北京棒杆菌天冬氨酸激酶G377定点突变及
酶学性质表征

朱运明，王晓飞，闵伟红*，詹冬玲，王隆洋

（小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

摘 要：采用饱和定点突变和高通量筛选技术，对北京棒杆菌天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）AK Gly377位点进行突变，并筛选获得高活力突变体G377F，分离纯化后对G377F AK酶学性质进行表征。结果表明：突变体AK最适pH值为9.0，较突变前野生型（wide type，WT）最适pH值为8.5有所提高；最适反应温度与WT一致，均为25 ℃；半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h；pH耐受性在5 h内保持其活力50%以上，与WT 3 h内酶活力保持能力相同。G377F对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性。其中，Lys的抑制作用在一定程度上被解除，当Lys和Met同时存在时对AK具有明显的激活作用。动力学研究显示：G377F AK Vmax较WT提高9.3 倍；n值为1.0明显低于WT的2.7，说明AK正协同性降低，趋向于米氏酶。

关键词：北京棒杆菌；天冬氨酸激酶；定点突变；酶学性质

Site-Directed Mutagenesis and Characterization of Aspartate Kinase G377 from Corynebacterium pekinense

ZHU Yun-ming, WANG Xiao-fei, MIN Wei-hong*, ZHAN Dong-ling, WANG Long-yang

(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering,

Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract: Aspartate kinase (AK) is the first critical enzyme in the biosynthesis pathway of vital amino acids, in which AK is strictly regulated by metabolites. In the present study, AK from Corynebacterium pekinense was mutated using site-directed mutagenesis combined with high-throughput screening and G377F with high activity was successfully constructed. Then, the purified AK from G377F was characterized. The results showed that the optimum reaction pH of G377F was 9.0, which was slightly higher than that of the wild-type strain (WT). The optimum reaction temperature of G377F was 25 ℃, which was consistent with that of WT. The half-life period of G377F increased from 2.6 h (WT) to 5.3 h. The pH tolerance of G377F maintained more than 50% of its original vitality in 5 h, which was identical to that of WT (3 h). In addition, AK from G377F had a good tolerance to metal ions and organic solvents. To some extent, the inhibition by Lys could be released and the co-presence of Lys and Met had an active effect on the G377F. Kinetic studies showed that the Vmax of AK from G377F was 10.3 times higher than that of WT. The n value was 1.0, which was significantly lower than that of WT, indicating that the positive cooperativity of AK from G377F decreased, which showed that AK from G377F tended to be a Michaelis enzyme.

Key words: Corynebacterium pekinense E31; aspartate kinase; site-directed mutagenesis; enzymatic activity

中图分类号：Q814.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0192-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409038

天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）广泛存在于植物、细菌和真菌中，是生物合成苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸的关键酶之一[1-4]。植物中大部分含有3 种单功能酶AKS（AKⅠ、AKⅡ和AKⅢ）和2种双功能酶AK-高丝氨酸脱氢酶（AKⅠ-HSDHⅠ和AKⅡ-HSDHⅡ）[5-7]。来自大肠杆菌中的AKⅠ和AKⅢ分别受苏氨酸、赖氨酸和亮氨酸的反馈抑制[8]，而来自谷氨酸棒杆菌中的AK受赖氨酸和苏氨酸协同抑制[9-10]。因此，为使代谢产物过量积累，提高AK催化活力，解除其代谢产物的抑制作用对氨基酸的合成至关重要。

谷氨酸棒杆菌中AK是α2β2四聚体结构[11-13]。α亚基包含两个结构域，即N末端的催化结构域和C末端的调控结构域，且α亚基和β亚基的C末端区域功能相同，由两个ACT区域组成（ACT1，ACT2），以βαββαβ折叠结构形式存在[14]。在每个αβ调节区中都含有两个苏氨酸分子和一个赖氨酸分子。其中，赖氨酸存在于由β亚基ACT1和
α亚基ACT2构成的位点处，其羧基通过氢键与Ile44（β）-N、Val360（α）-N、Thr361（α）-N和Thr361（α）-Oγ1相连，并与Gly359-N和Ile42-O通过两个水分子形成氢键，最终赖氨酸通过所形成的键桥水分子进一步稳定[15]。因此，Gly359位点具有稳定配体Lys与AK结合的作用，从而加强了Lys对AK的反馈抑制。我们推测，将该位点改变以期打破其与Lys间的非共价键作用，从而解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制。

