胶原蛋白与壳聚糖复合膜的机械性能

陈达佳，赵 利*，袁美兰，苏 伟，刘 华，陈丽丽

（江西科技师范大学生命科学学院，国家淡水鱼加工技术研发分中心（南昌），江西 南昌 330013）

摘 要：以鮰鱼皮胶原蛋白与壳聚糖为原料制备可食用复合膜。通过正交试验考察胶原蛋白与壳聚糖的质量比、增塑剂种类及添加量、热处理温度及时间等工艺参数对可食用复合膜性能的影响。结果表明：胶原蛋白与壳聚糖质量比和热处理温度对拉伸强度影响较大；甘油添加量对复合膜断裂伸长率影响显著，而热处理时间对复合膜断裂伸长率有较小的影响。最佳机械性能复合膜制备工艺为：胶原蛋白与壳聚糖质量比为6∶4，甘油添加量（以总溶质计）20%、热处理温度为70 ℃、热处理时间为30 min。在此条件下，得到的复合膜表面光滑无气泡，拉伸强度为（21.98±0.33）MPa，断裂伸长率为（127.35±3.03）%。

关键词：胶原蛋白；壳聚糖；可食用复合膜；机械性能

Mechanical Properties of Collagen-Chitosan Composite Film

CHEN Da-jia, ZHAO Li*, YUAN Mei-lan, SU Wei, LIU Hua, CHEN Li-li

(National R&D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing(Nanchang), School of Life Science,
Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

Abstract: The aim of this work was to develop an edible composite film based on Chinese longsnout catfish (Leiocassis longirostris Günther) skin collagen and chitosan. Using an orthogonal array design, mechanical properties of the film were investigated as a function of mass ratio of collagen to chitosan, plasticizer type and concentration, and heating temperature and time. The results showed that mass ratio of collagen to chitosan had a greater effect on the tensile strength of composite films than heating temperature. The elongation at break was significantly affected by plasticizer type and concentration but only marginally by heating time. The optimal preparation conditions that provided the best mechanical properties were determined as 6:4, 20%, 70 ℃ and 30 min for mass ratio of collagen to chitosan, glycerol concentration (relative to total solutes), heating temperature and time, respectively. The surface of composite films under the optimized conditions was smooth and without any bubbles. The tensile strength was
(21.98 ± 0.33) MPa and the elongation at break was (127.35 ± 3.03)%.

Key words: collagen; chitosan; edible composite film; mechanical properties

中图分类号：TS254.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0112-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409023

随着人们生活节奏的加快，对高质量及长货架期食物的消费需求越来越多。目前，环境管理政策部门鼓励研究者对可食用膜进行研究[1]。可食用膜作为食品包装材料，需要具备良好的包装性能，如：良好的机械性能、对水蒸汽有高屏障性、对理化环境稳定性、微生物安全性、无污染和低成本等[2]。用作可食用膜的材料主要有蛋白质和多糖类生物高分子[3-4]，然而单独的蛋白类膜或多糖类膜与合成聚合物相比，较高的水蒸气透过率和较低的机械性能的特点限制了其在包装材料中的应用。

壳聚糖是虾、蟹等甲壳类动物壳中的提取物，来源非常丰富。纯壳聚糖成膜具有阻水性能好且能抑制微生物生长等优点，但是成膜机械强度不大。胶原蛋白是广泛存在于动物体中的生物材料，工业中使用的胶原蛋白主要来源于猪、牛等哺乳动物的皮肤和骨骼。近年来随着水产品消费的增加，各种哺乳动物疾病如疯牛病、口蹄疫的发生以及有些民族宗教的限制，使得研究者们倾向于从水产品中提取胶原蛋白，从而代替哺乳动物中提取的胶原蛋白。但水产品胶原蛋白与哺乳动物胶原蛋白相比，具有一些性质的差异，如：水产品中胶原蛋白的羟脯氨酸（Hyp）含量较哺乳动物中胶原蛋白的Hyp含量低；水产品中胶原蛋白的变性温度要比哺乳动物中的胶原蛋白变性温度低约10～15 ℃。纯胶原蛋白成膜机械性质和水蒸气透过率性质较差[5]。胶原蛋白分子中有大量羧基、羟基等活性基团；壳聚糖是一种阳离子聚合物，分子中有大量氨基、羧基等活性基团；两种高聚物之间很容易产生氢键、离子键等作用[6]。刘文辉等[7]采用酶法从牛皮中提取出胶原蛋白，再与壳聚糖复合成膜，后者对水蒸气阻隔性能较好，但机械性能较差。

