产蛋白酶兼性厌氧菌株的筛选、酶学性质及
发酵豆粕应用探究

熊 涛,唐晓星,黄 涛,李 啸

(南昌大学生命科学与食品工程学院,食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047)

 

摘 要:为筛选得到1 株或几株深层发酵豆粕效果较好的菌株,以透明圈法从自然发酵的豆豉中筛选出4 株兼性厌氧且产蛋白酶菌株,同时发现菌株B-1、B-12在厌氧条件下产蛋白酶能力好于好氧条件,对此现象较明显且平板水解圈直径较大的菌株B-1进行形态学、生理生化和分子生物学实验,鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。进一步对菌株B-1的蛋白酶酶学性质进行研究后发现,酶活力在pH 6.0~9.0的范围内能够维持一个较高的水平,酶反应和酶稳定最适条件为pH 7.0和40 ℃,加入Mn2+对酶反应的促进作用较大。将甲基营养型芽孢杆菌B-1以6%的接种量接种于豆粕固态发酵培养基中堆积(20 cm)发酵,以枯草芽孢杆菌A-12好氧浅层发酵和未发酵豆粕作为对照,发酵结束后测得豆粕中小肽含量和水解度分别高达28.37%和29.55%,比枯草芽孢杆菌固态发酵对照组分别高出了9.04%和16.07%,与未发酵豆粕相比,菌株B-1发酵后豆粕的小肽含量和水解度也分别提高了27.22%和29.13%。

关键词:蛋白酶;兼性厌氧;甲基营养型芽孢杆菌;鉴定;酶学性质;发酵豆粕

 

Screening of Protease-Producing Bacterium in Facultative Anaerobic Conditions, Studies on Its Enzymatic Characterization and Application for Fermenting Soybean Meal

 

XIONG Tao, TANG Xiao-xing, HUANG Tao, LI Xiao

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Life Sciences and Food Engineering,
Nanchang University, Nanchang 330047, China)

 

Abstract: An efficient protease–producing and facultative anaerobic bacterium B-1 was isolated from naturally fermented Douchi by transparent inhibition zone plate assay. The diameter of inhibition zones in anaerobic conditions was found to be bigger than in aerobic conditions. Based on physiological and biochemical identification and 16S rRNA sequence analysis, it was identified as Bacillus methylotrophicus. Meanwhile, this study revealed that the optimal pH and temperature for protease activity and stability from Bacillus methylotrophicus B-1 were pH 7.0 and 40 ℃, respectively. The protease activity was activated by Mn2+. In addition, Bacillus methylotrophicus B-1 and Bacillus subtilis A-12 were used at an inoculum size of 6% on raw soybean meal to study the effect of fermentation on the contents of crude protein and small peptides and hydrolysis degree. The results showed that the content of small peptides and hydrolysis degree of soybean meal fermented by Bacillus methylotrophicus B-1 were 28.37% and 29.55%, which were 9.04% and 16.07% higher than those of that fermented by Bacillus subtilis A-12, and 27.22% and 29.13% higher than those of raw soybean meal, respectively.

Key words: protease; facultative anaerobic; Bacillus methylotrophicus; identification; enzymatic properties; fermented soybean meal

中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)09-0162-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409033

豆粕是我国饲料工业中的主要植物蛋白原料,其粗蛋白质含量高达43%以上[1];但豆粕中含有的多种抗营养因子如胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、大豆抗原蛋白、尿酶、植酸等,抑制了幼龄动物对蛋白质分子的有效吸收,进而对其健康产生一定不良影响[2-4]。采用微生物发酵法生产豆粕不仅可以降解抗营养因子、分解大分子蛋白质为小肽和氨基酸等营养物质,还可以在发酵过程中对某些苦味肽基团进行移接、重排等修饰,改善其口感[5],提高豆粕品质。

