脱盐咸鸭蛋清促钙吸收肽的制备及脱酰胺修饰

赵宁宁，何 慧*，胡 琪，侯 焘，王 驰

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

摘 要：为使咸鸭蛋清得到高值化利用，本实验以电渗析脱盐的咸鸭蛋清为原料，以可溶性钙结合量、水解度为指标，用Alcalase 2.4 L碱性蛋白酶、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶、Protamex复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶对脱盐咸鸭蛋清进行酶解，筛选出最佳实验用酶为Protamex复合蛋白酶；进而对制备的蛋清肽进行了脱酰胺处理，分析蛋清肽的氨基酸含量。结果表明：适合Protamex复合蛋白酶的酶解条件为加酶量2×104 U/g、底物质量浓度30 g/L、温度50 ℃、pH 6.5，酶解3.5 h。在此条件下，水解度为21.97%，所得蛋清肽的可溶性钙结合量为29.22 μg/mL。再经脱酰胺修饰后，其可溶性钙结合量显著增加（P＜0.05）。氨基酸分析显示蛋清肽中含有较多与钙结合相关的氨基酸。以脱盐咸鸭蛋清为原料制备的肽具有较高的钙结合活性，脱酰胺修饰可使其钙结合能力显著提升。

关键词：脱盐咸鸭蛋清；酶解；肽；可溶性钙结合量；脱酰胺

Preparation and Deamination of Calcium Absorption-Promoting Peptides from Desalted Duck Egg White

ZHAO Ning-ning, HE Hui*, HU Qi, HOU Tao, WANG Chi

(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Abstract: To prepare high-activity peptides with calcium absorption-promoting function, desalted duck egg white after electro-dialysis was hydrolyzed by one of five enzymes (alcalase 2.4 L, neutrase 0.8 L, protamex, trypsin, and pepsin), and then deamidation and amino acid composition analysis of the peptides were conducted. The results showed that protamex was selected as the optimal enzyme when the amount of soluble calcium-binding peptide and the degree of hydrolysis (DH) were measured. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows: Protamexdosage 20 000 U/g, substrate concentration 30 g/L, temperature 50 ℃, pH 6.5, and hydrolysis time 3.5 h. Under these conditions, the DH reached 21.97% and the amount of soluble calcium-binding peptide was 29.22 μg/mL. After deamidation, the amount of soluble calcium-binding peptides was increased significantly (P ＜ 0.05). Amino acid analysis revealed that a lot of amino acids in the peptides contributed to the calcium-binding capacity. Conclusion: Desalted duck egg white can be used to produce high-activity peptides with calcium absorption-promoting functions and deamidation of duck egg white peptides can increase the amount of soluble calcium-binding peptides significantly.

Key words: desalted duck egg white; enzymatic hydrolysis; peptides; amount of soluble calcium-binding peptide; deamidation

中图分类号：TS253.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0181-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409036

咸鸭蛋蛋清主要由水和蛋白质组成，蛋白质含量约为8.8%～12%，其氨基酸组成与人体需求的接近[1]，是一种全价蛋白；此外还含有10%左右的盐。咸鸭蛋的消费群主要在东南亚和中国[2]，尤其在中国，无论是总量还是人均消费水平均为世界第一。据初步估算，每年我国有上百亿枚咸鸭蛋黄被用于制作粽子、月饼等食品，遗留下数以万吨计的咸鸭蛋蛋清因含盐量高达7%～12%，被极大地限制了应用范围[3]。

一直以来，咸鸭蛋蛋清仅有极少被用于饼干、饲料及面条等的加工制作，近年来也有人用咸蛋清生产咸蛋清粉和一些类似腐乳的产品[4]，或者将咸蛋清直接与鱼糜混合以增加鱼糜的凝胶性能[5]，但绝大部分咸蛋清还是遭到丢弃，造成了极大优质蛋白质资源的浪费。因此，对咸鸭蛋清进行有效脱盐，并使其增值具有良好的应用前景。

