枯草芽孢杆菌产细菌素发酵条件的优化

胡 敏，郝 林*，贾丽艳

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

摘 要：通过响应面法优化枯草芽孢杆菌HJD.A32产细菌素的发酵条件，得出最优发酵条件为发酵时间30 h、摇床转速147 r/min、发酵pH 5.3、发酵温度30 ℃、接种量4%、接种菌龄24 h。在优化发酵条件下经过氧化氢酶处理的细菌素效价比优化前提高了100%，优化后发酵条件下未经过氧化氢酶处理所得细菌素的效价比优化之前提高了300%。

关键词：细菌素；发酵条件；响应面法；优化

Optimizing Fermentation Conditions for Production of Bacteriocin by Bacillus subtilis HJD.A32

HU Min, HAO Lin*, JIA Li-yan

(College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Abstract: This study reports the optimization of fermentation conditions for the production of bacteriocin by Bacillus subtilis HJD.A32. using response surface methodology. The optimal fermentation conditions were determined to be fermentation in a medium at pH 5.3 at 30 ℃ for 30 h with an inoculum density of 4% and an inoculum age of 24 h while shaking at 147 r/min.
The potency of bacteriocin produced under the optimal conditions after being treated or not with catalase was raised respectively by 100% and 300% as compared to that produced under the original fermentation conditions.

Key words: bacteriocin; fermentation; response surface methodology; optimization

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0198-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409039

食醋作为历史悠久的传统调味品，其安全性早已得到大家的认同[1-2]。研究发现，食醋在常温下长期保存不易变质的主要原因除了其低pH值外，还有生产过程中某些微生物产生的能抑制其他细菌生长的抑菌物质，并确定主要的抑菌物质为细菌素[3]。枯草芽孢杆菌HJD.A32所产的细菌素就是其中之一[4-5]。该细菌素对枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌等均有抑制作用，并且有极好的酸碱及热稳定性，在食品安全方面有着良好的应用前景。

细菌代谢产生细菌素能力的大小，除了受菌株自身特性影响外，还受发酵条件如培养基、发酵温度、发酵时间等诸多因素的影响[6-12]。本实验以枯草芽孢杆菌HJD.A32为研究对象，通过响应面法优化发酵条件，从而得到最优发酵参数。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

枯草芽孢杆菌HJD.A32、枯草芽孢杆菌H108 由山西农业大学食品科学与工程学院微生物实验室提供。

活化培养基、发酵培养基、指示菌培养基、抑菌实验培养基均为牛肉膏蛋白胨培养基。

过氧化氢酶 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 抑菌实验

将发酵液4 000 r/min离心10 min取上清液，用过氧化氢酶在37 ℃水浴条件下处理2 h以排除过氧化氢的影响，采用牛津杯法[13]进行抑菌实验，考察对枯草芽孢杆菌H108的抑菌效果，同时设置未用过氧化氢酶处理组，每个样品重复3 个平板，最后取平均值。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 发酵时间对细菌素产量的影响

将活化后的菌龄为24 h的枯草芽孢杆菌HJD.A32以1%接种量接种于pH 7的发酵培养基中，在37℃、150 r/min条件下摇床培养6、12、24、36、48、60 h后，测量上清液的抑菌圈直径。

1.2.2.2 发酵pH值对细菌素产量的影响

用浓度为0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液将发酵培养基的pH值分别调至3、4、5、6、7、8、9、10，灭菌后以1%接种量接入活化后的菌龄为24 h的枯草芽孢杆菌
HJD.A32，在37 ℃、150 r/min条件下摇床培养24 h后，测量上清液的抑菌圈直径。

1.2.2.3 发酵温度对细菌素产量的影响

在pH 5的发酵培养基中，以1%接种量接入活化后的菌龄为24 h的枯草芽孢杆菌HJD.A32，分别在20、25、30、37、42 ℃条件下摇床培养（150 r/min）24 h后，测量上清液的抑菌圈直径。