本实验采用酸法从鮰鱼皮中提取胶原蛋白再与壳聚糖复合，通过研究胶原蛋白与壳聚糖质量比、不同增塑剂（甘油、山梨醇、聚乙二醇400）、不同增塑剂添加量（10%、20%、30%）、热处理温度以及热处理时间对复合膜机械性能影响，以影响复合膜机械性能的主要因子进行正交试验，确定制膜工艺，提高复合膜机械性能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胶原蛋白由农业部淡水鱼加工技术研发分中心（南昌）提供[8]。

壳聚糖 北京索莱宝科技有限公司；甘油、聚乙二醇400、山梨醇、冰乙酸 天津大茂化学试剂厂；六水合硝酸镁、无水氯化钙 西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

CT3质构仪 美国Brookfield公司；N-1100旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；79HW-1恒温磁力搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；烘箱 上海一恒科学仪器有限公司；UV-1100紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 复合膜的制备及性能表征

1.3.1 复合膜的制备

将壳聚糖溶于2%体积分数的乙酸溶液中，加热搅拌后得到质量浓度为2 g/100 mL的壳聚糖溶液。用0.5 mol/L的乙酸提取鮰鱼皮中的胶原蛋白3 d，取一定量旋转蒸发浓缩至质量分数为6.67%。

将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按一定比例混合，加入一定量增塑剂，加热搅拌一段时间，去除气泡，流延于聚乙烯盘内，在50 ℃条件下干燥24 h，移出后揭膜，将膜置于盛有饱和Mg(NO3)2•6H2O溶液的干燥器中，25 ℃条件下，保持相对湿度（50±3）%，48h后测定膜的各项性能指标。

1.3.2 机械性能测定

按照Arvanitoyannis等[9]的方法，采用质构仪TA-XT2i测定各膜的抗拉伸强度（tensile strength，TS）和断裂拉伸率（elongation at break，EAB）。每种膜测定5个平行样，每个样品大小为1.5 cm×8 cm。

拉伸强度指膜在轴向拉伸力作用下，破裂前所承受的最大应力，按式（1）计算。

（1）

式中：TS为膜的抗拉伸强度/MPa；F为轴向拉伸力/N；L为膜的宽度/mm；d为膜的厚度/mm。

断裂伸长率是评价膜在拉伸测试中破裂时的延伸能力的指标，按式（2）计算。

（2）

式中：EAB为断裂伸长率/%；L为膜样品在断裂时所达到的长度/mm；L0为膜的初始长度/mm。

1.3.3 水蒸气透过率（water vapor permeability，WVP）的测定

采用修正的ASTM[10]的方法测定。干燥器底部加饱和硝酸镁溶液，25 ℃条件下，相对湿度保持在50%。透湿杯内装无水氯化钙，透湿杯上覆盖待测膜，置于相对湿度为50%的干燥器内，每隔1 h称量透湿杯的质量。水蒸气透过率按式（3）计算。

（3）

式中：WVP为水蒸气透过率/（（g•mm）/（h•m2•kPa））；m为透视杯增加的质量/g；t为水蒸气透过的时间/h；d为样品膜厚度/mm；S为样品膜实验面积/m2；
ΔP为试样两侧的蒸汽压/kPa，由于膜两侧的相对湿度梯度为50%、测定温度为25 ℃，故ΔP为1.584 kPa。