钙营养不足是当今全球性的健康问题，由于中国人的膳食大量摄入植物性食物，其中的草酸、磷酸和植酸等在肠道中易与摄入的钙形成不溶性盐，从而导致钙的生物利用率降低。研究表明，氨基酸、肽等能和钙形成可溶性配合物，从而阻止小肠内钙沉淀，更好地促进钙的吸收。乳制品是值得信赖的、高效的补钙食品，因为酪蛋白在消化过程中形成的酪蛋白磷酸肽[6]能与钙形成可溶性的螯合物，有利于钙的吸收。此后陆续有卵黄高磷蛋白磷酸肽[7]、大豆肽[8]、鱼骨肽[9]、虾壳肽[10]、乳清蛋白肽[11]等促钙吸收肽的研究见诸报道。以食品工业副产品为原料生产促钙吸收肽，已成为了一种趋势。本实验室也曾报道了鸡蛋蛋清肽[12]具有促钙吸收作用。然而，目前人们对咸鸭蛋蛋清酶解的研究，多数以获取较高水解度的肽为目的来制取抗氧化肽[2,13-15]。本实验以电渗析脱盐的咸鸭蛋蛋清为原料，以可溶性钙结合量为主要指标，结合水解度，筛选出较佳用酶，制备高活性促钙吸收鸭蛋清肽，并对其进行脱酰胺修饰以提升其钙结合能力，为充分利用咸鸭蛋蛋清资源，提高其附加值，开发出新的生物利用率高的补钙产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

咸鸭蛋蛋清（盐含量约为70 g/L，蛋白质含量约为105 g/L） 湖北神丹健康食品有限公司；Alcalase 2.4L碱性蛋白酶、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶、Protamex复合蛋白酶 丹麦Novozymes公司；Trypsin胰蛋白酶、Pepsin胃蛋白酶 美国Amresco公司；谷氨酰胺酶 日本天野酶制剂；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

小型实验用特种电驱动膜分离器 浙江千秋环保水处理有限公司；LGJ-12冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；PB-10 Sartorius标准型pH计 德国赛多利斯公司；TDL-5A台式低速离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司；UV-102-02WF紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；Laborota4000旋转蒸发器 德国Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 脱盐咸鸭蛋蛋清的制备

参照本实验室前期研究[16]对咸鸭蛋蛋清进行脱盐处理：咸鸭蛋蛋清→前处理除杂→稀释10 倍电渗析脱盐→超滤浓缩5 倍→冷冻干燥→鸭蛋蛋清粉。

1.3.2 促钙吸收鸭蛋蛋清肽的制备

1.3.2.1 酶解工艺

鸭蛋蛋清（为脱盐咸鸭蛋蛋清，下同）→按一定浓度加入蒸馏水→搅拌均匀，沸水浴预处理40 min→冷却至所用酶的最适温度，调至该酶的最适pH值→加酶→用0.1 mol/L NaOH维持pH值在最适条件，酶解一段时间并记录NaOH用量→沸水浴灭酶10 min→冷却，4 000 r/min离心10 min→旋转蒸发→冷冻干燥→测定可溶性钙结合量。

1.3.2.2 蛋白酶的筛选

在Alcalase 2.4 L、Neutrase 0.8 L、Protamex、Trypsin、Pepsin各种蛋白酶厂家推荐的最适反应条件（表1）下，按底物质量浓度40 g/L、酶解时间4 h、加酶量 20 000 U/g进行酶解，以可溶性钙结合量和水解度为指标，筛选最佳蛋白酶。

表 1 各种蛋白酶最适反应条件

Table 1 The optimal reaction conditions for the selected proteases

1.3.2.3 复合蛋白酶酶解鸭蛋蛋清的单因素试验

以pH值、温度、加酶量、底物质量浓度、酶解时间为单因素变量，以可溶性钙结合量为主要活性指标，水解度为辅助指标，进行单因素试验，各单因素变量水平如下：50 ℃、底物质量浓度40 g/L、加酶量2×104 U/g、酶解3 h，考察pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的影响；在底物质量浓度40 g/L、加酶量2×104 U/g、酶解3 h、pH 6.5条件下，考察温度45、50、55、60 ℃影响；在底物质量浓度 40 g/L、反应3 h、pH 6.5、50 ℃条件下，考察加酶量 5 000、10 000、15 000、20 000、25 000 U/g的影响；在50 ℃、pH 6.5，加酶量2×104 U/g，酶解反应3 h的条件下，考察底物质量浓度20、30、40、50、60 g/L的影响；在底物质量浓度40 g/L、pH 6.5、50 ℃、加酶量2×104 U/g
条件下，考察酶解时间2、3、4、5、6 h的影响。

