxin M1 in milk. Copolymer microspheres of glyceryl methacrylate (GMA) and methyl methacrylate (MMA) were prepared using dispersion polymerization with azodiisobutyronitrile (AIBN) as initiator in aqueous ethanol medium in the presence of polyvinylpyrrolidone (PVP) as dispersant under various conditions. Anti-AFM1 monoclonal antibody was coupled with the epoxy groups on the microsphere surface to form an immune adsorbent. The microsphere particle size was approximately 1.7 μm, and the quantity of epoxy group in the microspheres was between 67.2% and 71.6%. The adsorption quantity of monoclonal antibodies for aflatoxin M1 in milk was more than 1.2 μg/g. These results show that the selective adsorption for aflatoxin M1 in milk of the immune adsorbent is good. It can be an ideal immune adsorption material for the removal of aflatoxin M1 in milk.

Key words: copolymer microspheres; aflatoxin M1; immune adsorbent; adsorption

中图分类号：TS252 文献标志码：B 文章编号：1002-6630（2014）08-0304-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201408061

黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）因其主要存在于乳中，因此最初也叫“牛奶毒素”，是由de Iongh等[1]发现后发表在1964年的Nature杂志上，随着研究的深入发现AFM1是黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）在体内经细胞色素P450系列酶的作用下经羟基化所形成，一般认为AFB1的羟基代谢物是毒素的解毒形式，然而AFM1不能被看作是AFB1的解毒产物，有许多实验研究表明AFM1具有细胞毒性和致癌性，是目前影响乳制品安全性的重要有害物之一[2]。

AFM1耐高温、稳定性强，在乳制品的加工过程中通常无法通过高温杀菌工艺直接去除，因此，目前还没有通过直接技术手段去除乳中AFM1的污染的方法，控制乳中AFM1的措施只有采用严格的法定残留限量标准和精密检测技术来进行，一旦超标就需要将污染AFM1的乳液进行销毁，常造成巨大的经济损失。

由于黄曲霉在自然界普遍存在，并且对生长条件要求不高，谷物、油料作物及饲料是霉菌最易滋生之处，常造成AFB1污染，进而通过食物链进行转移，因此间接控制乳中AFM1的方法主要是通过对饲料的严格管理降低哺乳动物摄入AFB1来进行，但是即便是加强管理的同时采用了预防等补助措施也难以完全杜绝饲料、环境中的AFB1的污染，常有AFB1污染事件的发生及相关报告[3]，AFB1可通过通过饲料和水摄入转移至哺乳动物体内，摄入的AFB1可在哺乳动物体内转化为AFM1并通过乳汁排出，进而造成乳品中AFM1的污染[4]，由于鲜乳在食用前及加工过程中不便于直接采用化学试剂、生物降解剂和辐射等方法去除乳中AFM1的污染，因此，利用高特异性单克隆抗体和特殊载体材料制备高效专一的体外免疫吸附剂，通过免疫吸附去除乳中AFM1的残留是一个可以考虑的方法之一。

而作为生物固定化的载体，聚合物微球具有良好的机械强度，较大的比表面积、良好的单分散性以及稳定性，且微球表面可以设计羟基[5]、羧基[6]、醛基[7]、环氧基[8]等多种功能基，可以用来与生物分子反应从而实现化学键合[9]。因此可以利用聚合物微球作吸附剂的载体，将免疫活性抗体通过适当的方法偶联到载体上获得固相免疫吸附剂，用于清除与免疫有关的致病因子以及各种毒素[10-13]。制备聚合物微球的材料有球形纤维素[14]、聚乙烯醇[15]、聚酰胺衍生物[16]以及硅胶\壳聚糖[17]等，这些材料都是利用活泼的反应基团与生物分子偶联制备免疫吸附剂。

