降解类胡萝卜素产香细菌的筛选及鉴定

蒿洪欣1，许园园1，刘 冬1，韩新宽1，牛天琦1，郭玉辉1，祈诗月1，杨清香1,2,*

（1.河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 453007；

2.河南师范大学 资源微生物与功能分子河南省高校重点实验室，河南 新乡 453007）

摘 要：本实验从常年落花的土壤中分离到了6株能降解类胡萝卜素并且产生香味的菌株。形态学观察和
16S rDNA序列分析表明，其中有3株与Bacillus subtills和Bacillus tequilensis聚在一起，2株与Bacillus methylotrophicus和Bacillus pumilus相似性最高，1株菌与Bacillus licheniformis亲缘关系最近。通过透明圈观察和OD495 nm判定培养基中的类胡萝卜素明显被降解，并且通过气相色谱-质谱法初步分析了其降解产物，产物中主要为2-庚酮、棕榈酸、邻苯二甲酸酐等物质。

关键词：类胡萝卜素；芽孢杆菌；筛选；透明圈

Screening and Identification of Bacteria That Can Produce Flavor Compounds by Degrading Carotenoids

HAO Hong-xin1, XU Yuan-yuan1, LIU Dong1, HAN Xin-kuan1, NIU Tian-qi1, GUO Yu-hui1 , QI Shi-yue1, YANG Qing-xiang1,2,*

(1. College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China; 2. Key Laboratory for Microorganisms and
Functional Molecules, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China)

Abstract: Six strains were screened and isolated for their ability to degrade carotenoids and produce flavor compounds from the soil on which perennial flowering plants are grown. Morphological observation and 16S rDNA sequence analysis showed that three of the six strains were clustered with Bacillus subtills and Bacillus tequilensis, two of them had a higher similarity with Bacillus methylotrophicus and Bacillus pumilus, and one had the closest genetic relationship with Bacillus lichniformis. Degradation of carotenoid was determined by observing the transparent circles in carotenoid agar plates and detecting the optical density (OD) at 495 nm. The degradation products were determined preliminarily by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The identified major products were 2-heptanone, palmitic acid, phthalic anhydride and other substances.

Key words: carotenoids; Bacillus sp.; screening; transparent circle

中图分类号：Q939.99 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0152-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409031

类胡萝卜素（carotenoids）是一组具有抗氧化性的脂溶性色素的总称，广泛存在于动物、植物和一些微生物中[1]。通常由8个类异戊二烯单元组成，主要指胡萝卜素和叶黄素这两大类天然色素[2]，类胡萝卜素性质不稳定，易降解，降解方式有高温氧化降解、热裂解、化学氧化降解、光氧化降解、生物氧化及酶催化氧化降解等[3]，其降解产物主要为二氢猕猴桃内酯、β-紫罗兰酮等致香物质，是重要的香料前体化合物[4]。类胡萝卜素的生物氧化降解反应，或者酶催化氧化降解反应是重要的香气物质生成途径[5]。类胡萝卜素的生物降解因其条件温和、效率高而越来越受到关注。Zorn等[6]从含有萜烯类物质较多的基质中分离到50多株具有将β-胡萝卜素降解为香味物质能力的丝状真菌和酵母菌，这50株菌能转化或合成萜烯类化合物，产生的香味物质主要为二氢猕猴桃内酯和β-紫罗兰酮；李秀红等[7]从胡萝卜中分离到了1株能降解胡萝卜素产香的真菌，产生的二氢猕猴桃内酯可赋予卷烟烟气清甜、木香和凉香，柔和烟气，为烟草中重要的致香物质，为二氢猕猴桃内酯的合成提供了一条新的途径；Dionísio等[8]从富含β-胡萝卜素的水果中筛选出能降解β-胡萝卜素的菌株，为香味物质β-紫罗兰酮的获得提供了一条廉价、高效的途径。然而目前类胡萝卜素的微生物降解产香还都在实验探究阶段，并未有大规模的生产应用，而且利用细菌降解产香的报道也较少，本实验试图从常年落花的土壤中筛选出能够降解类胡萝卜素产香的细菌，利用细菌的易培养、繁殖快、生长周期短的特点为香味物质的获得提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 土样采集