由于北京棒杆菌中AK晶体结构未报道，而该菌中AK与谷氨酸棒杆菌中AK序列同源性高达99%，因此，本实验选择谷氨酸棒杆菌中AK晶体结构（3aaw，PDB）[16]为模板对北京棒杆菌中AK进行研究。通过结构分析，谷氨酸棒杆菌Gly359和Lys601氨基酸位点（图1）分别对应于北京棒杆菌中Gly377和Lys619。在北京棒杆菌AK基因与载体pET-28a实现重组的基础上，运用基因工程技术对AK基因Gly377进行饱和定点突变，探讨北京棒杆菌中AK基因序列Lys619与Gly377位点间的非共价键作用对AK活力的影响，为天冬氨酸族氨基酸基因工程菌的构建提供参考。

图中虚线是氢键；球是水分子。

图 1 谷氨酸棒杆菌中Gly359与Lys601非共价键作用图

Fig.1 The non-covalent bond interaction between Gly359 and Lys601 in Corynebacterium glutamicum

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂与培养基

大肠杆菌E. coli BL21（DE3）和北京棒杆菌 本实验室保存。

质粒pET28a-AK 本实验室构建[17]。丙烯酰胺、甲叉双丙稀酰胺、Tris、过硫酸铵、硫酸卡那霉素和
β-巯基乙醇 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；PVDF膜 中国Bio-Rad公司；PCR试剂盒、定点突变试剂盒、DpnI消化酶和质粒提取试剂盒、PCR引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；ATP 日本MYM生物技术有限公司；非变性镍柱及柱料 美国GE公司；HRP Mouse Anti-6×His 美国BD PharmingenTM公司；DNA Marker 日本TaKaRa公司；DAB显色试剂 中国Maixin_Bio公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白电泳试剂的配制参照文献[18]。

大肠杆菌LB培养基，按照文献[19]配制。

1.2 仪器与设备

UV1700紫外-可见分光光度仪 日本岛津公司；Scientz-ⅡD超声破碎仪 宁波新芝生物科技有限公司；Z36HK高速冷冻离心机 德国Hermle公司；SE260垂直电泳仪 美国Amersham Biosciences公司；Jin-x水平琼脂糖凝胶电泳槽 大连竞卖生物科技有限公司；Eppendorf AG PCR仪 德国Eppendorf公司；CL-32L高压蒸汽灭菌器 日本ALP公司；InfinitieM200酶标仪 瑞士Tecan公司；Trans-Blot SDCell蛋白印迹转膜仪 美国Bio-Rad公司；TG-16W台式微量高速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；Sartorius BSA224S分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 饱和定点突变及引物设计

根据北京棒杆菌Corynebacterium pekinense中AK基因序列设计高通量突变引物，上游引物 5’-CTTCCATGAACTCTGCGGTAACNNNTGGGGTGAGACTG-3’；下游引物5’- GCATGCAGTCTCACCCCANNNGTTACCGCAGAG-3’。下划线为突变位点。定点突变聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）以pET-28a-AK为模板，在上述引物作用下扩增。PCR反应体系：ddH2O 34 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，模板DNA 2 μL，引物各2 μL， LA Taq 0.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸10 min，循环18 次；72 ℃、20 min。PCR产物用DpnⅠ酶消化除去模板后直接转入E.coli BL21感受态细胞中，将转化成功单菌落接种至LB液体培养基中活化并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序引物如下：上游引物5’-GGAATTCCATATGGCCCTGGTCGTACAGAA-3’；下游引物5’-GGAATTCTTAGCGTCCGGTGCCTGCAT-3’。

1.3.2 AK基因验证、诱导表达、酶液制备及纯化

基因验证PCR反应体系：ddH2O 36 µL，10×PCR Buffer 5 µL，dNTP 4 µL，引物各1 µL；模板3 µL；Taq 0.25 µL。该反应以突变成功的pET-28a-AK为模板，引物为上述测序引物。扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃、40 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循环30 次；72 ℃、10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。