1.3.4 溶解度的测定

按照Gontard等[11]的方法，将膜样（2 cm×2 cm）在100 ℃条件下干燥至恒质量，称质量m1，然后将样品直接放入盛有50 mL蒸馏水的离心管中，在室温25 ℃条件下浸泡24 h，隔一段时间搅动一下离心管。将没有溶解的膜取出来，用滤纸吸干表面的水分，在100 ℃条件下干燥至恒质量，称质量m2。溶解度按式（4）计算。

（4）

式中：m1为膜溶解前干燥后的质量/g；m2为未溶物干燥后的质量/g。

1.3.5 透光率的测定

将待测样品裁剪成10 mm×50 mm矩形，贴于比色皿内侧，采用修正过的ASTM [12]的方法在800 nm波长处测定透光率，以空比色皿作为对照，用透光率大小间接表示膜的透明度。

1.3.6 单因素试验

1.3.6.1 胶原蛋白与壳聚糖质量比对复合膜性能的影响

将胶原蛋白与壳聚糖按质量比10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10混合，加入20%的甘油，在50 ℃条件下加热搅拌30 min，去除气泡，流延于聚乙烯盘内，在50 ℃条件下干燥24 h，移出后揭膜，将膜置于盛有饱和Mg(NO3)2•6H2O溶液的干燥器中，25 ℃条件下，保持相对湿度（50±3）%，48 h后测定膜的各项性能指标。

1.3.6.2 增塑剂种类及添加量对复合膜性能的影响

将胶原蛋白与壳聚糖按质量比6∶4混合，以总溶质计分别加入10%、20%、30%的增塑剂（山梨醇、甘油、聚乙二醇400），在50 ℃条件下加热搅拌30 min，去除气泡，流延于聚乙烯盘内，在50 ℃条件下干燥24 h，移出后揭膜，将膜置于盛有饱和Mg(NO3)2•6H2O溶液的干燥器中，25 ℃条件下，保持相对湿度（50±3）%，48 h后测定膜的各项性能指标。

1.3.6.3 热处理温度对复合膜性能的影响

将胶原蛋白与壳聚糖按质量比6∶4混合，加入20%的甘油，分别在40、50、60、70、80 ℃条件下加热搅拌30 min，去除气泡，流延于聚乙烯盘内，在50 ℃条件下干燥24 h，移出后揭膜，将膜置于盛有饱和Mg(NO3)2•6H2O溶液的干燥器中，25 ℃条件下，保持相对湿度（50±3）%，48 h后测定膜的各项性能指标。

1.3.6.4 热处理时间对复合膜性能的影响

将胶原蛋白与壳聚糖按质量比6∶4混合，加入20%的甘油，在70 ℃条件下分别加热搅拌10、30、50、70、90 min，去除气泡，流延于聚乙烯盘内，在50 ℃条件下干燥24 h，移出后揭膜，将膜置于盛有饱和Mg(NO3)2•6H2O溶液的干燥器中，25 ℃条件下，保持相对湿度（50±3）%，48 h后测定膜的各项性能指标。