如今,豆粕的发酵大多采用好氧浅层发酵方式,与深层发酵相比,不仅占地面积大、发酵生产效率低,而且只能采用浅层架式生产难以实现机械化[6-7],因而,筛选出性能良好的兼性厌氧产蛋白酶菌株用于深层发酵不仅能够节约生产成本和资源、而且能够提高发酵豆粕的生产效率。本实验以兼性厌氧、产蛋白酶为条件在自然发酵的豆豉中筛选得到1 株甲基营养型芽孢杆菌,其在国内外的报道中主要用于作物病害的防治[8-10]、生物表面活性剂[11]、产氨肽酶的研究[12]等方面,本研究中将甲基营养型芽孢杆菌应用于豆粕发酵,与现今常用的枯草芽孢杆菌好氧浅层发酵相比,发现其在豆粕堆积(20 cm)发酵过程中,小肽产量和水解度显著提高,以期为豆粕深层发酵提供优良菌种。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自然发酵豆豉。

三氯乙酸 天津市大茂化学试剂厂;福林-酚试剂 上海君瑞生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-2F型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;k05A自动定氮仪 上海晟声自动化分析仪器有限公司;雷磁Phs-25型数显pH测定仪 上海精密科学仪器有限公司;LXJ-IIB型离心机 上海安亭科学仪器厂;YQX-Ⅱ型厌氧培养箱 金坛市盛蓝仪器制造有限公司。

1.3 培养基

筛选培养基:取4.0 g干酪素于100 mL蒸馏水中,加少许NaOH溶解,115 ℃灭菌20 min;另取牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂20.0 g溶于900 mL蒸馏水中,121 ℃灭菌20 min;待冷却至45~50 ℃,在无菌操作条件下将它们混合,调节pH值为7.0。

菌种活化培养基:牛肉膏-蛋白胨固体培养基[13]。

种子培养基:牛肉膏-蛋白胨液体培养基[13]。

液体产酶培养基:玉米粉20.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、磷酸二氢钠 2.0 g/L,调节pH值为6.0。

固态发酵培养基:豆粕(30 目)50.0 g、麸皮2.0 g、葡萄糖1.0 g、自来水50 mL,121 ℃灭菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 兼性厌氧产蛋白酶菌株的平板筛选

取5 g样品于100 mL生理盐水中,振荡混合均匀,将样品悬液按照每级稀释10倍的次序制得10-1~10-7 7 个浓度,分别从10-3、10-4、10-5、10-6和10-7 5 个浓度中吸取100 μL稀释液加至筛选培养基涂布,每个稀释度做3 个重复,挑取可产生水解圈菌落,划线于筛选培养基,37 ℃分别好氧与厌氧培养48 h,测量菌落直径(d,mm)和其产生的水解圈直径(D,mm),挑选出(D/d)较大且兼性厌氧生长的菌株进行鉴定。

1.4.2 鉴定

菌落形态及个体形态观察[14]:将菌株划线接种于牛肉膏-蛋白胨培养基,观察菌落形状、质地、颜色、菌落边缘等菌落特征、并取幼龄菌株染色,在油镜下观察记录菌株的形态学特征。

生理生化实验[14-15]:参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》,对筛选得到的菌株进行接触酶实验、葡萄糖产酸产气实验、V-P反应、甲基红反应等生理生化实验。

分子生物学实验:使用细菌基因组试剂盒提取细菌基因组DNA,细菌16S rRNA基因的通用引物是正向5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向5’-ACGGCTACCTTGTTACGA-3’。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)反应体系包括:上下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μLTaq酶0.2 μL,无菌去离子水补充至50 μL。PCR扩增条件为:94 ℃、5 min;94 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、1.5 min,共30 个循环;最后72 ℃延伸10 min,4 ℃终止反应[16]。扩增产物回收后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序,将所得16S rRNA基因序列在GenBank中进行比对,使用MEGA5.2软件构建系统发育树。

1.4.3 筛选菌株的蛋白酶酶学性质研究

1.4.3.1 粗酶液的提取

准确称取发酵豆粕5.0 g,加入蒸馏水定容至100 mL,在40 ℃条件下浸提1 h,其间用玻璃棒搅拌,4 500 r/min离心15 min,取上清液待测。

1.4.3.2 蛋白酶活力的测定

采用福林-酚法[17],以每毫升发酵液在40 ℃条件下,1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸作为1 个酶活力单位(U)。

