杏鲍菇污染菌的分离、鉴定及其特性

姚璐晔，沈金波，戴 璐，裴丹丹，孙丹凤，冀 宏

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

摘 要：从夏季被细菌污染的杏鲍菇上分离纯化得到2株病害菌（CTE722-B、CTE722-C），结合显微结构和生理生化实验结果，以及对它们16S rDNA序列的分析确定这两株菌的系统发育地位；通过抑菌圈实验考察几种工厂常用消毒剂对病害菌的抑菌影响。结果表明：菌株CTE722-B鉴定为恶臭假单胞菌属（Pseudomonas putida），CTE722-C为边缘假单胞菌属（Pseudomonas marginalis）。消毒剂菇保、甲酚皂、苯扎溴铵消毒液在短时间内对这两种细菌都有较好的抑菌效果；但因其具有挥发性，故防治效果不理想。从污染菇体分离得到的2株病害菌CTE722-B和CTE722-C被鉴定为假单胞菌属，因常用消毒剂只在短时间内对其有抑菌性，防治效果较差。

关键词：杏鲍菇；病害菌；假单胞菌；特性

Isolation, Identification and Characterization of Contaminant Bacteria from Pleurotus eryngii

YAO Lu-ye, SHEN Jin-bo, DAI Lu, PEI Dan-dan, SUN Dan-feng, JI Hong

(School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Abstract: This study aimed to identify and characterize the pathogenic bacteria which caused pollution in Pleurotus eryngii. Two strains named CTE722-B and CTE722-C were isolated from Pleurotus eryngii polluted in summer collected from a mushroom factory. According to their microstructure, physiological, biochemical properties and 16S rDNA sequences, the phylogenetic positions of the two strains were defined. By measuring the diameter of inhibition zone, the efficacy of sanitizers commonly used in the food industry against them was investigated. The results showed that CTE722-B and CTE722-C were identified as Pseudomonas putida and Pseudomonas marginais, respectively. Although the growth of two strains was restrained within a short time after adding dichloroisocyanuric acid sodium salt, cresol soap or benzalkonium bromide into the medium, the antibacterial efficacy of these sanitizers was poor due to the high volatility.

Key words: Pleurotus eryngii; pathogenic bacteria; Pseudomonas; characteristics

中图分类号：Q936 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0213-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409042

随着食用菌周年生产、多品种栽培的实现及栽培规模的不断扩大，食用菌病原病害的发生亦日趋严重。我国每年由病害菌造成的损失一般在10%以上，严重的地方可达90%[1]。食用菌的病原病害是指食用菌由于受到其他有害微生物寄生而引起的病害，也称为侵染性病害。引起食用菌病害的微生物称为病原菌，主要以细菌为主，包括拖拉氏假单胞菌（Pseudomonas tolasii）[2]、pv.agaricicola[3]、产碱假单胞菌（P. alcaligenes）[4]、荧光假单胞菌（P. fluorescens）[5]、洋葱假单胞菌
（P. cepaica）[6]和蘑菇假单胞菌（P. agarici）[7]。我国研究者对部分食用菌的细菌性病害也有深入研究，如关于半裸镰刀菌（Fusarium semitectum）的报道，该菌侵染蘑菇子实体后，一般表现为生长发育受阻，严重的长大会变成僵菇或萎缩菇[8]。但这些研究都因缺乏后续的研究，尚未提出可靠有行的防治方法；而在实际生产中依然只能根据以往的经验总结出防治措施，造成理论研究与实际生产之间的脱节。

本研究以昆山一家杏鲍菇生产厂多发于夏季的细菌污染菇为样本，对其进行分离纯化培养，并依据菌落特征、生理生化实验及分子生物学手段对分离得到的病原菌进行种属的鉴定，并研究了常用消毒剂对其的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与试剂

杏鲍菇 昆山振兴食用菌有限公司提供。

牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：牛肉膏3、NaCl 5、蛋白胨10，pH 7.2～7.4。