1.3.7 复合膜表观特征评分标准

表 1 复合膜表观特征评分标准

Table 1 Grading criteria for apparent characteristics of composite films

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白与壳聚糖质量比对复合膜性能的影响

由表2可知，纯胶原蛋白成膜的TS为（1.37±0.09）MPa，
EAB为（187.45±0.18）%，这与马春辉等[13]研究的结果一致；纯壳聚糖膜TS为（11.47±0.39）MPa，EAB为（89.37±1.49）%，这与宫志强[6]研究的结果一致。复合膜的TS先增加后减小再增加，当胶原蛋白与壳聚糖质量比为8∶2时，复合膜的TS从（1.37±0.09）MPa增加到（6.11±0.81）MPa，说明当胶原蛋白中加入壳聚糖有助于提高膜的TS；当胶原蛋白与壳聚糖质量比为6∶4时TS达到最大，为（15.18±0.38）MPa，这可能是由于此时胶原蛋白与壳聚糖分子间的相互作用强烈，形成共价键及氢键，使得TS增大。随着壳聚糖量的继续增加，TS先减小再增加，这可能是由于少量的胶原蛋白打乱了原本结构较为规则的壳聚糖分子，减弱了壳聚糖分子间的氢键作用，影响其定向排列，形成的膜结构致密度比纯的壳聚糖低，从而导致膜的TS降低。

表 2 胶原蛋白-壳聚糖质量比对复合膜性质的影响

Table 2 Effect of collagen-to-chitosan mass ratio on mechanical properties of the film

注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

复合膜的EAB随着壳聚糖的加入，总体呈下降趋势，这可能是由于随着壳聚糖的加入，与胶原蛋白分子间的交联度大大增加，使得分子链的流动性降低，从宏观上就表现为EAB降低。胶原蛋白与壳聚糖按质量比为6∶4时，EAB为（195.81±7.88）%。

随着壳聚糖在复合膜中所占比例的增加，WVP先减小再增加。当复合膜中胶原蛋白与壳聚糖质量比为8∶2和6∶4时与纯壳聚糖膜相比WVP不存在显著性差异（P＞0.05），
而与纯胶原蛋白膜相比显著降低（P＜0.05）。

纯胶原蛋白膜在水中完全溶解，这与Gennadios等[14]研究的结果一致；而纯壳聚糖膜在水中的溶解度很低（21.66±0.68）%，与Pereda等[15]研究的数据相符合。总的来看，溶解度随着壳聚糖量的增加而减小，这可能的原因有两方面：一是壳聚糖不易溶于水，随着壳聚糖所占比例的增加导致溶解度下降；二是壳聚糖-胶原蛋白混合增加了复合膜的交联度，使得复合膜更加致密，导致复合膜溶解度降低。

除了纯胶原蛋白膜透光率较低外，壳聚糖及复合膜在800 nm波长的透光率均大于80%，说明复合膜中胶原蛋白与壳聚糖的相容性较好。单组分膜的微结构紧密，膜的表面光滑，复合膜由于不同组分的混合，经干燥后形成膜的透光率较纯壳聚糖膜稍差。这是因为在膜基质形成过程中，两相高聚物粒子大小不一，沉降速度不一致，从而导致复合膜透光率降低[16]。

因此，综合考虑各方面因素，选用胶原蛋白与壳聚糖质量比为6∶4。

2.2 增塑剂种类及添加量对复合膜性能的影响

由表3可知，随着3种增塑剂添加量在膜体系中的增大，膜的TS都不断减小。在未加入增塑剂时，复合膜脆、易断裂，甚至不能够完整的揭膜，与之相比在加入低含量的增塑剂时，复合膜的EAB都有很大提高，但当增塑剂的用量进一步增大时，不同的增塑剂对复合膜的EAB的影响表现出较大的不同。以甘油为增塑剂的复合膜，EAB随膜体系中甘油含量的增大而增大，增塑效果最好，这可能是由于甘油的添加能够削弱大分子分子间或分子内相互作用力，软化了膜的刚性结构，增大了体系的自由体积和分子链的流动性，导致柔韧性增强[17]。山梨醇对复合膜的EAB的影响趋势与甘油类似，不同的是，山梨醇对膜的EAB的影响比甘油对膜EAB的影响低，这可能是由于对于羟基化合物来说，增塑效能主要取决于其羟基的含量[6]，在相同质量下，甘油含有更多的羟基，因而其增塑效能比山梨醇高。随着聚乙二醇400在复合膜体系中含量的增加，EAB逐渐减小，这可能是由于当聚乙二醇400在复合膜中所占比例较低时容易插入胶原蛋白与壳聚糖分子链间，并与其中众多的羟基、羰基、氨基形成氢键，软化了膜的刚性结构，从而增加其EAB，但当聚乙二醇400在复合膜中所占比例达到30%，由于其分子量较大，聚乙二醇400与胶原蛋白-壳聚糖复合物质的相容性降低，部分聚乙二醇400溶出，反而影响了其增塑作用，导致EAB降低。当加入甘油20%时对复合膜的增塑效能最优：TS为（15.18±0.38）MPa，EAB为（195.81±7.88）%。