经测序检测AK Gly377发生突变的菌株再次活化，并将其种子菌液按照2%接种量转移到500 mL（含250 mL培养基）摇瓶中，200 r/min、37 ℃培养，待菌体浓度OD600 nm值0.6～0.8时，加异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导剂（终浓度为1 mmol/L）诱导发酵8 h后，4 ℃、8 000 r/min
离心10 min去上清液，收集菌体，pH 7.4磷酸盐缓冲液（phosphat buffered saline，PBS）重悬，PBS体积与菌体质量为7∶1。充分混匀后，冰浴超声波破碎后，4 ℃、8 000 r/min离心10 min得到上清液，过0.45 μm膜即为粗酶液。用非变性镍柱对酶液进行纯化。先后用20 mmol/L
咪唑20 mL、40 mmol/L咪唑15 mL、70 mmol/L咪唑10 mL、100 mmol/L咪唑5 mL以及200 mmol/L咪唑3 mL洗脱除去杂质蛋白质，用500 mmol/L咪唑10 mL洗脱得到纯化后AK蛋白。

1.3.3 AK酶活力测定

利用吸光光度法通过检测天冬氨酸异羟肟酸A540 nm值改变来测定天冬氨酸激酶酶活力[20-21]。200 μL反应体系中含800 mmol/L KCl、10 mmol/ L-Asp、94 mmol/L Tris-HCl
（pH 8.0）、10.4 mmol/L ATP、16 mmol/L MgSO4、10 mmol/L β-巯基乙醇、800 mmol/L NH3•H2O、10 μL酶液，在28 ℃、120 r/min条件下反应30 min；试管5 mL反应体系组成同200 μL反应体系，100 μL酶液，在26 ℃水浴条件下反应30 min，均加入等体积FeCl3终止试剂。以不加底物的反应体系A540 nm值作为对照，所测的A540 nm即为天冬氨酸异羟肟酸离子的光学密度。反应速率V定义为单位时间（1 min）内单位质量（1 mg）酶的催化能力，单位表示为U/（mg•min）。酶活力U表示为1 000×A540 nm值，纯化后AK蛋白质质量浓度用考马斯亮蓝方法进行测定。

1.3.4 SDS-PAGE和Western blotting法检测

纯化后AK蛋白采用SDS-PAGE验证；将含有目的蛋白AK的SDS-PAGE切下，15 V稳压电转1h至PVDF膜上，2%～5%脱脂奶粉封闭，经HRP Mouse Anti-6×His（用TBS按1∶2 500稀释）孵化2 h，DAB显色7～10 min。

1.3.5 AK动力学研究

动力学分析方法是在其他试剂和条件不变的前提下，底物L-天冬氨酸浓度分别为0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mmol/L，测定AK活力，每个浓度均做3 个平行，利用Origin7.5软件，以Hill方程进行非线性拟合。

1.3.6 最适反应温度及最适pH值的研究

最适反应温度：以天冬氨酸为底物，其他酶活力测定条件不变，测定不同反应温度（15、20、25、28、30、35、40、45、50 ℃）下AK活力，每组样品检测3 个平行。

最适反应pH值：温度设为最适温度，其他酶活力测定条件不变，测定不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）94 mmol/L Tris-HCl缓冲液下AK酶活力，每组样品检测3 个平行。

1.3.7 AK热稳定性和pH值耐受性研究

将AK于最适反应温度和最适pH值条件下保温，每隔1 h测定其酶活力，将0 h条件下相对酶活力定义为100%，每组3 个平行。

1.3.8 金属离子与有机溶剂对AK活力的研究

在酶反应体系考察不同浓度（0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L）的不同种类金属离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+）对AK酶活力的影响，以不添加金属离子的相对酶活力定义为100%。考察甲醇、乙醇、丙三醇、异丙醇、乙腈、正丁醇、二甲基亚砜等有机溶剂对酶活力的影响，每种溶剂体积分数为1%、5%、10%、20%，以不添加有机溶剂的相对酶活力定义为100%，以上每组均做3 个平行。

