人工养殖大鲵皮胶原蛋白的性质研究

顾赛麒，李 莉，王锡昌*，梁炜泷

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

摘 要：在低温4 ℃条件下，采用酸法（0.5 mol/L乙酸）和酶法（胃蛋白酶）对人工养殖大鲵皮中的胶原蛋白进行了提取，对提取纯化后的两种不同类型的胶原蛋白——酸溶性胶原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）和胃蛋白酶酶促溶性胶原蛋白（pepsin-soluble collagen，PSC）其各项理化性质进行了研究。结果表明：ASC和PSC均包含2条α链及它们的二聚体β链，为Ⅰ型胶原蛋白；ASC和PSC中甘氨酸含量最高，其次为谷氨酸和脯氨酸，胱氨酸含量最低；ASC和PSC中亚氨基酸含量分别为144和173（以残基/1 000残基计），两者热变性温度分别为23.5 ℃和26.5 ℃，表明PSC的热稳定性较优；ASC和PSC的紫外最大吸收峰分别位于233.0 nm和232.0 nm波长处，符合胶原蛋白的特征；ASC和PSC的红外特征吸收频率相似，均含有酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带及在两酰胺带间的一系列吸收峰，表明ASC和PSC中胶原蛋白的三螺旋结构较为完整。

关键词：大鲵；鲵皮；胶原蛋白；提取；理化性质

Properties of Collagen Extracted from the Skin of Farmed Chinese Giant Salamander (Andrias davidianus Blanchard)

GU Sai-qi, LI Li, WANG Xi-chang*, LIANG Wei-long

(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract: Acid-soluble collagen (ASC) and pepsin-soluble collagen (PSC) from the skin of farmed Chinese giant salamander (Andrias davidianus Blanchard) were extracted with 0.5 mol/L acetic acid solution and pepsin at 4 ℃, respectively, and purified for further property analysis. Results showed that both ASC and PSC contained two α chains and one β chain (dimer of α chains), indicating them both to be typeⅠ collagen. Among all amino acids in ASC and PSC, glycine had the largest amount, followed by glutamic and proline, while cystine was the least abundant. The contents of amino acids in ASC and PSC were 144 and 173 residues/1 000 residues, respectively, and their denaturation temperatures were 23.5 and 26.5 ℃, respectively. These observations manifested that PSC possessed a better thermal stability than ASC. In addition, the largest UV absorption of ASC and PSC was observed at 233.0 and 232.0 nm, respectively, which agreed with the characteristic UV absorption of collagen. Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of ASC and PSC were almost identical. Both collagens had amide Ⅱ and amide Ⅲ, and a series of absorption peaks between them, indicating the existence of integrated triple helix structure in ASC and PSC.

Key words: Chinese giant salamander; skin; collagen; extraction; physico-chemical properties

中图分类号：S98 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0074-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409016

中国大鲵（Andrias davidianus Blanchard），俗称娃姓鱼，属两栖纲、有尾目、隐腮鲵科[1]，是现存两栖类动物中体形最长、寿命最长的动物，有“活化石”之美誉[2-4]。据调查，野生大鲵在我国分布广泛，但从1950年起，由于生态环境的破坏、人为滥捕滥杀、大鲵迁移范围有限等原因，其数量已急剧下降[5]。目前，野生大鲵已被列为国家二级保护动物并被收录于《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅰ中。为了保护大鲵资源，我国1960年起就开展了大鲵的人工养殖实验，现已取得较大进展。至2010年，全国大鲵养殖总量达170多万尾，大鲵总资源量的快速增长为后续的开发以及利用提供了有力保障[6]。

大鲵是一种药用保健价值极高的动物，其肌肉、骨骼、内脏、表皮及其分泌物皆可入药（目前大鲵体内已发现50多种天然活性物[7]）。目前国内外对人工养殖大鲵的研究主要集中于肌肉和鲵皮两方面。对于前者，主要评价其营养品质[1]，探讨大鲵肉在增强免疫力及抗疲劳等方面的保健功效[8]；对于后者，除一般营养成分分析外[9]，也有部分有关大鲵皮所分泌黏液中活性糖肽抗氧化活性的研究[10]。与肌肉相比，目前对大鲵皮的利用主要以烹饪菜肴为主，缺乏对其进行进一步精深加工的报道。大鲵皮胶原蛋白含量十分丰富，其胶原蛋白可能具有一些陆生动物胶原蛋白没有的特殊功能活性，故对大鲵皮中所含胶原蛋白的理化性质进行研究具有重要意义。本研究通过对人工养殖大鲵皮中的胶原蛋白进行提取纯化，并对所提取胶原蛋白进行理化性质进行分析，旨在为人工养殖大鲵资源的后续开发利用提供参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6尾人工养殖大鲵采自陕西省汉中市留坝县养殖场，体长为（80.00±8.66）cm，体质量为（3.57±0.09）kg。
去除大鲵肌肉和骨骼后，用流水彻底洗净鲵皮，采集不同部位的鲵皮后，将其切割成0.5 cm×0.5 cm的小片，混匀后放入聚乙烯袋中，于－80 ℃条件下贮藏。

