血根碱清除自由基及抑制生物大分子氧化的作用

姚 雯,杨天衡,刘学波*

(西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西 杨凌 712100)

 

摘 要:目的:评价血根碱的体外抗氧化活性,为血根碱作为天然抗氧化剂的应用提供理论依据。方法:采用DPPH自由基清除法测定血根碱的体外抗氧化能力;采用Cu2+/H2O2和AAPH体系诱导牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)氧化损伤和羰基化损伤模型,研究血根碱对上述损伤的保护作用;采用TBA法分别测定血根碱对FeSO4诱导的大豆卵磷脂氧化损伤的抑制作用,及AAPH诱导的鲱鱼精DNA氧化损伤的抑制作用。结果:血根碱可有效清除DPPH自由基,且呈浓度依赖性,在100 μmol/L时清除率为85.94%;1~100 μmol/L的血根碱可显著保护Cu2+/H2O2及AAPH体系诱导的BSA损伤;10~100 μmol/L的血根碱可显著保护由Cu2+/H2O2体系诱导的BSA蛋白羰基化,当浓度为0.1~100 μmol/L
时可显著保护由AAPH诱导的BSA蛋白羰基化;血根碱浓度在6.25~100 μmol/L范围内均可显著抑制由FeSO4及AAPH诱导的大豆卵磷脂及鲱鱼精DNA的氧化损伤。结论:血根碱可有效清除自由基及保护蛋白氧化损伤和羰基化损伤,亦可显著抑制脂质及DNA氧化损伤。

关键词:血根碱;自由基;氧化损伤;羰基化;抗氧化

 

Sanguinarine Scavenges Free Radicals and Protects against Oxidative Damage of Biological Macromolecules

 

YAO Wen, YANG Tian-heng, LIU Xue-bo*

(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

 

Abstract: The purpose of this paper is to evaluate the in vitro antioxidant activity of sanguinarine (SAN). The 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of SAN was measured, and the protective effect against oxidative damage and carbohylation of bovine serum albumin (BSA) induced in Cu2+/H2O2 and  2,2-azobis(2-amidinopropane dihydrochloride) (AAPH) system was examined. The 2-thio-barbituric acid (TBA) method was applied to determine the protective effect of SAN against FeSO4-induced oxidative damage of soy lecithin and AAPH-induced oxidative damage of herring sperm DNA. The results showed that SAN effectively removed DPPH free radicals in a dose-dependent manner, with a clearance rate of 85.94% at a concentration of 100 μmol/L. Adding 1 to 100 μmol/L SAN could significantly protect BSA against oxidative damage induced by Cu2+/H2O2 and AAPH system, and adding 10 to 100 μmol/L and 0.1 to 100 μmol/L
SAN could significantly protect BSA against carbonylation damage induced by Cu2+/H2O2 and AAPH system, respectively. SAN significantly protected soy lecithin against FeSO4-induced oxidative damage and protect herring sperm DNA against AAPH-induced oxidative damage in the range of 6.25–100 μmol/L. In conclusion, SAN can effectively scavenge free radicals, inhibit oxidative protein damage and carbonylation, and suppress lipid and DNA oxidative damage.

Key words: sanguinarine; free radical; oxidative damage; carbonylation; antioxidant activity

中图分类号:TS201.4 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)09-0137-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409028

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是需氧生物体正常的代谢产物,在正常生理状态下,机体可维持ROS的动态平衡,从而对细胞及胞内信号转导和组织生长发育起到积极的作用。在应激情况下,生物体会产生过量的ROS,体内的抗氧化剂无法与之抗衡,造成机体的氧化损伤,如蛋白质氧化、脂质过氧化和DNA氧化损伤等[1],进而诱发多种疾病,如阿尔兹海默症、帕金森症[2]、亨廷顿舞蹈症和肌萎缩性脊髓侧索硬化症等[3]。为了降低过度氧化对机体造成的损伤,一些天然抗氧化剂已受到研究者的广泛关注,如VC、白藜芦醇和茶多酚等[4]。血根碱(sanguinarine,SAN)属苯菲啶型苄基异喹啉类生物碱,主要存在于罂粟科、蓝堇科和芸香科的植物中。研究表明,血根碱具有抗菌消炎、抑制多种病原菌及抗肿瘤等多种药理作用[5],而对于其抗氧化作用效果的研究鲜有报道。Zhong Ming等[6]报道博落回属的8种生物碱的抗氧化活性随着产地的变化各异,但对于血根碱的抗氧化活性未见分析。本实验从血根碱对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH)自由基的清除,以及对生物大分子氧化损伤的保护来评价血根碱的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