菇保（二氯异尿酸钠产品）、甲酚皂、苯扎溴铵消毒液及高锰酸钾 昆山振兴食用菌有限公司。

1.2 仪器与设备

M124A电子天平 伯拉莫贝林（上海）精密仪器有限公司；FE20便携式（数显）pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；CJ-2S超净工作台 天津泰斯特仪器有限公司；ZQWY-200G振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；PQX-280A-22HM人工气候箱 宁波莱福科技有限公司；Centrifuge 5418R高速冷冻离心机、移液枪 德国Eppendorf公司；DYY-6C电泳仪 北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 病害菌的分离纯化

取10 g病态杏鲍菇的部分组织加入90 mL无菌生理盐水，振荡20 min，稀释，取0.2 mL稀释液涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30 ℃培养24 h，挑取一环单菌落，保存在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上备用。

1.3.2 病害菌的生理生化鉴定

对经分离纯化得到的菌株进行显微结构、染色观察及相关生理生化鉴定[9-13]。

1.3.3 病害菌的分子生物学鉴定

提取菌株的16S rDNA，使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（No. D310），进行PCR扩增目的片段。反应条件具体为：94 ℃、5 min ；94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min，30 次循环；72 ℃、5 min 。反应结束，取5 μL反应液进行3%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。送于上海宝生物公司进行测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对。选取同源性比较高的典型菌株的16S rDNA基因序列作为参比对象，用CLUSTAL X软件进行多序列比对并计算目标菌株与参比菌株之间的序列相似性[14-15]，采用邻位相接法（Neighbor-Joining）[16-17]，应用MEGA 4.0软件构建目标菌株与参比菌株之间的系统进化树[17]。

1.3.4 消毒剂抑菌效果实验

取0.2 mL菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，用无菌镊子将含消毒剂（菇保 0.2 g/mL、甲酚皂 10%、苯扎溴铵消毒液 0.071 mL/mL）的滤纸片（滤纸片直径10 mm）置于平板上，30 ℃培养24 h，用卡尺测量抑菌圈大小。以所测抑菌圈的平均直径（mm）来表示药剂对细菌的抑菌力。抑菌效果用下式[18]表示。

抑菌效果/% ＝ ×100

药剂抑菌圈直径

最大抑菌圈直径

在实际生产中，每天都会使用消毒剂对操作空间、工人等进行消毒，但仍出现了细菌污染现象。对此实验将消毒剂敞开放置不同时间之后，考察其抑菌效力。具体过程如下：分别将消毒剂敞口放置0.5、1、1.5、2 h后，用无菌镊子将含放置不同时间的消毒剂的滤纸片置于事先涂布的平板上，30 ℃培养24 h，用卡尺测量抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 污染杏鲍菇样本的性状

A

B

图 1 菌丝包（A）和菇体污染样本（B）

Fig.1 Polluted mycelia (A) and fruit bodies (B) of Pleurotus eryngii

如图1所示，污染杏鲍菇样本在菌丝生长阶段，在料袋上出现零星的黄色水珠，黏度不大，这一现象导致菌丝长满袋的时间延长5～7 d；且这现象一般出现在袋口附近，缓慢向下蔓延至整个料包的1/4为止。出现这种现象的料包在菌丝长满之后进入出菇环节，经过正常的消毒环节后，长出子实体，但随着子实体的增大，菇体会出现大量黄色黏稠状水珠，随着培养时间的延长，被污染的菇体最终会腐烂，而与之接触的健康菇体也会被感染，出现相同的症状。

在菌丝生长阶段，若在无菌条件下去除黄色水珠，会大幅度降低后期菇体的污染情况以及推迟出现黄色黏稠液体的时间。因此断定，菌丝生长阶段出现的黄色水珠与后期在子实体上的黄色液体为同一菌株的胞外分泌物。