1.4.3.3 酶反应的最适pH值

将粗酶液分别用pH值为3.0~10.0的缓冲液适当稀释,40 ℃条件下与2 g/100 mL酪蛋白精确反应10 min;福林-酚法测酶活力。

1.4.3.4 酶反应的pH稳定性

将粗酶液分别用pH值为3.0~10.0的缓冲液适当稀释、40 ℃水浴保温60 min后,与2 g/100 mL酪蛋白精确反应10 min,福林-酚法测酶活力。

1.4.3.5 酶反应的最适温度

将粗酶液用pH值为7.0的磷酸缓冲液适当稀释后分别置于30、40、50、60、70 ℃的条件下,与2 g/100 mL酪蛋白精确反应10 min,福林-酚法测酶活力。

1.4.3.6 酶反应的温度稳定性

将粗酶液用pH值为7.0的磷酸缓冲液适当稀释后分别置于30、40、50、60、70 ℃的条件下精确保温10、20、30、40、50、60 min,与2 g/100 mL酪蛋白精确反应10 min,福林-酚法测酶活力。

1.4.3.7 金属离子、NH4+对酶反应的影响

将粗酶液用pH 7.0的磷酸缓冲液适当稀释,再在其中加入各种金属离子(K+、Fe2+、Gu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+)和NH4+,使其终浓度均达到0.01 mol/L,然后与2 g/100 mL酪蛋白精确反应10 min,福林-酚法测酶活力。

1.4.4 菌株发酵豆粕各项指标测定

将甲基营养型芽孢杆菌B-1以6%的接种量接入堆积高度为20 cm的豆粕中进行固态发酵,以实验室保藏的枯草芽孢杆菌A-12好氧浅层发酵及未发酵豆粕作为对照。在37 ℃条件下,甲基营养型芽孢杆菌B-1发酵豆粕96 h成熟后分别测得的粗蛋白、小肽含量和水解度。

发酵豆粕粗蛋白含量的测定[18]:采用国家标准
GB/T6432—1994《饲料中粗蛋白的测定方法》中的凯氏定氮法。

发酵豆粕小肽含量的测定[19]:采用QB/T 2653—2004《大豆肽粉》行业标准。

发酵豆粕水解度的测定[20]:采用甲醛固定法和凯氏定氮法测定发酵豆粕中游离-NH2的含量(μmol/mL)和总氮(N)含量,根据下式计算发酵豆粕的水解度。

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式中:6.25×N为1.00 mL水解液中蛋白质含量/(mg/mL);
0.33为原料大豆蛋白中-NH2的含量/(mmol/g);7.8为每克大豆蛋白质中的肽键毫摩尔数/(mmol/g)。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选结果

好氧与厌氧条件下菌株的生长情况和产蛋白酶能力如表1、2所示,菌株B-1、B-3、B-7、B-12为兼性厌氧产蛋白酶菌株,在这4株菌株中,B-7在好氧情况下平板划线D/d最大,为3.87,其次为B-1、B-3、B-12;但是在厌氧培养条件下,B-1平板划线的D/d值高达7.16,其次为B-12、B-7、B-3;其中菌株B-1、B-12在厌氧条件下产生的水解圈直径与菌落直径纸比大于好氧条件下的直径比,而菌株B-1的此现象最为明显,如图1所示,其在厌氧条件下D/d值为好氧条件下的1.9倍,猜测厌氧条件有利于菌株蛋白酶的产生,但是,厌氧培养条件下的菌落直径比好氧条件下略小。综上好氧与厌氧条件下的D/d值,选取菌株B-1为最优菌株。

表 1 产蛋白酶菌株好氧筛选

Table 1 Screening of the protease-producing strains under aerobic conditions

菌株编号

菌落直径(d)/mm

透明圈直径(D)/mm

直径比(D/d

B-1

3.5

13.2

3.77

B-2

3.0

12.1

4.03

B-3

3.8

11.7

3.08

B-4

3.3

10.6

3.21

B-5

3.0

12.9

4.30

B-6

2.5

11.7

4.68

B-7

3.1

12.0

3.87

B-8

4.2

14.3

3.40

B-9

4.9

13.5

2.76

B-10

4.0

6.1

1.53

B-11

5.3

20.0

3.77

B-12

6.0

12.5

2.08

 