1.3.2.4 复合蛋白酶酶解鸭蛋蛋清的正交试验

进一步对复合蛋白酶酶解工艺进行正交优化，对同一种酶来说，最适pH值和温度基本不变，固定pH值和温度，选择加酶量、底物质量浓度、酶解时间三因素为变量，设计三因素三水平正交试验。

1.3.3 鸭蛋蛋清肽的脱酰胺化

将上述鸭蛋蛋清肽配成20 g/L的溶液，于50 ℃、pH 7.0条件下添加质量分数5%谷氨酰胺酶，分别在反应时间0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h时取样，冻干后测定可溶性钙结合量。

1.3.4 鸭蛋蛋清肽氨基酸分析

参照国标GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》， 采用氨基酸自动分析仪测定鸭蛋蛋清肽的氨基酸组成。

1.3.5 可溶性钙结合量的测定

测定方法参照Sato等[17]的方法，略做改进：将
5mmol/L CaCl2和20 mmol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙沉淀，加入一定量的鸭蛋蛋清肽，37 ℃保温2 h，10 000 r/min离心15 min，取适量上清液采用邻甲酚酞络合酮比色法[18]测定可溶性钙结合量。

1.3.6 水解度的测定

Alcalase 2.4 L、Neutrase 0.8 L、Protamex、Trypsin酶解水解度（degree of hydrolysis，DH）的测定采用pH-stat法[12]，Pepsin酶解水解度的测定采用甲醛滴定法[19]。

采用pH-stat法时，式中：α为α-氨基解离度，，其中pK＝7.0，pH为酶解pH值；V为消耗NaOH的体积/mL；c为NaOH的浓度/（mol/L）；mp为底物中蛋白质质量/g；htot为每克原料蛋白中肽键数/（mmol/g），对鸭蛋清蛋白而言取11.1 mmol/g。

采用甲醛滴定法时，式中：h为酶解液中－NH2或
－COOH的含量/（mmol/g）；h0为原料蛋白中－NH2或
－COOH的含量/（mmol/g）。

1.3.7 蛋白酶活力的测定

参照国标SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》。酶活力的定义为：1 g固体酶粉（或1 mL液体酶）在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为1 个酶活力单位，以1 U/g（U/mL）表示。

2 结果与分析

2.1 5 种蛋白酶酶解效果比较

表 2 5 种蛋白酶酶解效果比较

Table 2 Comparative hydrolysis of duck egg white by diffident proteases

注：*.与Protamex相比，差异显著（P＜0.05）；**.与Protamex相比，差异极显著（P＜0.01）。

在各种蛋白酶的最适温度和最适pH值条件下酶解鸭蛋蛋清后，所得酶解液的可溶性钙结合量和水解度结果如表2所示。就酶解液的可溶性钙结合量指标而言，以Protamex酶解液最高，达到15.79 μg/mL，极显著高于其余4 种酶
（P＜0.01）；其次为Pepsin和Trypsin，在3～4 μg/mL
之间；最低的为Alcalase 2.4 L，仅有1.56 μg/mL。就水解度指标而言，Protamex为19.36%，低于Alcalase 2.4L的20.96% （P＜0.05），但极显著高于其余3种酶
（P＜0.01）。Neutrase 0.8 L酶解物的水解度达到14.24%，其余2 种酶均低于5%。作为促钙吸收肽，可溶性钙结合量是主要指标，综合考虑Protamex在可溶性钙结合量和水解度方面比其余4 种酶存在一定优势，可能是因为其余4种酶属于内切酶，而Protamex是复合酶，相比而言酶切位点更宽，释放出的钙结合位点更多。因而后续仅对Protamex酶解条件进行进一步优化。

2.2 Protamex酶解鸭蛋蛋清单因素试验

2.2.1 pH值对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图 1 pH值对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