血根碱(纯度≥98%)、2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride,AAPH)、DPPH自由基 美国Sigma公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 西安沃尔森生物技术有限公司;鲱鱼精DNA 北京百瑞金生物科技有限公司;抗脱氧核糖核蛋白抗体 (anti-DNP)、羊抗兔抗体 (goat anti-rabbit) 美国Santa Cruz公司;2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH) 美国Amresco公司。

1.2 仪器与设备

PowerWave XS 全波长酶标仪 美国Bio-Tek公司;65-8001垂直电泳槽、ChemiDoc XRS化学发光成像系统 美国Bio-Rad公司;AUW120D万分之一天平 日本岛津 Shimadzu公司;微量移液枪 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

称取7.80 mg的DPPH溶于100 mL甲醇溶液,配制浓度为200 µmol/L的DPPH溶液,避光保存。向离心管中分别加入500 μL DPPH甲醇溶液和500 μL血根碱稀释梯度液,充分混合,避光静置30 min,记为Ai;同时将等体积甲醇溶液和血根碱稀释梯度液混合记为Aj;将等体积甲醇溶液和DPPH甲醇溶液混合记为A;甲醇溶液记为A0。在517 nm测定吸光度,每个实验重复3 次,按式(1)计算清除率。

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1.3.2 血根碱对Cu2+/H2O2及AAPH诱导的蛋白氧化损伤的保护作用

参考乔燕[7]的方法略有改动。分别用1 mmol/L的磷酸盐缓冲液(phosphat buffered saline,PBS)配制质量浓度为1 mg/mL的BSA蛋白溶液,用蒸馏水配制浓度为10 mmol/L的CuSO4溶液,用PBS配制浓度为25 mmol/L的H2O2(注意避光保存),用蒸馏水配制浓度为500 mmol/L
的AAPH溶液,37 ℃水浴下热分解2 min备用。

向离心管中加入50 μL BSA蛋白溶液、10 μL甲醇溶液和40 μL PBS混合均匀,作为空白组;实验组先加入50 μL BSA蛋白溶液、10 μL血根碱稀释梯度液,混合均匀后室温放置30 min,再分别加入CuSO4、H2O2各10 μL或20 μL AAPH,之后各加入20 μL PBS补齐反应体系;对照组将样品梯度液换为10 μL甲醇。加样完毕后混合均匀,在37 ℃水浴反应,Cu2+/H2O2和AAPH的反应时间分别为90 min和6 h。反应结束后加入25 μL十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS),95 ℃水浴5 min制备成蛋白样品。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)后,1%考马斯亮蓝R-250染色20 min[8],脱色过夜,BSA蛋白条带用Quantity One 4.6.2软件进行定量分析。每实验重复3次。

1.3.3 血根碱对Cu2+/H2O2及AAPH诱导的蛋白羰基化的保护作用

参考Dalle-Donne[9]和Levine[10]等的方法略有改动。将已制备好的Cu2+/H2O2及AAPH体系的蛋白样品经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,10 V,25 min半干转印至PVDF膜上,将该PVDF膜与20 mmol/L的DNPH-盐酸溶液避光衍生30 min,衍生完毕后依次以浓度为2 mol/L的HCl洗涤3 次,每次5 min,甲醇洗涤5 次,每次5 min,5%脱脂奶粉封闭2 h,1×TBST洗涤3 次,每次5 min,生成的
2,4-二硝基苯腙(2, 4-dinitrobenzene hydrazone,2,4-DNP)衍生物,利用抗DNP抗体4 ℃过夜孵育,次日用1×TBST洗涤后以anti-rabbit抗体孵育2.5 h,经1×TBST洗涤后利用ChemiDoc XRS化学发光成像系统检测蛋白的表达,并用Quantity one 4.6.2软件对蛋白条带进行定量分析。每实验重复3 次。