表 2 产蛋白酶菌株厌氧筛选

Table 2 Screening of the protease-producing strains under anaerobic conditions

菌株编号

菌落直径(d)/mm

透明圈直径(D)/mm

直径比(D/d

B-1

3.1

22.2

7.16

B-2

B-3

3.5

10.6

3.03

B-4

B-5

B-6

B-7

3.0

11.6

3.87

B-8

B-9

B-10

B-11

B-12

5.0

25.3

5.06

 

注:—.没有抑菌圈。

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a

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b

 

图 1 菌株B-1在好氧(a)、厌氧(b)培养条件下产生的透明圈

Fig.1 Transparent inhibition zones of bacterial strain B-1 under aerobic (a) and anaerobic (b) conditions

2.2 菌株B-1的鉴定结果

2.2.1 菌株B-1的形态学特征

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a

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b

 

图 2 菌株B-1的芽孢染色(a)及革兰氏染色(b)

Fig.2 Spore staining (a) and Gram staining (b) of strain B-1

如图1所示,菌株B-1菌落呈纯白色、扁平、不透明、近似圆形;图2为菌株B-1的芽孢染色与革兰氏染色图,菌株B-1的菌体呈短杆状、芽孢中生,革兰氏染色阳性。

2.2.2 菌株B-1的生理生化特征

表 3 菌株B-1的生理生化特征

Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain B-1

生理生化实验

结果

 

生理生化实验

结果

接触酶实验

 

葡萄糖产酸

V-P测定

 

葡萄糖产气

甲基红实验

 

甘露醇产酸

运动性

 

果糖产酸

酪素水解

 

硝酸盐还原

明胶水解

 

二羟丙酮

淀粉水解

 

尿素

反应吲哚

 

10g/100mL NaCl

石蕊牛奶

 

45

H2S产生

 

55

 

注:+.有该特征或可利用该物质;-.不具有该特征或不可利用该物质。

 

菌株B-1的生理生化实验结果见表3,根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》中芽孢杆菌属的特征描述,确定菌株B-1属于芽孢杆菌属。

2.2.3 菌株B-1的分子生物学实验

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图 3 菌株B-1的16S rRNA 的PCR扩增结果

Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA gene from strain B-1

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图 4 依据16S rRNA序列构建的系统发育树

Fig.4 Phylogenetic tree of B-1 based on 16S rRNA sequences with MEGA5.2 software

菌株B-1的16S rRNA的PCR扩增结果如图3所示,通过与Marker的对照可知,16S rRNA的片段大小在1500bp左右,与预期结果相同;对菌株B-1进行
16S rRNA基因序列分析,将此序列在网站Eztaxon server 2.1(http://147.47.212.35:8080/)与标准菌株进行比对,分析结果显示与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的同源性最近,高达100%;选取与此序列同源性在99%及以上的14株菌株,使用MEGA5.2软件构建系统发育树(邻接法),见图4,菌株B-1与甲基营养型芽孢杆菌属于同一个分支,且生理生化特征与Bacillus methylotrophicus相符,结合个体、菌落形态、生理生化实验和分子生物学实验,鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。

2.3 菌株B-1的酶学性质

2.3.1 最适pH值

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图 5 酶反应的最适pH值

Fig.5 Optimal pH for the enzyme reaction

在不同pH值缓冲液中测得的酶活力如图5所示,酶活力在pH 6.0~9.0的范围内能够维持一个较高的水平,且在pH值为7.0时达到最高,为118.0 U/mL,由此可见,甲基营养型芽孢杆菌B-1在中性条件下酶活力达到最大,同时,在偏酸性和偏碱性的环境中蛋白酶活力也较高。

2.3.2 pH值稳定性

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图 6 pH值对蛋白酶稳定性的影响

Fig. 6 Effect of pH on the stability of the protease

将粗酶液用不同pH值的缓冲液稀释后,置于40℃水浴保温60 min,福林-酚法测得的剩余酶活力如图6所示,在pH 6.0~7.0范围内,酶活力保持在80%以上,但在过酸和过碱的环境下酶活力则会迅速降低,由此可见,在中性环境中此蛋白酶具有较好的稳定性。