表 3 增塑剂种类及添加量对复合膜性质的影响

Table 3 Effect of plasticizer type and concentration on mechanical properties of the film

不同增塑剂对复合膜WVP的影响，都是随着增塑剂添加量的增加而增加，在加入相同量增塑剂的条件下，加入山梨醇的复合膜WVP最小，而加入甘油和聚乙二醇400对复合膜的WVP没有显著性区别，这与Thomazine等[18]对不同增塑剂及添加量对明胶膜的影响的结果一致。膜的溶解度随着增塑剂的添加量的增加而减小，这可能是因为增塑剂的加入与两种高分子中较多的极性基团形成氢键，水分子不易插入其中，因而溶解度降低。不同增塑剂所制得的膜溶解度大小顺序为：山梨醇＞聚乙二醇＞甘油。分别以山梨醇、甘油、聚乙二醇400为增塑剂的复合膜在800nm波长处的透光率均在80%左右，说明复合膜中增塑剂与胶原蛋白、壳聚糖的相容性较好。其中复合膜的透光率随着山梨醇和聚乙二醇400添加量的增加而增加，随着甘油添加量的增加而减小，这与Jongjareonrak等[19]对不同增塑剂及浓度对黄笛鲷皮明胶膜研究中的结果相一致。

因此综合考虑各方面因素，选用增塑剂为甘油，添加量20%。

2.3 热处理温度对复合膜性能的影响

表 4 热处理温度对复合膜性质的影响

Table 4 Effect of heat treatment temperature on mechanical properties of the film

由表4可知，随着热处理温度的升高，膜的TS整体来看是先增大后减小。这可能是由于较高的热处理温度有助于胶原蛋白与壳聚糖分子的运动速度，提高两者相互作用的机率，增加两种分子相互作用的机会，使得相互作用力逐渐增强，形成的膜结构也趋于致密。在70 ℃达到TS最大，为（22.40±0.61）MPa。当加热温度达到80 ℃时，TS降低到（16.79±0.98）MPa，这可能是由于此时加热温度超过了胶原蛋白与壳聚糖形成的交联物质的热变性温度75.59 ℃[20]，导致复合物变性使得膜的TS下降。膜的EAB在热处理温度为50 ℃达到最大值（196.84±6.76）%，随后随着热处理温度的增加而减小，这可能是由于随着交联作用的增加，加大了复合膜的致密度，导致EAB降低。当加热温度过达到80 ℃，复合膜的EAB从70℃时的（140.83±7.80）%降到（104.68±0.66）%，这可能是由于此时加热温度超过了胶原蛋白与壳聚糖形成的交联物质的热变性温度75.59 ℃[20]，导致复合物变性使得EAB降低。

复合膜的WVP随着热处理温度的升高而先减小，当加热温度为60、70、80 ℃时WVP没有显著改变。这可能是由于适当的加热温度，有利于胶原蛋白与壳聚糖分子之间的交联，提高的其阻隔水蒸气的性能[21]。复合膜的溶解度随着热处理温度的升高先减小再增加，当热处理温度分别为50、60、70 ℃时没有显著性差别（P＜0.05），当温度升到80 ℃溶解度显著升高到（73.67±4.87）%。这可能是由于适当的热处理温度，有利于胶原蛋白与壳聚糖分子之间的交联，提高了其致密度，使得溶解度下降。当加热温度达到80 ℃时，膜的溶解度从此时加热温度超过了胶原蛋白与壳聚糖形成的交联物质的热变性温度75.59 ℃[20]，导致溶解度上升。