Fig.1 Effect of pH on the enzymolysis of duck egg white

反应pH值对鸭蛋蛋清酶解效果的影响如图1所示。pH值在6.0～7.5时，对可溶性钙结合量无显著性影响（P＞0.05），在pH 6.5时其可溶性钙结合量稍高，达到26.89 μg/mL；继续增大pH值至8.0时，可溶性钙结合量显著降低（P＜0.05），仅为3.5 μg/mL。水解度则随着pH值的增加先增大后减小，在pH 6.5时达到最大为21.20%，显著高于其余4 个值（P＜0.05）。这是因为酶分子结构的稳定性受到pH值的影响，过酸过碱都会加剧酶蛋白的失活，Protamex为中性酶，在中性条件下酶活力较高。Protamex在pH 6.5时可溶性钙结合量和水解度均较高，故选取最佳pH值为6.5，这与厂家推荐的最优pH值相一致。

2.2.2 温度对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

反应温度对酶解效果的影响如图2所示。由于Protamex最适温度范围为50～60 ℃，故选取单因素温度范围为45～60 ℃。随着温度逐渐升高，可溶性钙结合量和水解度也逐渐增强，50～55 ℃达到最大，均显著高于45 ℃和60 ℃（P＜0.05），之后开始逐渐下降，这是因为酶的活性随着温度升高不断受到抑制。由于50 ℃和55 ℃对两种指标的影响均不显著（P＞0.05），考虑到节能，故选定最佳酶解温度为50 ℃。

图 2 温度对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

Fig.2 Effect of temperature on the enzymolysis of duck egg white

2.2.3 加酶量对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

图 3 加酶量对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

Fig.3 Effect of enzyme dosage on the enzymolysis of duck egg white

加酶量对酶解效果的影响如图3所示。随着酶量的增加，酶解程度不断增加，当加酶量达到2×104 U/g后，水解度仍有增加，但整体趋于平缓，差异不显著（P＞0.05），
说明反应所需的酶量接近饱和。然而，酶量的继续增加会使可溶性钙结合量显著减小（P＜0.05），说明肽链并非越短越好，过度水解会使合适的肽段降解，故宜将加酶量控制在2×104 U/g为好。

2.2.4 底物质量浓度对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

图 4 底物质量浓度对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

Fig.4 Effect of substrate concentration on the enzymolysis of duck egg white

底物质量浓度对酶解反应的影响如图4所示。随着底物质量浓度增大，水解度先是缓慢减小，当底物质量浓度达到40 g/L后，减小幅度显著增加（P＜0.05）；可溶性钙结合量则是先不断增大，当底物质量浓度为40 g/L
时，达到最大，之后随着底物质量浓度的继续增大，可溶性钙结合量显著减小（P＜0.05）。这可能是因为当底物质量浓度较低时，酶可与底物充分接触，因而水解度较高，如前分析过高的水解度并非对提升钙结合量有利；实验显示随着底物质量浓度继续增加，鸭蛋清的溶解会受到一定影响，酶解过程中很容易形成凝胶状态，从而影响酶与底物的充分接触，同时蛋清蛋白过量也造成了资源浪费，故水解度和可溶性钙结合量降低。由此可知，宜将底物质量浓度控制在40 g/L时为宜。

2.2.5 酶解时间对酶解鸭蛋蛋清蛋白的影响

图 5 酶解时间对酶解鸭蛋清蛋白的影响

Fig.5 Effect of hydrolysis time on the enzymolysis of duck egg white

酶解时间对可溶性钙结合量和水解度的影响如图5所示。在3 h之前，可溶性钙结合量显著升高（P＜0.05），之后随着时间的延长，可溶性钙结合量显著减小
（P＜0.05）后趋于不变；水解度也随时间的增加迅速升高，反应4 h后水解度基本平稳（P＞0.05）。其原因可能是随着酶解的进行，底物蛋白被不断酶切，许多钙结合点位被不断释出，故可溶性钙结合量增加，之后继续酶切会使合适的肽段降解，可溶性钙结合量反而降低；由于底物质量浓度是一定的，随着时间延长酶解达到饱和，水解度增大到一定程度后也趋于平缓。因此选择酶解时间3 h进行后续实验。

