女贞内生真菌清除自由基活性成分的分离纯化

陈安徽，陈宏伟，邵 颖，章 娣

（徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏 徐州 221008）

摘 要：采用组织块分离法对女贞的内生真菌进行分离，对分离到的菌株进行清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基活性研究，并对活性较强菌株代谢产物中的清除自由基成分进行分离纯化。从女贞的叶片、茎、根、枝条等组织共分离出101 株内生真菌，研究发现NZ-18菌株清除自由基活性最强，并采用液相色谱法对NZ-18发酵液中清除自由基活性成分进行制备。分离到一种活性较强的化合物1，经高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法和薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）法纯度验证，发现该化合物为纯品化合物经活性验证发现化合物1在样品质量浓度为0.5 mg/mL时对0.2 mg/mL的DPPH自由基清除率为94.88%。结果表明，女贞内生真菌中存在大量的清除自由基活性菌株。

关键词：女贞；内生真菌；自由基；成分；分离纯化

Separation and Purification of Free Radical Scavenging Bioactive Components from
Endophytic Fungi in Ligustrum lucidum

CHEN An-hui, CHEN Hong-wei, SHAO Ying, ZHANG Di

(College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

Abstract: Endophytic fungi were isolated from Ligustrum lucidum by tissue separation and their 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity was studied. Metabolite components with high DPPH radical scavenging activity were purified. One hundred and one strains of endophytic fungi were isolated from leaves, stems, roots and branches. It was found that NZ-18 strain had the highest DPPH radical scavenging activity and an active component was prepared from its fermentation metabolites by liquid chromatography, which was identified as a pure compound by HPLC and TLC and named as compound 1. The compound I at a concentration of 0.5 mg/mL could scavenge 94.88% of DPPH at 0.2 mg/mL. The present study indicated that there were many endophytic strains from Ligustrum lucidum whose metabolites could scavenge DPPH free radical.

Key words: Ligustrum lucidum; endophytic fungi; free radical; component; purification

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0101-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409021

女贞为木犀科女贞属常绿乔木，亚热带树种。女贞在中国主要分布在江浙、江西、安徽、山东等地，其成熟的果实晒干为中药材女贞子。黄雯等[1]采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法对女贞子药材中女贞苷的含量进行了分析；侯杰等[2]研究了炮制对女贞子中多糖和5-羟甲基糠醛含量的影响。国内外对女贞的相关研究报道主要集中在女贞子活性成分分析，提取物相关药理学活性研究和其他中药材配方工艺等方面[3-11]。

近年来，随着自由基衰老理论的提出以及大量实验依据，使得自由基衰老学说得到了广大学者的支持。1984年，Hailliwell首次提出氧化损伤是引起组织损伤的原因，氧化应激对组织损伤的恶化有明显的促进作用，很多疾病的主要原因之一是自由基过多[12-17]。据统计，大约有100种疾病与自由基有关，从人类死亡率最高的心血管疾病到人类最可怕的癌症，以及近年来对人类造成巨大威胁的艾滋病，无一不和氧自由基有着密切的关系。从植物内生真菌中寻找新型清除自由基活性成分已成为当前的研究热点。目前关于内生菌的概念范畴还有争议，在现在的内生菌研究中，Bills等[18-20]提出的内生菌概念及相关研究理念被微生物学者、药学工作者广泛接受。本实验从女贞中分离内生真菌，对分离到的内生真菌清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基活性进行研究，并对清除DPPH自由基活性较强菌株代谢产物中清除自由基活性成分进行分离、纯化，以期为天然自由基清除剂的开发、活性菌株和宿主植物之间的关系研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

女贞材料采集自徐州市泉山森林公园，由徐州工程学院邵颖博士鉴定。

DPPH 美国Sigma公司；甲醇 上海一试化学试剂有限公司；三氯甲烷 徐州市科翔化学试剂有限责任公司；乙酸乙酯 天津市福晨化学试剂厂；石油醚 天津市福晨化学试剂厂；以上皆为分析纯。甲醇（色谱纯） 美国Tedia公司。

1.2 仪器与设备

Spectra Max M2全波长扫描酶标仪 美国Molecular device公司；Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm） 美国Waters公司；SENCO R-502B真空旋转蒸发仪 上海申胜生物技术有限公司；WFH-203B三用紫外分析仪 上海精科实业有限公司；BSZ-100自动收集仪 上海沪西分析仪器厂；HZQ-F 160全温振荡培养箱 哈尔滨东联电子公司；TL-15高速冷冻离心机 江苏图门离心机厂；AE200型梅特勒电子天平 上海分析仪器厂；LC3100高效液相色谱仪、P3100D二元高压梯度恒流泵、V3100紫外-可见光检测器、AT3100柱温箱 安徽皖仪科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