胃蛋白酶（酶活力1 200 IU/g） 国药集团化学试剂有限公司；透析袋（截留分子质量为25 000D） 上海源叶生物科技有限公司；蛋白质（高）分子质量标准Marker（44.3～200 kD）、样品缓冲液 大连宝生物工程有限公司；十二烷基磺酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、过硫酸铵、四甲基乙二胺 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

THZ-82（A）气浴恒温振荡器 金坛市科析仪器有限公司；装配式活动冷库 上海迪安制冷有限公司；Avanti J-26XP冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；Mini-PROTEAN垂直电泳槽 美国Bio-Rad公司；PowerLook 2100XL-USB蛋白成像系统 上海世群国际贸易有限公司；L-8800氨基酸分析仪 日本日立公司；UV-3000 PC型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；Nicolet 6700傅里叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR） 美国Thermo Fisher Scientific公司；CH1015超级恒温槽 上海舜守恒平科学仪器有限公司；DV-Ⅱ＋可编程控制式黏度计 美国Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 大鲵皮基本成分的测定

水分：参照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》方法；粗蛋白：参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》；粗脂肪：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》和灰分：GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》。

1.3.2 大鲵皮中胶原蛋白的提取

1.3.2.1 原料预处理

参照文献[11]，将人工养殖大鲵皮4 ℃冰箱过夜半解冻后，手动去除鲵皮上残余肌肉，剪成0.5 cm×0.5 cm的小片。在4 ℃条件下，用0.1 mol/L NaOH溶液（液料比30 mL/g）浸泡l d，以除去非胶原蛋白；用去离子水洗涤至中性后，再用10%（V/V）正丁醇溶液（液料比为30 mL/g）浸泡l d，以除去脂肪；最后用去离子水洗涤至中性。

1.3.2.2 酸溶性胶原蛋白的提取

以0.5 mol/L乙酸作为提取溶液，液料比为15 mL/g，于4 ℃冷库中振荡提取29 h，粗提液经3 层纱布初步分离后，在4 ℃、20 000×g转速离心15 min，取上清液，向其中缓慢加入研磨细的NaCl粉末使NaCl最终浓度为0.7 mol/L；将此溶液置于4℃条件下盐析过夜后，进行第2 次离心（条件同上）；弃去上清液，将沉淀用0.5 mol/L
乙酸溶液溶解后，重复盐析、离心、酸溶操作各一次[12]。将酸溶后的胶原蛋白溶液移入透析袋，先用0.1 mol/L乙酸溶液透析1 d，再用去离子水透析2 d，透析时每天更换3 次透析外液，最后对得到的胶原蛋白溶液进行真空冷冻干燥。

1.3.2.3 酶促溶性胶原蛋白（pepsin-soluble collagen，PSC）的提取

以胃蛋白酶作为提取用酶，加酶量为198 IU/g，以0.5 mol/L乙酸作为提取溶液，液料比为15 mL/g，于4 ℃冷库中振荡酶解29 h，粗提液经3 层纱布初步分离后，进行冷冻离心，上清液的后续处理方法同酸溶性胶原蛋白，最后对得到的胶原蛋白溶液进行真空冷冻干燥。

1.3.2.4 大鲵皮中胶原蛋白提取率的计算

胶原蛋白的质量可由其所含的羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）质量乘以其换算系数得到。Hyp是胶原蛋白的特征性氨基酸，不存在于一般蛋白质中[13]。参照文献[14]将Hyp水解；参照国标GB/T 9695.23——2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量》测定酸解或酶解液中Hyp的质量后，将其乘以换算系数即可得到胶原蛋白的质量。