1.3.9 底物抑制剂对AK活力的影响

考察不同浓度（0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L）抑制剂（L-methionine、L-lysine、L-threonine）对AK活力的影响，以未添加底物抑制剂的相对酶活力定义为100%，每组样品3 个平行。

2 结果与分析

2.1 重组菌株的构建、SDS-PAGE及Western blotting检测结果

M. Marker；1. WT；2. G377D；3. G377F；4. G377Y；5. G377K。

图 2 AK基因PCR扩增1%琼脂糖凝胶验证结果

Fig.2 1% Agarose electrophoresis of PCR amplification products of AK gene

突变后经筛选获得12 株突变株，结合测序结果选择AK酶活力较高有代表性菌株4 株，4 株突变株AK氨基酸序列中377 位点由野生型Gly分别突变成Asp、Phe、Tyr和Lys。将上述4 种突变体重组质粒分别转化到大肠杆菌中，挑单菌落培养，提取质粒，对其双酶切和核酸电泳检测，结果如图2所示，分子质量在1 000～2 000 bp存在目的单带，这与AK基因分子质量为1 453 bp相符，表明突变体构建成功。

M. Marker；1. WT粗酶液；2. WT纯化酶液；3. G377D；

4. G377F；5. G377Y；6. G377K；7. Western blotting结果。

图 3 10% SDS-PAGE蛋白电泳图和Western blotting检测结果

Fig.3 10% SDS-PAGE and Western blotting analysis

将非变性镍柱处理得到的AK纯化酶液经SDS-PAGE蛋白电泳和Western blotting验证结果如图3所示。野生型粗酶液、野生型纯化液以及突变体纯化液在分子质量为48 kD左右均存在目的带，表明AK基因大量表达。由泳道2～6可看出，泳道2中目的条带明显比突变体目的带粗，表明突变后AK基因的表达量较野生型低。

2.2 突变体的动力学分析

表 1 WT和突变体动力学参数

Table 1 Kinetic parameters of WT and mutant strains

注：n代表AK中亚基数，AK是四聚体结构，其n值在4以内。如果n=1，说明为米氏酶；如果n不等于1，说明为别构酶；当n＞1时，表明酶具有正协同性，n值越大正协同性越高；n＜1，为酶具有负协同性；如果n值接近1，表明趋于米氏酶。

如表1所示，G377D、G377F、G377Y、G377K的Vmax分别为9.8、33.9、25.2、27.4 U/（mg•min），较野生型（wide type，WT）菌株（3.3 U/（mg•min））分别提高了2.0、9.3、6.6、7.3 倍；n值均明显低于WT，表明经突变后AK的正协同性降低。这可能是377 位点Gly由极性不带电荷分别改变为Asp极性带负电荷、Phe非极性（疏水）、Tyr极性带正电荷和Lys极性不带电荷，在一定程度上破坏了与抑制剂Lys间的非共价键作用，使亚基间聚合度降低，结构松散，导致抑制剂Lys结合位点由致密组织变得松散不稳定，不利于抑制剂的结合。突变体由别构酶趋向米氏酶，Vmax提高。本实验针对酶活力提高最大突变株G377F进行酶学性质研究。

2.3 G377F酶学性质表征

2.3.1 最适温度和最适pH值对AK活力的影响

图 4 不同pH值（a）和温度（b）对G377F AK活力的影响

Fig.4 Effects of pH (a) and temperature (b) on the activity of AK from G377F

由图4a可知，G377F最适反应pH值为9.0，较WT pH 8.5有提高。当pH值在6～9变化时，随pH值升高，G377F中AK活力呈增大趋势；当pH值大于9.0时，AK活力急剧下降。由图4b可知，G377F中AK最佳反应温度为25 ℃，与WT相同，当温度在15～25 ℃范围内升高时，G377F AK活力呈现较大升高趋势，当反应温度高于25 ℃时，G377F AK活力呈显著下降，温度升高至50 ℃时，酶活力降低80%，与WT相比G377F AK耐高温能力下降。