参照土样采集标准方法[9]，采集河南师范大学校园内常年落花的土壤。采样时先除去表层5 cm表土，取5～10 cm深的土壤为样品。

1.2 试剂与仪器

蛋白胨、琼脂 北京奥博星生物技术有限公司；正己烷（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；类胡萝卜素（10%） 湖北鸿运隆生物科技有限公司。

UV1800紫外-可见分光光度计、HP5890-5972气相色谱-质谱联用仪（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS） 日本岛津公司。

1.3 培养基

细菌用分离培养基：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、类胡萝卜素5 g/L、琼脂20g/L，pH 7.0～7.2。类胡萝卜素在其他培养基成分121 ℃、20 min灭菌并冷却至60 ℃左右时加入，然后倒平板待用。

液体发酵培养基：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、类胡萝卜素5 g/L，pH 7.0～7.2。类胡萝卜素在其他培养基成分121 ℃、20 min灭菌并冷却至60 ℃左右时加入。

1.4 方法

1.4.1 菌株初筛

将所取土样称取3 g溶于300 mL无菌水中，同时加入无菌的玻璃球振荡培养4 h得到菌悬液，将菌悬液梯度稀释后涂布分离培养基平板上，37 ℃恒温培养72 h。挑取能够在分离培养基上生长产生明显透明圈并且打开皿盖有香味产生的菌株，进行进一步划线纯化和复筛。

1.4.2 菌株复筛

将初筛菌株接种到相应的液体培养基中37 ℃、150 r/min培养12 h作为种子液，然后以10%的接种量接种到相应的液体发酵培养基中，装液量100 mL/250 mL锥形瓶，之后37 ℃、170 r/min恒温振荡培养60 h。由于类胡萝卜素的质量浓度和OD495 nm值之间存在正相关关系[10]，所以在接种前后测定液体培养液的OD495 nm值，通过OD495 nm值的变化情况来进一步确定该菌株能不能降解类胡萝卜素。以没加类胡萝卜素但其他成分均相同的培养液作为对照，每隔12 h测量培养液的OD495 nm值，每个菌株做3 个平行，最后取平均值，选取OD495 nm值明显下降的菌株进行分析。

1.4.3 胡萝卜汁的降解

胡萝卜汁的制备：将新鲜的胡萝卜洗净磨碎，称取20.00 g磨碎的胡萝卜泥，用无菌水稀释至100 mL待用。

将复筛所得菌的种子液按10%的接种量接种到胡萝卜汁中，装液量为100 mL/250 mL锥形瓶，37 ℃、170 r/min恒温振荡培养60 h，分别在接种前后每隔12 h测OD495 nm值的变化情况。

1.4.4 发酵液降解产物的鉴定

1.4.4.1 降解产物的抽提

根据参考文献[11]中的提取方法，取100 mL培养60 h的发酵液和2 mL的正己烷放入100 mL的分液漏斗中，反复颠倒使降解产物充分融入有机相，取有机相经0.45 μm滤膜过滤上样，由GC-MS鉴定结果和NIST库检索定性，以未加菌的培养液作为对照。

1.4.4.2 GC-MS分析条件[12]

GC条件：色谱柱为HP-5（60 m×0.25mm，0.25 μm）；载气：氦气；进样口温度：260 ℃，接口温度：250 ℃；载气流量：1 mL/min；程序升温：初温50 ℃，恒温2 min后，以4 ℃/min的速率升至230 ℃，保持20 min；进样量：1 μL；分流比：10∶1；溶剂延迟：5 min。

MS条件：EI电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；电子倍增器电压：1 200 V；质量扫描范围：30～550 u；MS谱库NIST02检索定性。

1.4.5 发酵瓶中气相产物的分析

本实验在发酵过程中能明显闻到有香味的产生，因此对发酵了60 h所产生的气体进行收集并10 倍压缩，将压缩气体进行手动注射器上样分析。

GC条件：参照参考文献[12]中的GC条件略加改动，色谱柱为HP-5（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：初始温度30 ℃，保持6 min，以每分钟10 ℃的速率升温至260 ℃，保持40 min；载气：氮气；进样口温度：290 ℃；分流比：5∶l；进样量：0.5 μL；流速：0.5 mL/min。