采集不同部位的女贞的根、枝条、果实和树皮等组织，拍照、记录、装袋低温保存。

1.3.2 菌株分离

将新鲜的植物样本用水洗净，浸泡于75%乙醇3～5 min消毒以去除表面附生的微生物，无菌水冲洗3～5 次，根与茎取韧皮部切成0.5 cm左右的小段（两端均需有切口），果实横截面切段，再转移到加有抗生素的PDA培养基平板中培养，培养温度为22 ℃。待菌落从切口处长出后，进一步纯化，以供微生物鉴定和菌种的保藏。为验证材料表面消毒的效果，做对照实验：将上述同样表面消毒过的部分材料不做剪切，直接置于PDA平板上作对照培养处理，结果若对照材料周围均无任何真菌长出，证明表面消毒彻底，从而保证了所分离出的真菌是植物的内生真菌而不是空气中或组织块表面附生的微生物。

1.3.3 分离培养基及初筛样品的制备

取马铃薯200 g（去皮，切成小块煮沸20 min，纱布过虑），葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，以蒸馏水定容到1 L。每个500 mL三角瓶装200 mL培养液。121 ℃高压灭菌20 min，冷却后用接入一级斜面种子，放入（22±0.5）℃，转速为120 r/min的全控温培养箱中培养。10 d后将培养好的菌株发酵醪液在6 000 r/min转速下离心15 min，收集上清液，菌丝体丢弃。发酵液采用低温真空浓缩处理，浓缩至原体积的1/5后，加入95%乙醇使乙醇终体积分数为65%，置于4 ℃冰箱静置醇沉12 h，后于6 000 r/min转速下离心3 min，收集上清液并浓缩至原体积的1/10后，用乙酸乙酯连续萃取3 次，合并萃取液，浓缩脱除乙酸乙酯溶剂后用甲醇配成10 mg/mL的待测样品。

1.3.4 DPPH自由基清除率测定[21-22]

加不同质量浓度样品溶液A 100 μL和0.2 mg/mL DPPH试液100 μL于96 孔酶标板中，重复实验3次。样品加入后振荡30 s，在37 ℃、517 nm波长处测定其吸光度（Ap）；37 ℃保温，20 min后再测定一次。测定不加DPPH的样品空白吸光度（Ac）和加DPPH但不加样品（以90%甲醇100 μL代替样品）的吸光度（Amax）。最后按下列公式计算。

1.3.5 活性指导下的分离

活性提取物的确定：将筛选出的活性菌株发酵液萃取物，配成0.5 mg/mL的溶液，用1.3.4节方法进行活性测定，活性提取物进样5 µL，采用高效制备液相色谱法进行进一步的分离纯化。

洗脱速率：分析时为1 mL/min，制备时为4 mL/min；检测波长：制备时采用210 nm波长，验证纯度时采用210 nm和254 nm两种波长。

样品收集及纯度鉴定：按峰收集时对无峰的馏分也要收集以免目标组分流失。收集到的各个组分用旋转蒸发仪40～48 ℃减压浓缩，进行活性测定，确定活性物质的保留时间，然后用HPLC和薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）方法进行纯度分析。在HPLC分析中发现在同一色谱条件下，不同物质出峰时间不同，同一物质在不同色谱条件条件下产生的色谱峰面积大小、保留时间也不相同，经HPLC方法证明是纯物质必须在两种以上色谱条件下分析后，当均呈现单一吸收峰时，方可认为此物质为单一物质；TLC分析也发现是纯物质必须在两种以上展开剂中展开，且经两种以上显色剂显色方法显色后，当均呈现单一斑点时，方可认为此物质为单一物质，本实验综合HPLC和TLC分析方法验证活性物质的纯度。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的分离结果

表 1 不同部位内生真菌菌株比较

Table 1 Comparison of the distribution of endophytic fungi in different different parts of Ligustrum lucidum

由表1可知，女贞各部位材料共分离出101 株内生真菌，按照分离纯化的先后顺序分别进行标记编号（NZ-1、NZ-2、……、NZ-101），其中从果实中分离出8 株（占分离总数的7.9%），茎中分离出25 株（占分离总数的24.8%），根中分离出30 株（占分离总数的29.7%），叶中分离出38 株（占分离总数的37.6%）。

女贞内生真菌数量在不同组织部位中差异明显，可能是由于女贞不同组织部位的微环境（如水分含量、营养物质的质量浓度、通气情况、空气湿度、酶和化学成分）不同造成的。

2.2 活性菌株的筛选

将101株供试菌株发酵液样品按照1.3.3节中所述方法处理后，经1.3.4节中所述DPPH自由基清除率测定方法进行分析，结果表明，所有供试菌株代谢产物均具有一定的清除DPPH自由基清除活性，但是不同菌株的活性大小不同，如菌株NZ-18的样品在质量浓度为10 mg/mL
时，对0.2 mg/mL的DPPH自由基清除率为58.3%，而NZ-38菌株仅为13.2%。实验结果如表2所示（仅列出清除率超过40%的菌株）。