1.3.4 血根碱对FeSO4诱导的脂质过氧化的抑制作用

参照黄晓坤等[11]的方法并略加修改。用PBS配制质量浓度为2 mg/mL的大豆卵磷脂,充氮气封口,超声30 min,制备成脂质体。以250 μL脂质体、40 μL的500 μmol/L FeSO4及10 μL血根碱稀释梯度液混合记为Ai,对照组以PB代替样品记为A0,考虑到样品本身的颜色,将样品本底值记为As,加样完毕后将样品组和对照组避光37 ℃水浴1 h,用TBA法检测氧化程度。即加入700 μL三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)- HCl混合液(15 g TCA,0.375 g TBA,2.1 mL浓盐酸,依序加入100 mL双蒸水中),100 ℃水浴15 min,迅速冷却,
4 000 r/min离心10min,取上清,点入96孔板,在波长532 nm处测定吸光度。每实验重复3 次,按式(2)计算脂质过氧化抑制率。

626920.jpg (2)

1.3.5 血根碱对AAPH诱导的DNA氧化损伤的抑制作用

在AAPH热分解产生的烷氧自由基攻击下,DNA形成的裂解产物(活性羰基化合物)在酸性条件下与TBA反应后的产物硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)在532 nm波长处出现明显的吸收峰[12-13]。配制质量浓度为8 mg/mL的鲱鱼精DNA及500 μmol/L的AAPH溶液。以250 μL鲱鱼精DNA、10 μL血根碱稀释梯度液及50μL AAPH溶液混合记为Ai,对照组以PBS代替样品记为A0,将样品本底值记为As,加样完毕后将样品组和对照组避光37 ℃水浴12 h,TBA法检测DNA氧化程度,每个实验重复3 次,并按式(3)计算DNA氧化抑制率。

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1.4 数据处理

实验数据用 Microsoft Excel 2007处理,通过SPSS 16.0软件进行One-Way ANOVA分析,并采用Duncan’s多重比较,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 血根碱对DPPH自由基的清除能力

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小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。

图 1 血根碱对DPPH自由基的清除作用

Fig.1 Scavenging effect of sanguinarine on DPPH radical

由图1可知,血根碱对DPPH自由基的清除率随着浓度增加而显著升高,依次为21.45%、36.38%、58.55%、75.80%、85.94%(P<0.05),IC50值为47.09 μmol/L,即15.65 mg/L。从实验结果看,血根碱具有较强的清除DPPH自由基的能力,徐东艳[14]和严建刚[15]等报道VC清除DPPH自由基的IC50值分别为7.43 mg/L和9.1 mg/L,可见血根碱清除DPPH自由基的能力弱于VC。

2.2 血根碱对Cu2+/H2O2及AAPH诱导的蛋白氧化损伤的保护作用

Cu2+/H2O2体系产生的•OH及AAPH产生的OOH会攻击BSA氨基酸侧链,造成氨基酸残基被修饰,导致蛋白质构象发生改变[16-18]。由图2、3可知,Cu2+/H2O2和AAPH体系均可诱导BSA发生氧化损伤,加入浓度为1、10、100 μmol/L的血根碱均可显著保护这两种体系诱导的BSA蛋白氧化损伤(P<0.05),且血根碱浓度为100 μmol/L时, 对Cu2+/H2O2和AAPH诱导的BSA蛋白损伤的保护率分别达到84.17%和75.94%。

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A. BSA经聚丙烯酰胺凝胶电泳后考马斯亮蓝R-250染色结果;B. BSA蛋白条带的定量分析。下同。