2.3 Protamex酶解鸭蛋蛋清蛋白正交试验结果

正交试验结果与方差分析如表3、4所示。就可溶性钙结合量而言，影响其大小的因素顺序依次为：B＞A＞C，其最佳酶解工艺条件为A3B1C3；影响水解度大小的顺序为：A＞B＞C，其最佳酶解工艺条件与以可溶性钙结合量为指标的条件相吻合，亦为A3B1C3。加酶量和底物质量浓度对两指标的影响达到显著性水平（P＜0.05），酶解时间的影响相对较小。综上所知，最佳酶解条件为：复合蛋白酶加酶量2×104 U/g、蛋清底物质量浓度30 g/L、温度50 ℃、pH 6.5，酶解3.5 h。在此条件下，酶解水解度为21.97 %，所得鸭蛋蛋清肽的可溶性钙结合量为29.22 μg/mL
（5.84 mg Ca/g肽）。

表 3 Protamex酶解鸭蛋蛋清蛋白正交试验方案及结果

Table 3 Orthogonal array design scheme with experimental results

表 4 方差分析

Table 4 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

注：*.差异显著（P＜0.05）。

2.4 鸭蛋蛋清肽的脱酰胺化

图 6 脱酰胺化对鸭蛋蛋清肽可溶性钙结合量的影响

Fig.6 Effects of deamination of duck egg white peptides on the amount of soluble calcium-binding peptides

用谷氨酰胺酶对肽段进行脱酰胺处理后，可以使肽段中酰胺类氨基酸（例如谷氨酰胺和天冬酰胺）侧链上的酰胺基团转变为羧基，有利于与钙离子配位，即羧基增多，配位点位增多，故钙结合能力增强。样品的可溶性钙结合量随着谷氨酰胺酶处理时间的变化曲线如图6所示，鸭蛋蛋清肽经过脱酰胺处理后，其可溶性钙结合量显著增加（P＜0.05），并且随着谷氨酰胺酶处理时间的延长而不断增加，在1.5～3.0 h变化不显著，继续延长脱酰胺时间至4 h时，其结合钙能力反而有所下降，但此时仍显著高于未脱酰胺的鸭蛋清肽（P＜0.05）。Jin Donghao等[20]研究发现脱酰胺后的大豆蛋白酶解物阻止碳酸钙结晶形成的能力增强；包小兰[8]曾报道了脱酰胺后的大豆肽其钙结合能力提升；此外，对酪蛋白进行谷氨酰胺酶脱酰胺处理后，也发现其产物结合Ca2+、Fe3+的能力增强[21]。本实验对鸭蛋蛋清肽脱酰胺处理后，旨在进一步提高其钙结合能力，本实验结果也说明鸭蛋蛋清肽中的羧基尤其是谷氨酸和天冬氨酸残基侧链上的羧基对提高钙结合能力有着重要贡献。

2.5 鸭蛋蛋清肽氨基酸分析结果

表 5 脱盐咸鸭蛋蛋清蛋白、鸭蛋蛋清肽的氨基酸组成

Table 5 Amino acid composition (g/100 g total amino acid) of desalted duck egg white and duck egg white peptides

g/100 g

注：以氨基酸总量计。

由表5可知，脱盐咸鸭蛋蛋清蛋白和鸭蛋蛋清肽的氨基酸组成相差不大，氨基酸总量均在85%左右，酸性氨基酸与碱性氨基酸的含量也基本相似。两者相比，前者的Cys、Pro、Arg高于后者，后者的Phe、Tyr、Leu和His高于前者。有研究报道[8,10,22-23]，除了磷酸化肽能与钙有效结合外，一些非磷酸化肽的酸性氨基酸羧基、碱性氨基酸侧链上的氨基氮以及His的咪唑基均是钙的结合位点，鸭蛋蛋清肽中这3 类氨基酸总量为38.59%，和大豆肽相似（37.64%[8]）。此外，Ser、Thr、Tyr、Met是目前认为主要能够被磷酸化的氨基酸[18]，其中Ser、Thr能被磷酸化的概率又高于其余两种氨基酸。鸭蛋蛋清肽中此类氨基酸总量为24.59%，显著高于大豆肽（7.75%[8]）。Lee等[24]进行体外研究发现，磷酸化后的大豆肽其钙结合能力显著增加，若对鸭蛋蛋清肽进行磷酸化修饰，其钙结合量能力有望进一步提升。