表 2 不同供试菌株次生代谢产物自由基清除率

Table 2 Free radical scavenging rates of secondary metabolites from different endophytic fungal strains

由表2可知，分离的14 株对0.5 mg/mL DPPH自由基清除率超过40%的菌株中，3 株来自根，4 株来自叶片，7 株来自茎部。这可能是由于茎部营养物质较为充分并且适合微生物生长，再加上茎部组织暴露于空气当中昼夜温差较为显著，导致微生物的次生代谢产物较为丰富。实验中发现NZ-18对自由基的清除率（58.3%），显著高于其他菌株（P＜0.05），故对该菌株代谢产物中清除DPPH自由基活性成分进行分离。

2.3 活性物质的分离制备

图 1 NZ-18发酵液提取物的HPLC图谱

Fig.1 HPLC chromatogram of ethyl acetate extract from fermentation broth of NZ-18

由图1可知，菌株NZ-18的发酵液乙酸乙酯提取物中成分较为复杂，主要洗脱峰有10 个，分别收集各洗脱液，浓缩至原体积的1/20后进行活性验证，结果如表3所示，多个保留时间处的洗脱液有清除DPPH自由基活性，但是仅有保留时间为30.618 min处的洗脱液清除DPPH自由基活性最强，对0.05 mg/mL DPPH自由基清除率达到83.5%。为保证纯度，主要收集保留时间为色谱峰的中段较纯部分，峰两边单独收集备用。连续进样15 次，收集保留时间为30.618 min处色谱峰中段部分洗脱液，合并后标记为化合物1，以便进行进一步的活性测定和纯度鉴定。

表 3 不同洗脱组分对DPPH自由基清除率

Table 3 DPPH radical scavenging rates of different elution fractions

注：－.未发现DPPH自由基清除活性。

2.4 制备样品的纯度及活性验证

将高效液相制备色谱制备的化合物1，配制成约0.5 mg/mL的样品溶液，然后进样5 µL以按照1.3.5节所述色谱条件下进行HPLC分析，结果如图2所示。

图 2 化合物1在210 nm（A）和254 nm（B）波长处的HPLC图谱

Fig.2 HPLC chromatogram of compound 1

由图2A、B可知，化合物1在不同色谱条件下，HPLC图谱上仅一目标峰，且除此主峰外，无其他吸收峰出现，由此可知化合物1纯度较高。另外，化合物1在图2A的保留时间为30.881 min，与图1中发酵液乙酸乙酯提取物中活性成分的保留时间30.618 min，几乎完全一致，这说明样品制备过程中化合物1的性质未发生变化。

A. 展开剂V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=60∶35∶5，
B. 展开剂V（氯仿）∶V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=5∶2∶3；1.硫酸乙醇显色，2.碘蒸汽显色，3. 254 nm紫外光，4. DPPH显色。

图 3 化合物1薄层色谱分析图谱

Fig.3 TLC assay of compound 1

为了进一步确定化合物1的纯度，进行薄层展开，当均呈现单一斑点时，方可认为化合物1为单一物质。图3A为展开剂V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=60∶35∶5条件下的薄层色谱图，图3B为展开剂V（氯仿）∶V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=5∶2∶3条件下的薄层色谱图。

由图3A、B可知，化合物1在不同展开剂、不同显色条件下均为单一的斑点，HPLC分析图谱分析结果与薄层分析结果一致，因此说明化合物1为单一纯品化合物。化合物1用DPPH显色后都显有黄色斑点，因此具有有清除自由基作用。将化合物1配制成质量浓度为0.5 mg/mL的样品，DPPH用甲醇配成质量浓度为0.2 mg/mL的试剂，按照1.3.4节所述方法进行清除自由基活性的定量测定，结果发现化合物1对自由基的清除率为94.88%。