2.3.2 AK的热稳定性和pH值耐受性研究

图 5 WT和G377F中AK的热稳定性和pH值耐受性

Fig.5 Stability and pH tolerance of AK from WT and G377F

由图5可知，G377F中AK在最适反应温度25 ℃条件下具有较好的稳定性，其半衰期为5.3 h，比WT半衰期2.6 h高，这可能是突变体酶亚基间的聚合度加强，因而热稳定性加强。G377F中AK在最适pH 9.0条件下，其pH值耐受性在5 h内能保持其活力在50%以上，与WT 3h内酶活力保持能力相同，10 h后两者活力均下降80%左右。

2.3.3 金属离子对AK活力的影响

表 2 金属离子对WT和G377F中AK活力的影响

Table 2 Effect of metal ions on the enzyme activity of AK from WT and G377F

注：ND.未能检测到。下同。

表2为金属离子对WT和G377Y中AK活力的影响。对G377F分析可知，Na+和Mg2+对酶活力基本无激活作用（除了Mg2+在0.2 mmol/L时有一定激活作用），而是表现出一定的抑制作用。K+在低浓度时对酶有激活作用，但随着浓度的增加显示出抑制作用。Ca2+在浓度0.2～10 mmol/L时对G377F都有激活作用，而对WT却一直呈现抑制作用。当Mn2+、Cu2+和Fe3+浓度为0.2 mmol/L
时，G377F相对酶活分别为192.88%、193.07%和186.99%，而随着浓度增加表现抑制作用。Ni2+抑制作用更加明显，当浓度为5 mmol/L时，G377F检测不到酶活力。

2.3.4 有机溶剂对AK活力的影响

表 3 有机溶剂对WT和G377F中AK活力的影响

Table 3 Effect of organic solvents on the enzyme activity of AK from WT and G377F

由表3可知，所有有机溶剂对WT AK活力显示明显的抑制作用，而对G377F AK在低体积分数时均表现激活作用，随着体积分数的增加都表现出抑制作用，说明G377F对有机溶剂表现出明显的抗性。

2.3.5 底物抑制剂对AK活力的影响

表4为不同抑制剂组合对AK活力的影响，对比WT发现，低浓度（0.2 mmol/L）赖氨酸和蛋氨酸表现出对G377F激活作用，随着浓度的升高，这种积极作用转变为抑制作用。而赖氨酸＋蛋氨酸只有在高浓度（10 mmol/L）时，对AK呈现出抑制作用，其他浓度均为激活作用。除Thr＋Lys在1 mmol/L时有激活作用外，其他含有苏氨酸的抑制剂均表现出对AK的抑制作用，说明突变后主要解除了赖氨酸对AK的部分抑制，这与本研究目的相符。

表 4 底物抑制剂对WT和G377F中AK活力的影响

Table 4 Effect of substrate inhibitors on the enzyme activity of AK from WT and G377F

3 结 论

本实验对北京棒杆菌中AK基因Gly377位点进行饱和定点突变，以达到解除与抑制剂Lys间的非共价键作用并提高酶活力的目的。运用软件Primer Premier5设计突变引物，以连接了北京棒杆菌中AK基因的重组质粒pET-28a-AK为模板进行突变，通过高通量成功筛选出G377F。并对G377F AK进行纯化、10% SDS-PAGE和Western blotting验证。结果表明：突变体G377F和WT AK分子质量均为48 kD，G377F AK Vmax较WT提高了9.3 倍，且正协同性降低。酶学性质研究表明，G377F AK最适pH值为9.0，最适反应温度25 ℃；半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h；G377F pH值耐受性在5 h内保持其酶活力50%以上，与WT 3 h内酶活力保持能力相同。同时，G377F对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性，部分解除底物抑制剂Lys和Lys＋Met对AK酶活力的抑制作用。

参考文献：

[1] BLACK S, WRIGHT N G. Aspartic β-semialdehyde dehydrogenase and aspartic β-semialdehyde[J]. Journal of Biological Chemistry, 1955, 213(1): 39-50.

[2] MAS-DROUX C, CURIEN G, ROBERT-GENTHON M, et al. A novel organization of ACT domains in allosteric enzymes revealed by the crystal structure of Arabidopsis aspartate kinase[J]. Plant Cell, 2006, 18(7): 1681-1692.