大鲵皮中胶原蛋白的提取率（X，%）按下式计算。

式中：ω为酸解或酶解液中Hyp质量/μg；11.1为Hyp换算系数。

1.3.3 ASC和PSC的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）

分别将ASC、PSC溶解于1 mL 5% SDS溶液中，溶解后的样品置于85 ℃水浴中保温1 h使其充分溶解，进行离心（4 000×g，5 min）除去不溶性的物质。参照Laemmli[15]的方法，电泳分离采用7.5%分离胶和4%浓缩胶体系[16]，电极缓冲液为SDS-Tris-甘氨酸系统，指示剂为溴酚蓝，分子质量标准Marker和样品上样量分别为5、10 µL。电泳时采用恒定电流模式，浓缩胶：20 mA、0.5 h，分离胶：40 mA、2.5 h，当溴酚蓝指示剂离下沿约1cm处时停止电泳。首先用去离子水冲洗凝胶3 次，将凝胶倒入固定液（乙酸、甲醇和去离子水之比为1∶5∶4的混合溶液）中浸泡30 min左右；用去离子水冲洗1次，移入盛有染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250溶液）的容器内，染色2 h左右后回收染色液，再用去离子水将凝胶漂洗3 次，倒入脱色液（乙酸、甲醇和去离子水之比为1∶3∶6的混合溶液）进行脱色过夜；采用PowerLook 2100XL-USB
成像系统对凝胶进行扫描。

1.3.4 ASC和PSC的氨基酸组成分析

分别精确称取10 mg左右胶原蛋白样品至水解管中，依次加入15 mL 6 mol/L的HCl溶液和4 滴新蒸馏的苯酚，真空封管，110 ℃条件下水解22 h，水解液定容至50 mL，取1 mL水解液在50 ℃条件下真空干燥后，用2 mL pH 2.2的柠檬酸钠缓冲液溶解，经0.45 μm水相滤膜过滤后，使用氨基酸自动分析仪进行测定，具体参照国标：GB/T 5009.124——2003《食品中氨基酸的测定》。

1.3.5 ASC和PSC的紫外扫描

将胶原蛋白样品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，配成1 mg/mL的胶原蛋白溶液，使用紫外-可见分光光度计对其进行扫描（波长范围为200～400 nm，波长间隔为1 nm），以0.5 mol/L乙酸溶液为空白对照。

1.3.6 ASC和PSC的FT-IR扫描

取2 mg胶原蛋白样品与KBr混合后置于玛瑙研钵中，在红外灯下研磨后手动压片，使用傅里叶变换红外扫描仪在4 000～400 cm-1范围内进行红外扫描，分辨率为10 cm-1。

1.3.7 ASC和PSC的热稳定性分析

胶原蛋白的热变性温度等同于其增比黏度（ηsp）变化50%时所对应的温度[17]。具体步骤为：将胶原蛋白样品溶于0.1 mol/L乙酸溶液中，于4 ℃条件下缓慢搅拌2 d，将其配制成0.3 mg/mL的胶原蛋白溶液。采用超级恒温槽将胶原蛋白溶液从10 ℃加热到50 ℃（每个温度间隔为5 ℃，共有8 个温度点）。在每个温度点保温30 min后，使用Brookfield黏度计的超低转速转子（转速为100 r/min）
测定胶原蛋白溶液在各温度点的黏度（η），将η除以对应温度下溶剂的黏度（η0）并减去1后可得胶原蛋白溶液的ηsp。

2 结果与分析

2.1 大鲵皮基本成分构成

表 1 鲵皮的基本成分

Table 1 General composition of the skin of Chinese giant salamander

注：以湿质量计。

由表1可知，大鲵皮中蛋白质含量最高，其次是脂肪和灰分。经换算后得知，鲵皮中的粗蛋白含量占鲵皮干质量的96.46%。

2.2 大鲵皮中胶原蛋白含量及其提取率

以吸光度为纵坐标、L-羟脯氨酸质量浓度为横坐标绘制标准曲线，其线性回归方程为：y=0.170 9x－0.002 9，相关系数R2=0.998 7。由线性方程得相应吸光值的羟脯氨酸含量，计算大鲵皮中胶原蛋白含量为（19.00±2.66）g/100 g（湿质量），换算成干质量则胶原蛋白含量高达60.66%，约占大鲵皮中蛋白质总量的62.89%。采用PSC时，当加酶量为198 IU/g，液料比为15 mL/g，酶解时间为29 h时，PSC提取率为66.99%；采用0.5 mol/L乙酸对ASC进行提取时，ASC提取率为28.88%。可见采用胃蛋白酶进行酶解之后，胶原蛋白提取率有了显著提高。

2.3 大鲵皮中胶原蛋白性质研究

2.3.1 SDS-PAGE图谱分析

泳道1.标准蛋白质；泳道2. ASC；泳道3. PSC。

图 1 鲵皮酸溶性和酶促溶性胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图

Fig.1 SDS-PAGE patterns of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

由图1可知，ASC和PSC都包含了2条α链（α1链和α2链）及它们的二聚体β链，其条带分别在97.2、116.0kD和200.0kD附近，其中α2链含量约为α1链的两倍，符合典型的Ⅰ型胶原蛋白特征，说明所提取胶原蛋白的构型为Ⅰ型。