1.2.2.4 接种量对细菌素产量的影响

在pH 5的发酵培养基中，以接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%接入活化后的菌龄为24 h的枯草芽孢杆菌HJD.A32，在30℃、150 r/min条件下摇床培养24 h后，测量上清液的抑菌圈直径。

1.2.2.5 接种菌龄对细菌素产量的影响

在pH 5的发酵培养基中，以4%接种量接入活化后的枯草芽孢杆菌HJD.A32，菌龄分别为12、16、20、24 h，30 ℃、150 r/min条件下摇床培养24 h，测量上清液的抑菌圈直径。

1.2.2.6 摇床转速对细菌素产量的影响

在pH 5的发酵培养基中，以4%接种量接入活化后的菌龄为24 h的枯草芽孢杆菌HJD.A32，30℃条件下摇床培养24 h，摇床转速分别设置为0、100、150、200 r/min，测量上清液的抑菌圈直径。

1.2.3 对产细菌素主要发酵条件的响应面优化

在单因素试验的基础上，通过Plackett-Burman试验确定发酵条件各因素的影响顺序，选取前3个主要影响因素设计三因素正交旋转回归试验，以细菌素发酵上清液的抑菌圈直径为响应值做响应面设计，得出最优发酵条件[14-19]。

1.2.4 细菌素效价测定

采用二倍稀释法[6]。取枯草芽孢杆菌HJD.A32发酵上清液，用灭菌的生理盐水进行2倍梯度稀释，取每个稀释梯度做抑菌实验，以能够出现抑菌圈的最高稀释度定义为一个活力单位（1AU），其倒数即为原发酵液的细菌素效价值（AU/mL）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵时间对细菌素产量的影响

由图1可知，发酵时间为6 h时，枯草芽孢杆菌HJD.A32
的生长还处于初级阶段，此时已有细菌素产生，但产生的量较少。同时发现6 h时过氧化氢酶处理组和未经过氧化氢酶处理组的抑菌结果相差不多，说明此时也还没有大量的过氧化氢产生。随着发酵时间的延长，细菌素的产量在24 h时达到峰值，此时过氧化氢酶处理组抑菌圈直径最大，而过氧化氢的产量仍在不断增长。之后，可能由于培养基中营养物质被消耗，有害代谢产物积聚，细菌繁殖速度开始下降，活菌数量越来越少，同时还伴随着细菌形态及生理性状的改变，使得细菌素的产量呈下降趋势，过氧化氢的产量则在48 h达到峰值后开始下降。

图 1 不同发酵时间下发酵液的抑菌圈直径

Fig.1 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different fermentation times

2.1.2 发酵pH值对细菌素产量的影响

图 2 不同发酵pH值下发酵液的抑菌圈直径

Fig.2 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different initial medium pH values

由图2可知，pH 5～8是枯草芽孢杆菌HJD.A32发酵产生细菌素的最适pH值范围，并且在pH 5条件下产细菌素最多。除此之外，过酸和过碱的条件都会抑制细菌的生长，甚至可能由于蛋白质发生变质而导致细菌死亡。过酸和过碱的条件同时还会抑制过氧化氢的产生，并且在最适pH值范围内产生的过氧化氢，可能由于极碱的环境而分解，因此在极酸和极碱条件下的抑菌圈直径均为0。

2.1.3 发酵温度对细菌素产量的影响

由图3可知，发酵温度为20 ℃时枯草芽孢杆菌
HJD.A32可能还处于休眠状态，因此没有细菌素及过氧化氢的产生，也就不会出现抑菌圈。随着温度的升高，菌株恢复活力，开始生长繁殖同时产生细菌素及过氧化氢。直到发酵温度达到30 ℃时，过氧化氢酶处理组抑菌圈直径达到最大，说明此条件下产细菌素最多。温度继续升高，细菌的生长繁殖反而受到抑制，高温时甚至会导致细菌的死亡，因此细菌素的产量开始降低。但由于过氧化氢的热稳定性较高，因此在这一低温范围内，过氧化氢对抑菌圈直径的影响较为平稳。