复合膜的透光率在热处理温度分别为50、60、70、80 ℃时与热处理温度为40 ℃为相比有显著性增加
（P＜0.05）。而当热处理温度分别为50、60、70、80 ℃时，复合膜的透光率没有显著性改变。

因此，综合考虑各方面因素，选用热处理温度为70℃。

2.4 热处理时间对复合膜性能的影响

表 5 热处理时间对复合膜机械性质的影响

Table 5 Effect of heat treatment time on mechanical properties of the film

复合膜的TS随着热处理时间的增加先迅速增加再逐渐减小，在热处理时间为30 min时TS达到最大（22.40±0.61）MPa。这可能是由于热处理时间较短时，胶原蛋白与壳聚糖在较短时间的磁力搅拌作用下分子间相互作用位点增多，分子间作用力增强使得TS增加。但在热处理时间进一步延长时，搅拌容易打断部分已形成的胶原蛋白-壳聚糖交联结构，从而使得TS降低。复合膜的EAB随着热处理时间的增加而逐渐减小，这可能是由于较短的加热搅拌使得胶原蛋白与壳聚糖相互作用点增多，作用力增强，因而EAB增加。当加热搅拌时间进一步增加，搅拌容易打断部分已形成的胶原蛋白-壳聚糖交联结构，使得EAB降低。热处理时间为30 min时，EAB为（140.83±7.89）%。

热处理时间的对复合膜的WVP没有显著性变化。热处理时间对复合膜的溶解度没有显著性变化，都在30%左右。热处理时间对复合膜的透光率影响不大，都在80%以上。

因此，综合考虑各方面因素，选用热处理时间为30 min。

2.5 复合膜制备工艺优化

2.5.1 正交试验

通过单因素试验表明，胶原蛋白与壳聚糖质量比、增塑剂的种类及用量、热处理温度、热处理时间对膜的性能有显著影响。综合考虑，选出胶原蛋白与壳聚糖的质量比、甘油添加量、热处理温度、热处理时间按照
L9（34）进行正交试验设计，以TS、EAB为表观特征评分指标。正交试验结果与直观分析见表6。因素的主次顺序从主到次为：胶原蛋白与壳聚糖质量比、甘油添加量、热处理时间、热处理温度。最优工艺条件为胶原蛋白与壳聚糖质量比为6∶4、甘油添加量为20%、热处理时间为30 min、热处理温度为70 ℃。

表 6 正交试验结果与直观分析

Table 6 Results and visual analysis of orthogonal array experiments

2.5.2 验证实验

表 7 正交试验验证结果

Table 7 Results obtained from validation of optimal preparation conditions

按照正交试验筛选出的工艺条件：胶原蛋白与壳聚糖质量比6∶4、甘油添加量20%、热处理时间30 min、热处理温度70 ℃进行3 次验证实验。由表7可知，3 次验证实验的结果没有显著性差异，说明所筛选出来的工艺合理可行，稳定可靠，具有可重复性。

3 结 论

通过经乙酸法提取的鮰鱼皮胶原蛋白同壳聚糖复合成膜，其中胶原蛋白与壳聚糖质量比、增塑剂种类及浓度、热处理温度、热处理时间都对复合膜的机械性能有显著影响。经正交试验优化，在胶原蛋白与壳聚糖质量比6∶4、甘油添加量20%、热处理温度70 ℃、热处理时间30 min时所制得的复合膜机械性能最好：拉伸强度为（21.98±0.33）MPa，断裂伸长率为（127.35±3.03）%。在此基础上可望开发出一种具有广阔应用前景的新型功能膜材料。

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