图 2 血根碱对Cu2+/H2O2诱导的蛋白氧化损伤的保护作用

Fig.2 Protective effect of sanguinarine on against Cu2+/H2O2-induced BSA damage

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图 3 血根碱对AAPH诱导的蛋白氧化损伤的保护作用

Fig.3 Protective effect of sanguinarine on against AAPH-induced BSA damage

2.3 血根碱对 Cu2+/H2O2及AAPH诱导的蛋白羰基化的保护作用

羰基的生成是ROS攻击氨基酸侧链的结果,羰基化是蛋白质经自由基修饰造成氧化损伤的重要标记物[16]。蛋白质羰基化也是评价蛋白质总氧化水平的常用方法。Cu2+/H2O2和AAPH体系均可显著诱导BSA发生羰基化,由图4可知,加入0.1、1μmol/L血根碱趋于降低Cu2+/H2O2体系诱导的BSA羰基化程度(P>0.05),当血根碱浓度为10、100μmol/L时可显著降低Cu2+/H2O2体系诱导的BSA蛋白羰基化程度(P<0.05),并使BSA蛋白羰基化程度恢复至空白组水平(P>0.05)。

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图 4 血根碱对Cu2+/H2O2诱导的蛋白羰基化的保护作用

Fig.4 Inhibitory effect of sanguinarine on Cu2+/H2O2-induced protein carbonylation

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图 5 血根碱对AAPH诱导的蛋白羰基化的保护作用

Fig.5 Inhibitory effect of sanguinarine on AAPH-induced protein carbonylation

由图5可知,加入0.1、1、10、100 μmol/L血根碱均可显著保护由AAPH诱导的BSA蛋白羰基化
(P<0.05),但100 μmol/L血根碱组对AAPH诱导的BSA蛋白羰基化仍未恢复至空白组水平(P<0.05)。本实验表明,与Cu2+/H2O2体系相比,AAPH诱导的BSA蛋白羰基化程度较高。

2.4 血根碱对FeSO4诱导的脂质过氧化的抑制作用

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图 6 血根碱对FeSO4诱导的脂质过氧化的抑制作用

Fig.6 Effect of sanguinarine on FeSO4-induced soy lecithin peroxidation

卵磷脂中的多不饱和脂肪酸在金属离子催化下形成的烷过氧自由基(ROO)与脂质过氧化产物作用,发生生物膜的脂质过氧化,导致膜损伤与组织损伤[19-20]。由图6可知,随着血根碱浓度的增加,脂质过氧化的抑制率也有一定程度的提高,加入6.25、12.5、25 μmol/L的血根碱趋于增加脂质过氧化的抑制率(P>0.05),当血根碱浓度为50、100 μmol/L时可显著提高其抑制率(P<0.05)。

2.5 血根碱对AAPH诱导的DNA氧化损伤的抑制作用

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图 7 血根碱对AAPH诱导的DNA氧化损伤的抑制作用

Fig.7 Inhibitory effects of sanguinarine on to AAPH-initiated oxidative DNA damage

DNA携带机体的重要遗传信息,氧化修饰不但会造成DNA结构和功能的改变,甚至会造成基因突变等[21]。由图7可知,随着血根碱浓度的增加,DNA氧化损伤的抑制率逐步提高,不同浓度的血根碱均可显著抑制AAPH诱导的DNA氧化损伤(P<0.05),且呈浓度依赖性。

3 结 论

本实验表明,血根碱可有效清除DPPH自由基,且呈浓度依赖性,并保护Cu2+/H2O2、AAPH诱导的BSA蛋白氧化及羰基化损伤,亦可显著抑制CuSO4诱导的脂质过氧化及AAPH诱导的DNA氧化损伤,可见,血根碱可有效保护生物大分子的氧化和羰基化损伤,具有作为天然抗氧化剂的潜力。

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收稿日期:2013-11-30

作者简介:姚雯(1989—),女,硕士研究生,研究方向为营养与功能食品因子。E-mail:wendy0120@me.com

*通信作者:刘学波(1975—),男,教授,博士,研究方向为营养与功能食品因子。E-mail:xueboliu@nwsuaf.edu.cn