图 3 不同发酵温度下发酵液的抑菌圈直径

Fig.3 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different fermentation temperatures

2.1.4 接种量对细菌素产量的影响

图 4 不同接种量下发酵液的抑菌圈直径

Fig.4 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different inoculum amounts

由图4可知，随着接种量的提高，细菌素产量也逐渐变大。当接种量达到4%时，细菌素的产量已经很理想，到5%时，细菌素的产量仍在增加，但是增加的幅度已经有所降低。其中，过氧化氢的产量则随着接种量的增加而有所减少。综合生产成本等各项因素，选取4%的接种量为最佳接种量。

2.1.5 不同接种菌龄对细菌素产量的影响

图 5 不同接种菌龄下发酵液的抑菌圈直径

Fig.5 The diameter of inhibition zone of fermentation liquor from different inoculation cell ages

由图5可知，随着接种菌龄的提高，细菌素产量也逐渐变大，最终在接种菌龄为24 h时达到最大。之后，细菌素产量开始下降。在这一过程中，一直有过氧化氢产生，但其产生规律不是很明显。

2.1.6 不同摇床转速对细菌素产量的影响

图 6 不同摇床转速下发酵液的抑菌圈直径

Fig.6 Diameter of inhibition zone of Bacillus subtilis H108 when exposed to fermentation liquors from different rotation speeds

由图6可知，相对静置发酵而言，摇床发酵会增加细菌素的产量。在摇床发酵过程中，发酵液随着摇床的振荡而增加了溶氧量，这样既有利于菌株的生长繁殖也促进了细菌素的产生。细菌素的产量也会随着摇床转速的提高而增加，转速提高到150r/min时，细菌素的产量达到最大。如果继续提高转速，溶氧量反而会因为振荡过快而减少，细菌素也会因此而适度降低[12]。同时，过氧化氢的产量呈现出与细菌素产量相同的趋势。

2.2 产细菌素主要发酵条件的优化

2.2.1 Plackett-Burman试验及极差分析

表 1 二水平试验及极差分析结果

Table 1 Two-level Plackett-Burman experimental design and range analysis

由表1极差分析结果得出，试验因素对抑菌圈直径大小即细菌素产量的影响顺序依次为：发酵时间＞摇床转速＞发酵pH值＞发酵温度＞接种菌龄＞接种量。因此，将发酵温度、接种菌龄及接种量分别固定在各自的单因素最佳水平上，即30 ℃、24 h、4%，再通过响应面法来着重考察发酵时间、摇床转速及发酵pH值3 个主要因素对抑菌圈直径大小即细菌素产量的影响。

2.2.2 中心组合试验设计及其结果

根据中心组合试验设计原理设计响应面分析试验[15]。试验选择15 个试验点，以发酵时间、转速、pH值为自变量，各自选取高（1）、中（0）、低（－1）3 个水平，抑菌圈直径为响应值，做响应面回归分析，得出枯草芽孢杆菌HJD.A32产细菌素的最优发酵条件。

表2是中心组合试验设计方案及结果。试验点分为两类：第一类是自变量取值由3 个因素构成的三维顶点，称为析因点，共12 个；第二类是区域的中心点，称为零点，此处试验重复3 次以估计实验误差，如表3所示。

表 2 中心组合试验设计方案及结果

Table 2 Experimental design matrix and results for central composite design

各试验因素对响应值（Y）的影响可用下列函数表示：Y=23.473 3＋1.581 25X1－0.683 75X2＋1.79X3－2.931 67X12－1.866 67X22－2.869 17X32－1.21X1X2＋2.227 5X1X3－0.637 5X2X3。

表 3 回归方程方差分析表

Table 3 Analysis of variance for the regression equation

如表3所示，P回归＜0.01，表明回归方程显著；
P失拟＞0.05，表明失拟项不显著，即回归方程拟合显著；R2＝0.944 3，可知此模型可以解释94.43%的抑菌圈直径的原因。