3 讨论与结论

目前对于鸡蛋蛋清酶解制肽的研究较多，而对鸭蛋蛋清酶解制肽的研究相对较少，且这些研究多以追求较高水解度为目的，因为水解度越高，得到的小肽较易吸收。例如吴晖等[19]以鲜鸭蛋清为原料制备了高水解度的鸭蛋清肽，确定了以碱性蛋白酶-胰蛋白酶组成的双酶分步水解工艺效果最佳，水解度可达26.6%；王晓玲等[1]直接以咸鸭蛋清为原料，发现木瓜蛋白酶、风味酶质量比为4∶6（加酶总量为4 500 U/g pro）时酶解液水解度达到了23.10%；以脱盐蛋清为底物，采用木瓜蛋白酶酶解获取的蛋清肽水解度也达到了23.2%[15]。本实验旨在追求较高的可溶性钙结合量，在此前提下，得出以复合蛋白酶酶解脱盐咸蛋清最佳，其水解度也达到了21.97%，提示可能促钙吸收蛋清肽的分子质量较小，这也是有利于吸收的。

由蛋清酶解制备的肽，其活性主要涉及抗氧化、降血压、抗疲劳等。对于促钙吸收肽而言，高钙结合量是其重要指标，而适当的水解度才能保证较高的钙结合率。本实验室曾对鸡蛋蛋清肽的制备研究发现[12]，单酶酶解鸡蛋蛋清时，没有一种酶能使酶解液中可溶性钙结合量和水解度两项指标同时较高，用Neutrase 0.8L和Alcalase 2.4 L双酶复合酶解鸡蛋蛋清后，所得鸡蛋蛋清肽的可溶性钙结合量为21.15 μg/mL，水解度为8.66%；而本实验发现Protamex复合蛋白酶酶解后，酶解液能兼具较高可溶性钙结合量和水解度。可能是因为对鸡蛋蛋清酶解研究时，采用的5 种酶均为内切酶，而Protamex复合蛋白酶兼具内切与外切的功能，酶切位点更宽；鸭蛋蛋清与鸡蛋蛋清虽然蛋清蛋白组成有相似性，但毕竟氨基酸组成不同。本实验采用的是脱盐咸鸭蛋蛋清，高盐含量对蛋白的组成稍有影响。此外，有报道[8]采用蛋白酶M酶解大豆蛋白，获取的大豆肽可溶性钙结合量为2.7 mg Ca/g肽，本实验获得的鸭蛋蛋清肽，其钙结合能力（5.84 mg Ca/g肽）远高于此大豆肽。

本实验以脱盐咸鸭蛋清为原料，确定了Protamex复合蛋白酶对蛋清蛋白的酶解工艺，获取了有较高钙结合能力的鸭蛋蛋清肽，可以与钙生成可溶物。最佳酶解工艺为：Protamex复合蛋白酶加酶量2×104 U/g、蛋清底物质量浓度30 g/L、温度50℃、pH 6.5、酶解3.5 h。在此条件下，酶解水解度为21.97%，所得鸭蛋蛋清肽的可溶性钙结合量为29.22 μg/mL（5.84 mg Ca /g肽）。脱酰胺化后的蛋清肽，其可溶性钙结合量显著增加，氨基酸分析结果也显示蛋清肽中有较多与钙结合相关的氨基酸。以脱盐咸鸭蛋清为原料制备的鸭蛋蛋清肽具有较高的钙结合活性。

参考文献：

[1] 王晓玲, 马美湖, 蔡朝霞. 咸蛋清蛋白酶解工艺条件的研究[J]. 食品科技, 2009, 34(12): 84-89.

[2] KAEWMANEE T, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W. Effect of NaCl on thermal aggregation of egg white proteins from duck egg[J]. Food Chemistry, 2011, 125: 706-712.