从电泳图还可看出，ASC中的β链含量明显高于PSC，这是因为胃蛋白酶酶切掉了胶原蛋白的端肽，使部分β链转变成两条α链，导致PSC中β链含量降低而α链含量升高，且ASC中还含少量的三聚体γ链，这与对罗非鱼皮[18]、军曹鱼皮[19]、气球鱼皮[20]、大鳍长触须鲶鱼皮[12]的研究结果相一致。

此外，ASC和PSC的α链的电泳迁移率相同，表明胃蛋白酶只作用于胶原蛋白的非螺旋端肽，不会改变其三螺旋结构，通过低温酶法提取可获得保持生物活性的、低抗原性胶原，这也与刘磊[21]对海蜇胶原蛋白的研究相符合。

2.3.2 氨基酸组成分析

表 2 鲵皮酸溶性和酶促溶性胶原蛋白的氨基酸组成

Table 2 Amino acid profiles of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

注：表中数据以残基/1000残基计。

由表2可知，鲵皮ASC和PSC的氨基酸组成相似。胶原蛋白的氨基酸组成有其自身的特点。一般而言，除N端的前14个和C端的前10个氨基酸残基外，甘氨酸以重复的氨基酸序列（Gly-X-Y）n存在于胶原蛋白中，因此胶原蛋白中甘氨酸残基约占氨基酸残基总数的三分之一[11]。羟脯氨酸是胶原蛋白的特征性氨基酸，胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸是各种蛋白质中含量最高的[22]。此外，胶原蛋白中色氨酸缺乏、胱氨酸含量低。

ASC和PSC中甘氨酸含量最高（以残基/1 000残基计，下同），达217和261；谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸的含量较高，为85和100、82和99、62和74；组氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸含量较低；胱氨酸的含量最低。以上结果符合胶原蛋白的氨基酸组成特点。

脯氨酸、羟脯氨酸为亚氨基酸，其含量与物种及其栖息地相关，尤其与栖息地的环境温度相关[11]。鲵皮ASC中亚氨基酸含量低于PSC，分别为144和173，此结果与气球鱼皮较为相似（179和174）[20]、低于棕纹红鲷鱼皮（212和221）[11]、褐色带状竹鲨鱼皮（204和207） [23]以及条纹鲶鱼皮（206和217）[24]。脯氨酸和羟脯氨酸都为环状氨基酸，这与胶原蛋白三螺旋结构的稳定性密切相关，可赋予胶原蛋白较好的微弹性和较强的拉伸强度[25]。此外，亚氨基酸含量也与胶原蛋白的热变性温度有密切联系，随亚氨基酸含量升高，胶原蛋白的热稳定性越好，因此PSC的热稳定性要优于ASC。

2.3.3 紫外光谱分析

图 2 鲵皮酸溶性和酶促溶性胶原蛋白的紫外吸收光谱图

Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

由图2可知，组成蛋白质的各种氨基酸，在可见光区均没有光吸收，在远紫外区（10～200 nm）都有光吸收，在近紫外区（200～400 nm）只有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸有吸收光的能力 （一般最大的光吸收范围为250～290 nm）[19]。由于胶原蛋白中芳香族氨基酸含量较低，在250～290 nm范围内基本无吸收。但胶原肽链中所含C＝O、—COOH、CONH2均为生色基团，使得胶原蛋白在200～230 nm附近有较强的光吸收，这也可应用于对胶原蛋白进行定性[14]。

实验结果表明，ASC和PSC的最大吸收峰分别位于233 nm和232 nm处，与大鳍长须鲶鱼皮（ASC、PSC均在233 nm左右）[12]、斑点叉尾鮰皮（PSC在232 nm）[26]、气球鱼皮（ASC和PSC均在210～240 nm附近）[20]和牛蛙皮（PSC在236 nm附近）[27]的研究结果一致。说明ASC和PSC的紫外吸收符合胶原蛋白的吸收特征，也表明本研究得到的ASC和PSC具有较高的纯度。

2.3.4 FT-IR分析

由图3可知，ASC和PSC的特征吸收频率相似，但各特征吸收频率上的吸收强度相差较大。表3展示了鲵皮ASC和PSC的FT-IR谱图中各特征峰的具体波数位置及其形成机理，此结果与军曹鱼皮[19]、条纹鲶鱼[24]等的报道较为相似。