综上所述，试验所选模型高度显著、拟合度高、误差小，可用来对枯草芽孢杆菌HJD.A32产细菌素的发酵条件进行预测和分析。

2.2.3 响应面分析及细菌素发酵条件的优化

图 7 当发酵pH值处于中心水平时发酵时间和摇床转速对抑菌圈
直径影响的等高线图和响应曲面图

Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of fermentation time and rotation speed on diameter of inhibition zone

由图7a可知，发酵时间约在（－1，0.4），即（12，28.8）h范围内，转速约在（－1，－0.3），即（100，135）r/min范围内，二者存在显著增效作用；而发酵时间约在（0.4，1.0），即（28.8，36）h范围内，转速约在（－0.3，1.0），即（135，200）r/min范围内，抑菌圈直径反而随着二者的增长呈现下降趋势。由图7b可知，最大的抑菌圈直径约为21 mm。

图 8 当发酵时间处于中心水平时，摇床转速和发酵pH值对抑菌圈
直径影响的等值线图和响应曲面图

Fig.8 Response surface and contour plots showing the effect of rotation speed and initial medium pH on diameter of inhibition zone

由图8a可知，摇床转速约在（－1，－0.25），即（100，137.5）r/min范围内，发酵pH值约在（－1，0.3），即（4.5，5.15）范围内，二者存在显著增效作用；而摇床转速约在（－0.25，1.0），即（137.5，200）r/min
范围内，发酵pH值约在（0.3，1.0），即（5.15，5.5）范围内，抑菌圈直径反而随着二者的增长呈现下降趋势。由图8b可知，最大的抑菌圈直径约为23 mm。

图 9 当摇床转速处于中心水平时，发酵时间和发酵pH值对抑菌圈
直径影响的等高线图和响应曲面图

Fig.9 Response surface and contour plots showing the effect of fermentation time and initial medium pH on diameter of inhibition zone

由图9a可知，发酵时间约在（－1，0.5），即（12，30）h范围内，发酵pH值约在（－1，0.5），即（4.5，5.25）范围内，二者存在显著增效作用；而发酵时间约在（0.5，1.0），即（30，36）h范围内，发酵pH值约在（0.5，1.0），即（5.25，5.5）范围内，抑菌圈直径反而随着二者的增长呈现下降趋势。由图9b可知，最大的抑菌圈直径约为20 mm。

为进一步求得枯草芽孢杆菌HJD.A32发酵条件的最优组合，对前面所得回归方程求一阶偏导得：X1＝0.471 43，
X2＝－0.055 20，X3＝0.501 06，将这3 个值带入回归方程，解得预测的抑菌圈直径为24.704 9 mm。并求得最佳理论值为：发酵时间30 h、摇床转速147 r/min、发酵pH 5.3。

为验证预测结果，用上述最优发酵条件做3 个平行实验，平均抑菌圈直径为24.43 mm，与预测值之间的拟合度良好，证实此方程有效可靠。

2.3 细菌素效价的测定

通过二倍稀释法测定得出优化发酵条件下过氧化氢酶处理组细菌素效价为20 AU/mL，较优化之前原来经过氧化氢酶处理所得细菌素效价10 AU/mL提高了100%，未经过氧化氢酶处理组为1 280 AU/mL，较优化之前发酵条件下未经过氧化氢酶处理所得细菌素效价320 AU/mL提高了300%。

3 结 论

本实验得出枯草芽孢杆菌HJD.A32产细菌素的最优发酵条件为发酵时间30 h、摇床转速147 r/min、发酵pH 5.3、发酵温度30 ℃、接种量4%、接种菌龄24 h。在优化发酵条件下经过氧化氢酶处理的细菌素效价比优化前提高了100%，优化后发酵条件下未经过氧化氢酶处理所得细菌素的效价比优化之前提高了300%。

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