[3] NÆRDAL I, NETZER R, ELLINGSEN T E, et al. Analysis and manipulation of aspartate pathway genes for L-lysine overproduction from methanol by Bacillus methanolicus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(17): 6020-6026.

[4] KUMAR D, GOMES J. Methionine production by fermentation[J]. Biotechnology Advances, 2005, 23(1): 41-61.

[5] PARIS S, VIEMON C, CURIEN G, et al. Mechanism of control of Arabidopsis thaliana aspartate kinase-homoserine dehydrogenase by threonine[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(7): 5361-5366.

[6] CHEN Zhen, RAPPERT S, SUN Jibin, et al. Integrating molecular dynamics and co-evolutionary analysis for reliable target prediction and deregulation of the allosteric inhibition of aspartokinase for amino acid production[J]. Journal of Biotechnology, 2011, 154(4): 248-254.

[7] CURIEN G, RAVANEL S, ROBERT M, et al. Identification of six novel allosteric effectors of Arabidopsis thaliana aspartate kinase-homoserine dehydrogenase isoforms physiological context sets the specificity[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280: 41178-41183.

[8] SHIIO I, MIYAJIMA R. Concerted inhibition and its reversal by end products of aspartate kinase in Brevibacterium flavum[J]. Journal of Biochemistry, 1969, 65(6): 849-859.

[9] DONG Xunyan, QUINNP J, WANG Xiaoyuan. Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production of L-threonine[J]. Biotechnology Advances, 2011, 29(1): 11-23.

[10] KALINOWSHI J, BACHMANN B, THIERBACH G, et al. Aspartokinase genes LysCα and LysCβ overlap and are adjacent to the aspartate β-semialdehyde dehydrogenase gene asd Corynebacterium glutamicum[J]. Molecular and General Genetics, 1990, 224(3): 317-324.

[11] YOSHIDA A, TOMITA T, KONO H, et al. Crystal structures of the regulatory subunit of Thr-sensitive aspartate kinase from Thermus thermophilus[J]. FEBS Journal, 2009, 276(11): 3124-3136.

[12] DUMAS R, COBESSI D, ROBIN A Y, et al. The many faces of aspartate kinases[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2012, 519(2): 186-193.

[13] YOSHIDA T, TOMITA T, KURIHARA T, et al. Strutural insight into concerted inhibition of α2β2-type aspartate kinase from Corynebacterium glutamicum[J]. Molecular Biology, 2007, 368: 521-536.

[14] MARCO-MARIN C, RAMÓN-MAIQUES S, TAVÁREZ S, et al. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli acetylglutamate kinase and aspartokinase iii probes the catalytic and substrate-binding mechanisms of these amino acid kinase family enzymes and allows three-dimensional modelling of aspartokinase[J]. Journal of Molecular Biology, 2003, 334(3): 459-476.

[15] YOSHIDA A, TOMITA T, KUZUYAMA T, et al. Mechanism of concerted inhibition of α2β2-type hetero-oligomeric aspartate kinase from Corynebacterium glutamicum[J]. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285: 27477-27486.

[16] LIU Xuying, PAVLOVSKY A G, VIOLA R E. The structural basis for allosteric inhibition of a threonine-sensitive aspartokinase[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(23): 16216-16225.

[17] 汪一名. 北京棒杆菌突变株 E31 天冬氨酸激酶基因的克隆与表达分析[D]. 吉林: 吉林农业大学, 2011.

[18] 汪家政, 范明. 蛋白质技术手册[M]. 北京: 科学出版社, 2000.

[19] 金冬雁, 黎孟枫, 侯云德, 等. 分子克隆实验指南[M].北京: 科学出版社. 2002.

[20] FOLLETTIE M T, PEOPLE O P, AGOROPOULOU C, et al. Gene structure and expression of the Corynebacterium flavum N13 ask-asd operon[J]. Journal of Bacteriology, 1993, 175(13): 4096-4103.

[21] KATO C, KURIHARA T, KOBASHI N, et al. Conversion of feedback regulation in aspartate kinase by domain exchange[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 316(3): 802-808.