图 3 鲵皮酸溶性和酶促溶性胶原蛋白的FT-IR图

Fig.3 Fourier transform infrared spectra of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

表 3 鲵皮酸溶性和酶促溶性胶原蛋白的红外光谱吸收峰
位置及其形成机理

Table 3 FT-IR spectral peak locations and their formation mechanism of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

酰胺A主要由N—H的伸缩振动而引起，其吸收峰一般出现在3 400～3 440 cm-1范围内，但当其与氢键缔合后，对应的波数会有所偏移，一般为3 300 cm-1左右[14,28]。FT-IR图谱表明，ASC和PSC分别位于3 307.70、3 338.37 cm-1处的吸收峰是由酰胺A的N—H伸缩振动与氢键的缔合体引起的。酰胺B由CH2不对称伸缩振动而引起，一般出现在2 930 cm-1附近。因此，ASC和PSC分别位于2 958.94、2 939.02 cm-1处的较弱吸收峰是由酰胺B的CH2不对称伸缩振动引起。

酰胺Ⅰ带是由C＝O伸缩振动引起，其吸收峰最强，分别位于1 658.91、1 658.73 cm-1处。因其不受肽链侧基的影响，只取决于肽链的构型，故其对胶原蛋白三螺旋结构的变化较为敏感，从而与胶原蛋白的二级结构密切相关[17]。ASC和PSC分别位于1 542.15、1 553.28 cm-1是酰胺Ⅱ的特征吸收峰，它是由C—N伸缩振动以及N—H
弯曲振动引起[26]。ASC、PSC分别位于1 233.02cm-1、1 239.28 cm-1处的吸收峰由酰胺Ⅲ带中的N—H变形振动引起。酰胺Ⅲ带证明胶原蛋白中三螺旋结构的存在[29]。此外，ASC、PSC分别在酰胺Ⅱ带与酰胺Ⅲ间的一系列吸收峰（ASC：1 454.63～1 233.02 cm-1，PSC：1 453.15～1 239.28 cm-1）也表明了胶原蛋白三螺旋结构的完整性[30]。以上结果表明，本实验中经酸法和酶法提取的鲵皮胶原蛋白其三螺旋结构较为完整。

2.3.5 热稳定性分析

胶原蛋白的热变性温度可通过测定其溶液ηsp的变化确定。图4为鲵皮ASC和PSC的热变性曲线，纵坐标为增比黏度，横坐标为溶液温度，ηsp变化50%时所对应的温度即为热变性温度。

图 4 鲵皮酸溶性和酶促溶性胶原蛋白的热变性曲线

Fig.4 Thermal denaturation curves of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

由图4可知，ASC和PSC的增比黏度随温度升高而下降，尤其在20～30 ℃范围内下降幅度较大，这是因为此时胶原蛋白发生变性，从高度有序的三螺旋结构转变为无规则卷曲[31]。ASC的热变性温度低于PSC，两者的热变性温度分别为23.5 ℃和26.5 ℃，这与它们氨基酸组成中的亚氨基酸含量密切相关。由表2可知，ASC和PSC中亚氨基酸含量分别为144和173（残基/1 000残基）。亚氨基酸的吡咯环对蛋白质二级机构起到固定作用，同时羟脯氨酸的羟基形成的氢键能稳定胶原蛋白的三螺旋结构，因此胶原蛋白的热稳定性与亚氨基酸含量呈正相关[21]。

3 结 论

人工养殖大鲵皮中的胶原蛋白占鲵皮干质量的60.66%，采用0.5 mol/L乙酸和胃蛋白酶分别对鲵皮中ASC和PSC胶原蛋白进行了提取，提取率为28.88%和66.99%。电泳结果显示：ASC和PSC均包含2条α链及它们的二聚体β链，其构型为典型的Ⅰ型胶原蛋白。氨基酸组成分析显示：ASC和PSC中甘氨酸含量最高，其次为谷氨酸和脯氨酸，胱氨酸含量最低；ASC和PSC中亚氨基酸含量分别为144和173（以残基/1 000残基计），且由热变性曲线可知，两者热变性温度分别为23.5 ℃和26.5 ℃，表明PSC的热稳定性优于ASC，此结果也符合大鲵栖息的环境温度。ASC和PSC的紫外最大吸收峰分别位于233.0、232.0 nm处，符合胶原蛋白的紫外吸收特征。傅里叶变换红外扫描光谱图显示，ASC和PSC的红外特征吸收频率相似，均含有酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带及在两酰胺带间的一系列吸收峰，表明ASC和PSC中胶原蛋白的三螺旋结构较为完整。

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