2.2 污染病害菌的分离

图 2 平板培养的两种菌株

Fig.2 The two strains cultured on plates

分别挑取菌丝料包上的水珠和污染菇体，进行涂布培养。如图2所示，两个样本的培养结果类似，均出现了两种细菌，证实这一污染现象是由两种微生物引起，分别命名为CTE722-B和CTE722-C；只是两者比例有差异，前者CTE722-B较多，CTE722-C较少，后者则反之。在培养基培养24 h，CTE722-B为半透明、淡黄色的圆形菌落，表面隆起，边缘略粗糙；CTE722-C为半透明、乳白色的圆形菌落，边缘整齐光滑；CTE722-B的菌落直径较CTE722-C的大。

2.3 病害菌的个体形态特征

A

B

图 3 CTE722-B（A）和CTE722-C（B）的革兰氏染色结果（×1 000）

Fig.3 Gram staining of CTE722-B (A) and CTE722-C (B)(×1 000)

通过普通光学显微镜对病害菌的菌体形态进行观察，结果如图3所示，CTE722-B为杆菌，不呈螺旋形，不产芽孢，细胞以单个排列，革兰氏染色阴性；CTE722-C为短杆菌，不产芽孢，细胞单个排列，革兰氏染色阴性。

2.4 病害菌的生理生化实验

2.4.1 菌株CTE722-B的生理生化特征

表 1 菌株CTE722-B与假单胞菌属部分菌株的生理生化特征

Table 1 Physiological properties of strain CTE722-B and some species of the genus Pseudomonas

注：＋.反应为阳性；－.反应为阴性；/.没有数据报道。

由表1可知，病害菌CTE722-B能够氧化利用葡萄糖产酸，不能发酵乙醇产酸，接触酶和氧化酶反应均为阳性，兼性厌氧。结合细胞形态、革兰氏染色等结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[11-12]，初步判断病害菌CTE722-C属于假单胞菌属（Pseudomonas）的细菌。参照上述细菌分类鉴定手册对假单胞菌的鉴定方法，进行了其他生理生化实验，并和Pseudomonas的细菌进行比较。病害菌CTE722-B生理生化实验结果和恶臭假单胞菌（P. putida）基本一致，结合细胞形态、革兰氏染色等结果，初步判断病害菌CTE722-B 是一株恶臭假单胞菌（P. putida）。

2.4.2 菌株CTE722-C的生理生化特征

表 2 菌株CTE722-C与假单胞菌属部分菌株的生理生化特征

Table 2 Physiological properties of strain CTE722-C and some species of the genus Pseudomonas

注：＋.反应为阳性；－.反应为阴性； /.没有数据报道。

由表2可知，病害菌CTE722-C能够氧化利用葡萄糖产酸，不能发酵乙醇产酸，接触酶和氧化酶反应均为阳性，兼性厌氧。结合细胞形态、革兰氏染色等结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[11-12]，初步判断病害菌CTE722-C属于假单胞菌属（Pseudomonas）的细菌。参照上述细菌分类鉴定手册对假单胞菌的鉴定方法，进行了其他生理生化实验，并和Pseudomonas的细菌进行比较。

从表2中可以看出，病害菌CTE722-C生理生化实验结果和边缘假单胞菌（P. marginalis）基本一致，结合细胞形态、革兰氏染色等结果，初步判断病害菌CTE722-C 是1株边缘假单胞菌（P. marginalis）。

2.5 16S rDNA序列分析

M. DNA Marker；1. CTE722-B；2. CTE722-C。

图 4 菌株CTE722-B和CTE722-C的16S rDNA电泳图

Fig.4 Electrophoresis patterns of 16S rDNA products from strains CTE722-B and CTE722-C