1.4.6 菌株的鉴定

菌株的最终鉴定采用形态观察和16S rDNA序列分析的方法。按照常规方法观察菌体在上述分离平板培养基上的菌落形态，菌体的显微形态特征研究采用革兰氏染色和显微镜观察的方法。

细菌核基因组DNA的提取采用液氮研磨和CTAB抽提法提取[13]，以所提取的DNA为模板，进行16S rDNA扩增[14]，所用引物为细菌通用引物27F（正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（反向引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增反应体系为：12.5μL Master mix、9.9μL ddH2O、0.8 μL的引物（稀释10 倍）、1 μL DNA模板。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min、52 ℃复性1 min、72 ℃延伸80s、30 个循环，72 ℃延伸10 min。5 μL PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（90 V、30 min），用凝胶成像系统观察结果并拍照。将PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

将菌株的16S rDNA序列在GenBank中进行BLAST比对，选出相似性大于98%的部分序列，以16S rDNA同源性为基础MEGA4.1软件进行系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素降解菌的筛选

从优化的细菌分离培养基上筛选出6株具有明显降解透明圈，且在培养过程中有明显香味产生的菌株，如图1所示。

A

B

C

D

A. 18号菌反面；B. 18号菌正面；C. 21号菌反面；D. 13号菌反面。

图 1 所筛选菌株在类胡萝卜素培养基平板上的菌落形态和降解透明圈

Fig.1 Colony morphology and transparent circles produced by screened strains on carotenoid agar plates

表 1 各菌株降解类胡萝卜素过程中发酵液OD495 nm的变化

Table 1 Change in OD495 nm of fermentation broth during the degradation process of carotenoids by each bacterial strain

表 2 各菌株降解胡萝卜汁的过程中发酵液OD495 nm的变化

Table 2 Change in OD495 nm of fermentation broth during the degradation process of carrot juice by each bacterial strain

将初筛得到的菌株进行分离纯化得到的单菌株接种到相应的液体发酵培养基中，按照材料和方法所述，测定培养液光密度的变化，OD495 nm有明显降低的菌株即为类胡萝卜素降解菌，共获得6 株降解菌。其结果如表1所示。将各菌株接种到胡萝卜汁液中，以未加菌株的摇瓶作为对照，测得的OD495 nm值的变化如表2所示。OD495nm值的变化可知，所筛6株菌在胡萝卜汁中的OD495nm值均有下降，说明各菌株也能降解胡萝卜中的类胡萝卜素。由表1、2可知，其中18号菌在培养60h时在培养基和胡萝卜汁中的OD495nm值分别降低了99.4%和74.7%；其次是13和21号菌株，在培养60h时，两菌株在培养基中的OD495nm值分别降低了78.5%和60%，在胡萝卜汁中的OD495nm值分别降低了72.8%和65.5%，由此可知，18号菌株的降解能力较其他菌株高，且接种前后的胡萝卜汁的颜色明显变浅且变透亮，可知接种后胡萝卜汁中的色素被降解，如图2所示。

A

B

A.接菌前；B.接菌培养60h后。

图 2 18号菌在胡萝卜汁中培养60h后引起的颜色变化

Fig.2 Color change in carrot juice degraded by strain 18 after 60 h cultivation

2.2 菌种鉴定

筛选得到的6株菌分别进行菌落形态观察、革兰氏染色[15]和菌体形态观察，并进行16S rDNA序列分析和系统进化树构建，进行鉴定。其在分离培养基平板上的菌落和显微镜观察的菌体形态特征如表3所示。部分菌株的革兰氏染色结果见图3。这6株菌均为革兰氏染色阳性，有芽孢的杆状或短杆状细菌，初步判断为芽孢杆菌属细菌。