甲基丙烯酸缩水甘油酯（glycidyl methacrylate，GMA）分子中含有活泼的环氧基团，可与其他单体共聚制备聚合物微球材料。而聚合物微球上带有的环氧基团由于其与生物分子上的伯氨基具有反应活性高、条件温和、反应速度快，是一种很好的固定生物分子的功能基[18]。本实验利用分散聚合法制备了表面含有环氧基团的单分散苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物(poly(styrene-glycidyl methacrylate)，P（St-GMA））微球，用其作为载体，将抗AFM1单克隆抗体偶联到聚合物微球上获得固相免疫吸附剂，并对其吸附乳中AFM1的性能进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、乙醇、偶氮二异丁腈、1,4-二氧六环（均为分析纯） 天津凯通化学试剂有限公司；甲基丙烯酸缩水甘油酯 上海晶纯试剂有限公司；黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物（aflatoxin M1-bovine serum albumin conjugate，AFM1-BSA）、黄曲霉毒素M1 美国Sigma公司；抗AFM1单克隆抗体为本实验室自主开发。

1.2 仪器与设备

TENSOR 27傅里叶红外光谱仪 德国Brucker光谱仪器公司；VICTOR X4多功能酶标仪、Wahser400 96孔洗板机、NanoVue 100 微量紫外分光光度计 美国GE公司；超滤杯 美国密理博公司；S-4300扫描电镜 日本日立公司；TDL-5型低速大容量离心机 常州中捷实验仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 P（St-GMA）微球的制备

将一定质量的聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）加入一定质量比的乙醇和水中，构成分散体系。而后将分散体系加入有导气管、冷凝管、温度计的三颈瓶中，同时通入氮气，在磁力加热搅拌器中预分散30 min。而后先将溶有偶氮二异丁腈的苯乙烯（styrene，St）加入，30～40 min后再将一定质量比的甲基丙烯酸缩水甘油酯滴入反应体系，St∶GMA比值范围为0.6～1.5（质量比）。在70 ℃，一定转速下反应12 h，得到亮白色乳状液。将此反应体系于3 000～3 500 r/min离心10 min，得到白色沉淀。用乙醇和水分别洗涤沉淀物3 次以上，将此沉淀物于30～40 ℃条件下真空干燥，即得共聚微球产物。

1.3.2 P（St-GMA）微球中环氧基含量的测定

采用盐酸-二氧六环法测定定环氧基团的剩余浓度。该方法利用了盐酸和环氧基之间的反应，反应消耗酸的同时产生氯乙醇。将一定质量的聚合物微球溶解于1,4-二氧六环中，再加入过量的0.1 mol/L浓度的盐酸，在30 ℃条件下搅拌反应3 h。未反应的盐酸浓度用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液进行滴定，以酚酞为指示剂。对每种样品至少进行5 次重复测定。

1.3.3 载体与抗体的偶联

向装有一定量P（St-GMA）微球的锥形瓶中分批加入用PBS配成1 µg/mL的抗AFM1单克隆抗体溶液，置锥形瓶于4 ℃摇床中振荡反应，反应过程中通过酶联免疫法测定反应液中残留的抗AFM1单克隆抗体的质量分数，当抗体质量分数无变化时推断为微球充分与抗体完成偶联反应。

1.3.4 静态吸附

取已制备的免疫吸附剂和P（St-GMA）微球各6份，每份0.3 g， 分放于2 mL管中。加入预先制备好的0.5µg/L的AFM1牛奶溶液1.5 mL，室温摇床以
140 r/min 反应2 h。同时用不加任何吸附剂的6 支管加入1.5 mL 预先添加0.5 µg/L的AFM1牛乳溶液振荡作为对照。考虑到GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》中规定乳及乳制品中AFM1的残留限量为0.5 µg/kg，因此，静态吸附实验牛乳以国标残留限量值为参考值进行。

1.3.5 动态吸附

将人为添加AFM1的牛乳、装有免疫吸附剂的吸附柱、蠕动泵用硅胶导管按顺序连接好，开启蠕动泵进行循环。牛乳添加AFM1后使其质量浓度为1、5、20 µg/L，吸附剂每份0.3 g，每份牛乳体积总量为30 mL，流动速率为2 mL/ min，使其完成一次吸附循环为15 min，并于0、15、30 min 时分别采集200 µL样品进行测定。