[3] 肖丹华, 林捷, 郑华. 咸蛋清的利用和研究现状[C]//科技创新与食品产业可持续发展学术研讨会暨2008年广东省食品学会年会论文集. 广东, 广州: 广东省食品学会, 2008: 51-53.

[4] 范劲松, 李斌, 夏莹, 等. 三种磷酸盐对咸蛋清豆腐质构的影响[J]. 食品科技, 2010, 35(6): 257-261.

[5] 赖燕娜, 傅亮赖, 雄伟, 等. 咸鸭蛋蛋清对罗非鱼鱼糜凝胶品质的影响[J]. 食品工业科技, 2012, 33(1): 82-87.

[6] NAITO H, KAWAKAMI A, INAMURA T. in vivo formation of phosphopeptide with calcium-binding property in the small intestinal tract of the rat fed on casein[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1972, 36: 409-415.

[7] JIANG Bo, MINE Y. Phosphopeptides derived from hen egg yolk phosvitin: effect of molecular size on the calcium-binding properties[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2001, 65: 1187-1190.

[8] 包小兰. 大豆肽与钙结合形成可溶性复合物的机制及其稳定性的研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2007.

[9] JUNG W K, KARAWITA R, HEO S J, et al. Recovery of a novel Ca-binding peptide from Alaska Pollack (Theragra chalcogramma) backbone by pepsinolytic hydrolysis[J]. Process Biochemistry, 2006, 41: 2097-2100.

[10] HUANG Guangrong, REN Lie, JIANG Jiaxin. Purification of a histidine-containing peptide with calcium binding activity from shrimp processing byproducts hydrolysate[J]. European Food Research and Technology, 2011, 232: 281-287.

[11] PAN Daodong, LU Haoqian, ZENG Xiaoqun. A newly isolated Ca binding peptide from whey protein[J]. International Journal of Food Properties, 2013, 16: 1127-1134.

[12] 韩樱. 蛋清肽-钙配合物的制备及促进钙吸收作用研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2011.

[13] 杜永盛. 酶解咸鸭蛋蛋清制取白蛋白肽的研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2006.

[14] 郑华, 林静芬, 林捷. 脱盐咸蛋清蛋白质的单因素酶解条件研究[J]. 现代食品科技, 2007, 23(9): 58-61.

[15] 李晶晶. 咸蛋清脱盐及制备抗氧化肽的研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2010.

[16] 董华伟. 咸鸭蛋清的电渗析脱盐及其对鸭蛋清理化性质的影响[D]. 武汉: 华中农业大学, 2012.

[17] SATO R, SHINDO M, GUNSHIN H, et al. Characterization of phosphopeptide derived from bovine β-casein: an inhibitor to intra-intestinal precipitation of calcium phosphate[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1991, 1077(3): 413-415.

[18] 傅启高, 雒秋江. 用邻-甲酚酞比色法测定饲料中钙含量的研究[J]. 动物营养学报, 1996, 8(3): 25-30.

[19] 吴晖, 任尧, 李晓凤. 单酶和双酶分步酶解鸭蛋清蛋白的工艺[J]. 现代食品科技, 2010, 36(11): 93-97.

[20] JIN Donghao, ZHANG Yizhen, SUZUKI Y, et al. Inhibitory effect of protein hydrolysates on calcium carbonate crystallization[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(11): 5450-5454.

[21] 李丹, 赵新淮. 酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其产物的金属离子螯合能力[J]. 食品与发酵工业, 2010, 36(11): 21-25.

[22] NARIN C, BENJAMAS C, NUALPUN S, et al. Calcium-binding peptides derived from tilapia (Oreochromis niloticus) protein hydrolysate[J]. European Food Research and Technology, 2013, 236: 57-63.

[23] 金宗濂. 保健食品的功能评价与开发[M]. 2版. 北京: 中国轻工业出版社, 2001.

[24] LEE S H, YANG J I, HONG S M, et al. Phosphorylation of peptides derived from isolated soybean protein: effects on calcium binding, solubility and influx into Caco-2 cells[J]. Biofactors, 2005, 23: 121-128.