3 结 论

采用组织块分离法对女贞的内生真菌进行分离，并对菌株代谢产物中清除DPPH自由基进行活性研究。从女贞的叶片、茎、根、枝条等组织共分离出101 株内生真菌。其中从果实中仅分离出8 株内生真菌数量最少，从叶中分离的内生真菌数量最多为38 株，占总分离总数的37.6%，导致这种现象的原因可能是由于植物在生长的过程中，不同部位的微环境不同造成的。对分离到的内生真菌进行进行清除DPPH自由基活性研究，结果发现多数微生物具有一定的清除自由基活性，但是仅有一株分离自女贞颈部组织NZ-18菌株清除自由基活性最强。采用液相色谱法对NZ-18发酵液中清除自由基活性成分进行了分离制备，得到一种活性较强的化合物1，经HPLC法和TLC法纯度验证，结果发现在HPLC色谱图中化合物在不同流动相、不同检测波长条件下，色谱图中仅出现一主峰；在TLC分析发现在不同展开剂、不同显色剂条件下，薄层色谱板上均出现一斑点，综合实验结果说明化合物1在为纯品化合物。经活性验证发现化合物1在质量浓度0.5 mg/mL时，对0.2 mg/mL的DPPH自由基清除率高达94.88%。实验结果说明女贞内生真菌中存在大量的清除自由基活性菌株，为天然自由基清除剂的开发提供了新的资源，同时也为进一步研究活性菌株和宿主植物之间的关系提供科学研究依据。

参考文献：

[1] 黄雯, 苏子仁, 毕文川, 等. HPLC法测定女贞子药材中女贞苷的含量[J]. 药物分析杂志, 2009, 29(5): 824-826.

[2] 侯杰, 张学兰. 炮制对女贞子中多糖和5-羟甲基糠醛含量的影响[J]. 中成药, 2009, 31(4): 572-5751.

[3] 蒋叶娟, 姚卫峰, 张丽, 等. 女贞子化学成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(15): 2304-2308.

[4] 李磷, 邱蓉丽, 程革, 等. 女贞子多糖抗肿瘤作用研究[J]. 中国药理学通报, 2008, 24(12): 1619-1622.

[5] 曹兰秀, 周永学, 顿宝生, 等. 女贞子总黄酮对高脂模型大鼠脂代谢的影响[J]. 第四军医大学学报, 2009, 30(20): 2129-2132.

[6] GUO Na, YU Youhua, ABLAJAN K, et al. Seasonal variations in metabolite profiling of the fruits of Ligustrum lucidum Ait[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2011, 25(12): 1701-1714.

[7] CHEN Gang, ZHANG Luyan, WU Xingliang, et al. Determination of mannitoland threesugars in Ligustrum lucidum Ait by capillary electropho-resis with electrochemical detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 530 (1): 15-21.

[8] 王俊文, 白玮纬, 李军超, 等. 一种测定女贞子中齐墩果酸和熊果酸的新方法[J]. 西北植物学报, 2011, 31(9): 1894-1899.

[9] LIU Haixing, SHI Yuhua, WANG Dexian, et al. MECC determination of ole-anolic acid and ursolic acid isomers in Ligustrum lucidum Ait[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003, 32(3): 479-485.

[10] 张廷芳, 段营辉, 屠凤娟, 等. 女贞子中一个新的裂环环烯醚萜苷类成分[J]. 中草药, 2012, 43(1): 42-44.

[11] 吴地尧, 胡魁伟, 康琛. 女贞子药材中甘露醇的含量测定[J]. 中国实验方剂学杂志, 2008, 14(7): 8210.

[12] 赵铎, 王伟. 女贞子对脊髓损伤大鼠HSP70的表达及自由基的影响[J]. 新中药, 2012, 44(10): 125-127.

[13] YURI M. Oxidative stress, radiation-adaptive responses and aging[J]. Journal of Radiation Research, 2004, 45(3): 357-372.

[14] NYSTROM T. The free-radical hypothesis of aging goes prokaryotic[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2003, 60(7): 1333-1341.

[15] 陈瑾欣, 陈建业. 自由基与衰老关系的研究进展[J]. 川北医学院学报, 2004, 19(1): 207-209.

[16] JUNQUEIRA V B, BURROS S B, CHAN S S, et al. Aging and oxidative stress[J]. Molecular Aspects of Medicine, 2004, 25(2): 5-16.

[17] 高良才, 陈婉容. 自由基与衰老[J]. 生物学教学, 2001, 26(1): 8-10.

[18] BILLS G F, POLISHOOK J D. Recovery of endophytic fungi from Chamaecyparis thyoides[J]. Sydowia, 1992, 44(3): 1-12.

[19] 任安芝, 高玉葆. 植物内生真菌: 一类应用前景广阔的资源微生物[J]. 微生物学通报, 2001, 28(6): 90-93.

[20] PETRINI O, FISHER P J, PETRINI L E. Fungal endophytes of bracken (Pteridium aquilinum) with some reflections on their use in biological control[J]. Sydowia, 1992, 44: 282-293.

[21] 王剑文, 夏忠豪, 谭仁祥. 内生真菌Colletohichum sp.B501的寡糖提取物对黄花蒿发根中青蒿素生物合成的诱导[J].西北植物学报, 2002, 44(10): 1233-1238.

[22] KI W L, YOUNG J K. Cocoa has more phenolic phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and red wine[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 7292-7295.