1.3.6 酶联免疫吸附测定AFM1

酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）参照张园园等[19]进行，取AFM1-BSA用PBS稀释后包被液包被酶标板，以5%脱脂奶粉溶液封闭，每孔加50 µL抗AFM1单克隆抗体，再加入待测乳品50 µL， 温浴后以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体及OPD显色，加入终止液后测定OD值并计算吸附率。按下式计算吸附剂对AFM1的吸附率。

式中：A1为吸附前乳液测定的质量分数；A2为吸附后乳液测定的质量分数。

2 结果与分析

2.1 共聚微球的红外光谱表征

图 1 P（St-GMA）微球红外光谱图

Fig.1 FTIR analysis of P(St-GMA) composite particles

图 2 甲基丙烯酸缩水甘油酯红外光谱图

Fig.2 FTIR analysis of GMA

图 3 苯乙烯红外光谱图

Fig.3 FTIR analysis of St

由图1可以明显看出，共聚物含有甲基丙烯酸缩水甘油酯单体单元特征吸收峰：1 728 cm－1吸收峰为酯羰基特征峰，2 932 cm－1处吸收峰为侧甲基的特征峰。同时，图1中909 cm－1处和847 cm－1明显的环氧吸收峰，证明了共聚微球中环氧基团的存在。与图2对比，图1中1 638 cm－1处吸收峰消失。1 638 cm－1处吸收峰本为甲基丙烯酸缩水甘油酯中C＝C吸收峰，由此可知，说明甲基丙烯酸缩水甘油酯是以C＝C键参加反应的。与图3对比，图1中3 000～3 100 cm－1处吸收峰保留，此为C—H
键的伸缩振动；1 601 cm－1处有明显吸收，此为苯环骨架振动吸收峰；这表明在反应中苯环并未受影响。同时1 620～1 680 cm－1处图1中无明显吸收峰存在，说明在共聚微球中无C＝C键存在，苯乙烯也是以C＝C键参加反应。

2.2 共聚微球的微观形貌

用微量取样器取无水乙醇稀释样品，振荡形成悬浮，然后超声约20 min。取一滴滴于取样盘的导电纸片上，放置于培养皿中室温干燥，用离子溅射法对样品表面喷金后，采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）直接扫描（SEM测试的加速电压为20.0 kV），观察微球表观的形貌。

a

b

5μm

3μm

图 4 P（St-GMA）微球SEM图

Fig.4 SEM images of P(St-GMA) composite particles

通过共聚物微球微观形貌（图4）可以得出，通过调控实验条件，采用分散聚合法可成功制得粒径可控、粒径分布均匀的P（St-GMA）微球，微球的粒径约为1.7μm、球形规则、单分散性好。从实验结果可知，当分散剂PVP用量1.5%（反应体系）、单体配比（质量比，St∶GMA）1∶1、分散介质乙醇和水比（质量比）为95∶5、单体占反应体系质量比为15%、引发剂用量1.0%（单体）、搅拌速率300 r/min、反应温度70 ℃、共聚单体先后加入反应12 h时，可获得良好的聚合物微球。

2.3 共聚物微球表面环氧基团的含量

表1列出了依据不同配方用分散共聚法制得的P（St-GMA）微球中环氧基的含量。环氧基含量的数据是以初始配方中的环氧基的物质的量百分比来表示的。实验数据表明，大部分的环氧基在共聚微球中得以保留。在本实验中采用了同时加入单体和先加入苯乙烯单体，反应30～40 min后再加入甲基丙烯酸缩水甘油酯的两种单体加入方式。单体先后加入，苯乙烯先形成齐聚物，形成稳定的成核中心，再加入甲基丙烯酸缩水甘油酯均匀包裹在苯乙烯核心之外，形成规则圆滑的共聚物微球，这样使得甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基团能够保留在微球表面。从表1可以看出，随着混合单体中甲基丙烯酸缩水甘油酯比例的增加，微球中的环氧基含量稍有改变，但是变化不大，这说明采用不同比例的单体加方式，其含量对微球表面的环氧基含量影响不大。而采用同时加入单体的方式，其环氧含量稍有下降但不明显。这是因为，甲基丙烯酸缩水甘油酯是亲水性单体，而苯乙烯是亲油性单体，在反应中由于采用的是乙醇与水的混合体系，因此亲水性单体聚合后会键合在微球表面，因此微球表面的环氧基团变化不大。