表 3 所分离菌株的菌落和菌体形态特征

Table 3 Characteristics of colonies and cell morphology of isolated strains

A

B

A.21号菌（×1000）；B.18号菌（×1000）。

图 3 部分菌株革兰氏染色和显微形态

Fig.3 Micrographic observation of exampled strains by Gram staining

以提取出的DNA为模板，按照材料和方法所述进行PCR扩增并测序，由测序结果知各菌株的16S rDNA序列全长在1 450 bp左右。将该16S rDNA序列递交NCBI进行BLAST同源序列检索，结果发现，在亲缘关系相近的序列中，各菌株与芽孢杆菌均有98%以上的序列相似性，这与形态观察的结果一致。通过系统进化树的构建可知（图4），10、18、21号菌与Bacillus subtilis和Bacillus tequilensis聚在一起，12号菌株与Bacillus licheniformis聚在一起，13号菌与Bacillus methylotrophicus亲缘关系较近，20号菌与Bacillus pumilus聚在一起。

图 4 根据16S rDNA全长序列构建的6株类胡萝卜素
降解菌的系统进化树

Fig.4 Phylogenetic tree of the 6 strains  degrading carotenoids established based on the full-length 16S rDNA sequences

2.3 类胡萝卜素降解产物分析

对18号菌发酵60h的发酵液中主要成分进行分析，结果如图5所示。

A.对照；B.18号菌株；①.3-甲基环戊酮；②.2-庚酮。

图 5 培养60h发酵液中挥发性成分的总离子流图

Fig.5 Total ion current chromatogram of volatile components in fermentation broth after 60 h cultivation

对比图5中的A、B可以发现，18号菌株降解类胡萝卜素得到两个主要峰，经过质谱分析，其中峰①可能为3-甲基环戊酮，峰②可能为2-庚酮，该物质具有水果梨的香味。在其他菌株中还检测出来有棕榈酸和2,5-辛二酮以及邻苯二甲酸酐等物质。

A.未加菌的发酵瓶中气体；B.18号菌的发酵瓶中气体。

图 6 培养60h发酵瓶中气相部分挥发性成分总离子流图

Fig.6 Total ion current chromatogram of volatile components in part of gas in the fermentation flask

收集并压缩发酵瓶中的气相成分进行GC上样分析，结果如图6所示。18号菌的发酵瓶中的气体成分比未加菌的气体成分复杂。且加菌发酵液能明显闻到有香味产生，但是在对发酵液萃取进行GC-MS分析时并未检测到β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等典型的香味物质，只检测出来具有水果梨香味的2-庚酮，目前，发酵条件、萃取条件和GC-MS分析条件正在摸索，以期得到更有意义的实验结果。

3 讨 论

本实验筛选并获得了6株能够降解类胡萝卜素的细菌，通过形态观察和分子生物学鉴定，均为芽孢杆菌属的菌株，分属于4个种：Bacillus subtills、Bacillus licheniformis、Bacillus tequilensis和Bacillus methylotrophicus。有关芽孢杆菌降解类胡萝卜素产生香味物质的报道没有见到，Sanchez-Contreras等[16]的报道中，Bacillus sp.只有与Eotrichum sp.混合发酵才能将叶黄素降解产生β-紫罗兰酮、7,8-二氢-β-紫罗兰醇、7,8-二氢-β-紫罗兰酮、3-氢-β-紫罗兰酮等致香产物。其他有关降解类胡萝卜素产生香味物质的报道多是真菌和酵母菌，如Pastore等[17]在木瓜中分离到了1株Geotrichum sp.
能产香，Zorn等[6]和李秀红等[7] 均是分离到的真菌和酵母菌能降解类胡萝卜素产香。而本实验得的几种芽孢杆菌都可以单独发酵降解类胡萝卜素产生明显的香味，但是在这些菌株的发酵产物中没有检测到如Sanchez-Contreras和Zorn报道的典型香味物质，仅检测到了具有水果香味的2-庚酮。由于发酵过程中明显能闻到强烈的香味，因此我们试图通过GC检测发酵瓶中的气相成分来检测香味物质，虽然气相中得到了几个明显的峰，但由于含量太低而没能最终鉴定这些峰的分子和性质。有关发酵液中香味物质的检测方法本课题组还在摸索。

值得关注的是本实验中所筛选的菌株对胡萝卜汁也有明显的降解作用，并且能够产生香味，这就为进一步研究提供了新的思路，可以利用这些菌株发酵蔬菜、饲料或者烟叶，改变饲料的可口性或者改善烟叶的品质。

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