2.3.3 最适温度

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图 7 酶反应的最适温度

Fig.7 Optimal temperature for the enzyme reaction

在不同温度的水浴条件下测得的酶活力如图7所示,从30 ℃开始,酶活力逐渐升高,到达40 ℃时,酶活力达到最大,然后开始缓慢下降,温度到达50 ℃时,酶活力开始迅速下降,70 ℃时,酶蛋白几乎完全失活。

2.3.4 蛋白酶的热稳定性

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图 8 蛋白酶的热稳定性

Fig.8 Effect of temperature on the stability of the protease

将粗酶液用pH 7.0的磷酸缓冲液稀释,置于不同的温度条件下,分别保温0、10、20、30、40、50、60 min,测得的剩余酶活力如图8所示,40 ℃保温60 min后,剩余酶活力仍然在80%以上,30、50 ℃时酶活力随保温时间的延长呈逐渐下降趋势,60 min时,剩余酶活力在30%以下;60、70 ℃时保温10 min内相对酶活力降至10%以下。

2.3.5 金属离子、NH4+对酶反应的影响

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图 9 金属离子、NH4+对酶反应的影响

Fig.9 Effect of metal and ammonium ions on the enzyme reaction

如图9所示,金属离子和NH4+对酶的催化反应均有不同程度的促进作用,其中加入Mn2+对酶反应的影响最为明显,相对酶活力为同条件下无离子添加酶活力的279.1%;另外,K+、Mg2+、NH4+的促进作用也很明显,相对酶活力均达到了200%以上,由此推测其产生的蛋白酶为金属酶。

2.4 发酵初步实验

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图 10 未发酵豆粕与菌株A-12、B-1发酵豆粕的粗蛋白含量(a)、
小肽含量(b)和水解度(c)

Fig.10 Comparison of crude protein (a) and small peptide contents (b) and hydrolysis degree (c) between unfermented soybean meal and that fermented by strain A-12 or B-1

37 ℃甲基营养型芽孢杆菌B-1发酵豆粕96 h成熟后分别测得的粗蛋白、小肽含量和水解度如图10a~c所示,其中,两株菌A-12、B-1发酵豆粕的粗蛋白含量分别为56.90%和53.39%,比起未发酵豆粕分别提高了11.04%和7.53%;枯草芽孢杆菌A-12发酵豆粕粗蛋白产量略高于甲基营养型芽孢杆菌发酵豆粕的粗蛋白含量;甲基营养型芽孢杆菌B-1发酵豆粕的小肽含量和水解度高达28.37%和29.55%,比起枯草芽孢杆菌A-12发酵豆粕分别高出了9.04%和16.07%,与未发酵豆粕相比,菌株B-1发酵后豆粕的小肽含量和水解度分别提高了27.22%和29.13%。

3 结 论

从自然发酵的豆豉中筛选出1 株兼性厌氧产蛋白酶菌株B-1,经形态学、生理生化、分子生物学实验鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,进一步对其酶学性质进行研究后发现,40 ℃、pH 7.0时酶活力和酶的稳定性最高,Mn2+对酶反应促进作用最为明显,相对酶活力为279.1%。将甲基营养型芽孢杆菌接种于豆粕进行固态发酵(堆积20 cm),测得豆粕中小肽含量和水解度分别高达28.37%和29.55%,比枯草芽孢杆菌固态发酵对照组分别高出了9.04%和16.07%,与未发酵豆粕相比,菌株B-1发酵后豆粕的小肽含量和水解度分别提高了27.22%和29.13%。研究发现,比起常用菌株枯草芽孢杆菌,甲基营养型芽孢杆菌B-1在发酵过程中能够更有效、高效地分解豆粕中的大分子蛋白质为营养物质,且因其兼性厌氧,比起严格好氧菌,甲基营养型芽孢杆菌B-1对发酵场地、设施要求较低,可节约发酵豆粕的生产成本,有利于工业化低成本高效率生产运作;但是,现阶段甲基营养型芽孢杆菌还不属于饲料添加的许可菌株,其毒理性有待进一步研究。

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收稿日期:2013-06-25

基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA100904);国家重点实验室目标导向项目(SKLF-ZZA-201303);

江西省教育厅高校科技落地计划项目(赣财教[2011]243号)

作者简介:熊涛(1970—),男,教授,博士,研究方向为益生菌发酵食品和饲料。E-mail:xiongtao0907@163.com