表 1 P（St-GMA）微球中保留的环氧基含量

Table 1 Epoxy group contents of P(St-GMA) composite particles

注：表中比值均为质量比；环氧基含量基于GMA初始环氧基含量的百分比，盐酸二氧六环法测定。

2.4 静态免疫吸附性能

P（St-GMA）微球偶联抗体的吸附剂的吸附率达到86.7%，对牛乳中AFM1的吸附率数据进行两组间t检验发现，以抗AFM1为配基的免疫吸附剂的吸附率显著高于仅有载体P（St-GMA）微球的吸附率（P＜0.01）（表2），本实验表明，P（St-GMA）微球对乳中的吸附AFM1作用有限，吸附乳中AFM1的功能主要在于固定在微球中的抗AFM1单克隆抗体。

表 2 免疫吸附剂对牛乳中AFM1的吸附

Table 2 Adsorption of immunoadsorbents for AFM1 ine milk

免疫吸附技术已在医学领域中用于特异性地吸附自身免疫病中的抗原、抗体或其他物质等致病成分用于免疫治疗的目的。王玉祥等[20]利用免疫吸附剂对致病性乙酰胆碱受体抗体的静态吸附实验表明，吸附率可达40.33%。金权鑫等[21]也进行了类似的实验，他们将人工合成的人乙酰胆碱受体为配基，固定于环氧氯丙烷活化后的球型纤维素上，制备出免疫吸附剂，其吸附率为26.59%，这些研究都为用于免疫治疗提供了实验参考依据。目前在食品加工领域利用免疫吸附技术吸附去除有害物质的参考性文献还很缺乏，但是本实验利用免疫吸附剂对AFM1的吸附实验表明，对超标乳品中的AFM1吸附率可达86.7%，可有效去除乳中AFM1，因此，本实验结果为液体食品中免疫吸附去除各种有害物质研究及其相关产品的开发提供了基础性实验数据。

2.5 动态免疫吸附效能

以静态吸附实验为基础，对吸附剂进行动态免疫吸附效能的实验结果表明，所制备的特异性免疫吸附剂对乳中AFM1的吸附率在1 次性循环中即可吸附80%以上的AFM1，吸附效率高，基本在15 min内可完成吸附反应，之后吸附率未见明显变化，保持较为稳定的状态。

动态吸附实验中，用于免疫吸附实验的吸附剂质量为0.3 g，牛乳体积为30 mL，牛乳溶液添加有5、10、20 µg/L的AFM1，经过循环动态吸附，吸附性能如图5所示，添加5、10 µg/L和20 µg/L的牛乳中AFM1的吸附率分别是86%、92%和61%，通过计算表明，当牛乳中质量浓度超过20 µg/L的AFM1时实验用的吸附剂（0.3 g）吸附量已经处于饱和状态，无法继续吸附，而对AFM1为10 µg/L
的牛乳中的吸附率为92%，因此，可以初步判断制备的免疫吸附剂吸附AFM1的能力在1.2 µg/g以上，具有较高的吸附性能，有望应用于乳品中吸附去除AFM1技术提供一种新材料。

图 5 免疫吸附剂对牛乳中AFM1的吸附效能

Fig.5 Absorption efficiency of the immunoadsorbent for AFM1 in milk

3 结 论

利用分散聚合的方法合成了单分散的P（St-GMA）微球，这种微球可以通过表面的环氧基团与抗AFM1单克隆抗体反应，将抗体固定在微球表面，获得特异性免疫吸附剂。免疫吸附剂在牛乳中对AFM1的吸附效果良好，利用单克隆抗体的免疫吸附技术在食品安全领域具有潜在的应用前景。

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