如图4所示， 通过琼脂糖凝胶电泳分离后，得到PCR产物，切胶回收片段进行DNA测序。将菌株CTE722-B的16S rDNA序列与GenBank数据库中的细菌16S rDNA序列进行BLAST同源性比对，结果发现CTE722-B的16S rDNA序列与数据库中Pseudomonas属细菌的
16S rDNA序列自然聚类。在16 个最相近的系列中（同源性99%～100%），假单胞菌（Pseudomonas）占12 个，其余4 个为未鉴定细菌。同理，将菌株CTE722-C的16S rDNA序列与相关序列进行同源性比对，同样有16 个最相近的序列（同源性99%～100%），假单胞菌（Pseudomonas）占15 个，其余1 个为未鉴定细菌。选取合适的序列与菌株CTE722-B、CTE722-C用MEGA4.0软件构建系统发育树，结果如图5所示。CTE722-B与
P. putida（登记号：AB680572）聚为一群，CTE722-C与P. marginais（登记号：JQ438826）聚为一群，再次表明CTE722-B属于P. putida，CTE722-C属于P. marginais。

图 5 基于16S rDNA的菌株CTE722-B和CTE722-C的系统发育树

Fig.5 Phylogenetic tree of strains CTE722-B and CTE722-C based on their 16S rDNA sequences

2.6 不同消毒剂对病害菌的抑菌效果

如表3所示，几种常用的消毒剂中，高锰酸钾对菌株CTE722-B、CTE722-C无抑菌作用，其余3种消毒剂对病害菌有抑菌效果，菇保效果最佳。考察放置一段时间后消毒剂的抑菌效力，结果如图6～8所示。随着放置时间的延长3 种消毒剂对病原菌的抑菌效果逐步降低；在放置的2 h内，3 种消毒剂的抑菌效果都出现了显著下降；其中甲酚皂和苯扎溴铵消毒液在放置2 h后，抑菌效果仅为10%左右，几乎没有抑菌作用。0.2 g/mL的菇宝溶液对病原菌有显著的抑菌效果，虽然放置时间延长会导致抑菌效果下降，但在2 h仍能保持30%的抑菌效果，这一特性对于工厂消毒是有利的。

表 3 3 种消毒剂平板抑菌效果

Table 3 Bacteriostatic effects of three sanitizers

图 6 菇保不同放置时间对抑菌效力的影响

Fig.6 Effect of air-exposure time of dichloroisocyanuric acid sodium salt before use on bacteriostasis

图 7 甲酚皂不同放置时间对抑菌效力的影响

Fig.7 Effect of air-exposure time of cresol soap before use on bacteriostasis

图 8 苯扎溴铵消毒液不同放置时间对抑菌效力的影响

Fig.8 Effect of air-exposure time of benzalkonium bromide before use on bacteriostasis

3 结 论

本实验的研究对象为引起杏鲍菇生产厂（昆山正兴食用菌有限公司）夏季常见污染现象的病害菌。通过分离纯化得到两株病害菌（CTE722-B、CTE722-C）；根据菌体形态特征、培养特征、生理生化特征和
16S rDNA序列分析结果以及系统发育学特征，根据多相分类原则，可将病害菌CTE722-B鉴定为恶臭假单胞菌种（P. putida）的菌株，CTE722-C为边缘假单胞菌种
（P. marginalis）。

考察该工厂常用的消毒剂，菇保（二氯异尿酸钠产品）、甲酚皂、苯扎溴铵消毒液及高锰酸钾对菌株CTE722-B、CTE722-C的抑菌效果。结果表明质量浓度为0.2g/mL的菇保溶液抑菌效果最佳。菇宝的主要成分是二氯异氰尿酸纳，常采用燃烧产生烟雾的方式对空气环境及物体表面进行消毒。在工厂的制种车间使用时，一般是在消毒后的0.5 h后完成无菌操作，这一操作要求与实验结果一致；但在对于一般厂房的消毒，常采用甲酚皂和苯扎溴铵消毒液轮流使用。因此即使在严格的操作流程下，生产期间仍出现了不同规模的染菌现象。基于本次实验结果，建议工厂可使用菇宝对菌丝发生室及菇房进行消毒，从而降低由恶臭假单胞菌种（P. putida）和边缘假单胞菌种（P. marginais）造成的污染情况。但由于菇宝挥发的气味刺激性较强，长期在开放的环境下使用会造成污染，因此寻求更合适的防治方法是必需的，而本研究内容也将为后续防治方法的探寻提供理论依据。

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