响应面法优化枯草芽孢杆菌S0507产四甲基吡嗪的培养条件

祝赛峰1，吴建峰2，赵希荣1,*

（1.淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏 淮安 223003；2.江苏今世缘酒业有限公司，江苏 涟水 223411）

摘 要：通过响应面分析法对枯草芽孢杆菌S0507产四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）培养工艺进行优化。经单因素试验后，以Box-Behnken法设计考察培养时间、培养温度、水分含量3 个因素对TTMP产量的交互影响，用Design-Expert v8.0.1.6软件对BBD试验数据进行分析处理。通过响应面试验得到的最佳培养条件为：低温培养时间33.84 h、培养温度41.75 ℃、水分含量59.63%，TTMP产量为332.70 mg/kg，理论值（335.49 mg/kg）与实验值的相对偏差为0.84%，证明应用响应曲面法优化枯草芽孢杆菌S0507产TTMP的培养条件是可行的。

关键词：四甲基吡嗪；枯草芽孢杆菌；响应面法；气相色谱分析

Response Surface Methodology for Optimization of Culture Conditions for the Production of Tetramethylpyrazine by Bacillus subtilis S0507

ZHU Sai-feng1, WU Jian-feng2, ZHAO Xi-rong1,*

(1. School of Chemical Engineering and Life Science, Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003, China;

2. Jiangsu King’s Luck Brewery Joint-Stock Co. Ltd., Lianshui 223411, China)

Abstract: Tetramethylpyrazine (TTMP) was prepared from Bacillus subtilis S0507 under solid-state fermentation. Response surface methodology (RSM) was applied to optimize the culture conditions. On the basis of the results of one-factor-at-a-time experiments, a Box-Behnken design (BBD) was used to investigate the interactive effect of culture temperature, time and solid-to-liquid ratio (water content of the solid medium) on TTMP production, and the experimental data obtained were analyzed with Design-Expert v8.0.1.6 software. The optimal culture conditions as determined by response surface analysis were 33.84 h, 41.75 ℃ and water content of 59.63%. The measured yield of TTMP under the optimized conditions was 332.70 mg/kg, showing a relative deviation of 0.84% in comparison with the theoretically predicted value of 335.49 mg/kg. Thus, response surface methodology is feasible to optimize the culture conditions for TTMP production by Bacillus subtilis S0507.

Key words: tetramethylpyrazine; Bacillus subtilis; response surface methodology; gas chromatography (GC)

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0218-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409043

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），又称川芎嗪，具有烘烤香气、甜香，是中国白酒中的重要香气化合物，因此，在中国传统白酒中均检测到一定量的四甲基吡嗪[1-4]。已证明其具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等作用[5-7]。因而其不仅对中国白酒风味有重要的贡献，而且还赋予了中国白酒有益健康的功能[8-9]，所以，对白酒中四甲基吡嗪的研究，已成为白酒有益于健康研究的重要方向。

目前，国内外TTMP的实验室制备方法主要有从川芎中萃取TTMP的直接提取法[10]、利用非Strecker降解方法化学合成TTMP的化学合成法[11]以及微生物发酵法[12-13]。Kosuge等[14]在纳豆中分离得到TTMP，发现枯草芽孢杆菌具有发酵产生TTMP的能力。Zak等[15]从发酵可可豆中找到了发酵产TTMP的枯草芽孢杆菌，且只有在枯草芽孢杆菌生长时，体系中才会有TTMP。Huang等[16]考察了乙偶姻/乙酸铵模型体系中TTMP的生成过程，并提出了弱酸高压条件下TTMP的生成机制。庄名扬等[17]介绍了美拉德反应与酱香型白酒香味成份间的联系，还阐述了美拉德反应不仅是酒体香和味的微量物质，同时也是其他香味物质的前驱物质[18]。吴建峰[1]提出在白酒制曲过程和酿酒堆积发酵过程均会发生美拉德反应，TTMP是美拉德反应的产物。徐岩等[2]对中国白酒中四甲基吡嗪的来源及产生机制进行了深入的研究，研究验证了中国白酒中四甲基吡嗪产生的主要途径来源于微生物的代谢反应，并非美拉德反应。

本实验采用微生物发酵法生产TTMP，即对筛选得到的枯草芽孢杆菌S0507进行培养条件的优化，得到枯草芽孢杆菌S0507产TTMP的最佳培养条件。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

枯草芽孢杆菌S0507，由江苏省生物酿酒技术研究院筛选并保藏。

基础种子培养基：牛肉膏0.3 g/100 mL、蛋白胨1 g/100 mL、NaCl 0.5 g/100 mL，pH值调至7.2～7.4，于121 ℃高压蒸汽湿热灭菌20 min。

1.2 试剂与仪器

2,3,5,6-四甲基吡嗪（TTMP）、2-乙酰基吡啶（2-acetylpyridine） 美国Sigma公司（纯度＞98%）；乙酸丁酯、95%乙醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；麸皮、花生粉 江苏今世缘酒业股份有限公司。

GC6890气相色谱仪 安捷伦上海科技有限公司；雷磁PHS-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；TDL-60C低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；SHZ-82
气浴恒温振荡箱 金坛市杰瑞尔电器有限公司；
JB-CJ-1FCS无菌操作台 南通市东盛实验室装备有限公司。

1.3 菌种培养

枯草芽孢杆菌培养基本条件（活化）：从斜面上挑取一环菌落至新鲜的琼脂固态斜面上，于37 ℃恒温培养。基础种子培养液培养条件：从新鲜斜面上挑取一环菌落至种子培养液中（每100 mL三角瓶装20 mL培养基），于37 ℃、120 r/min下摇床培养24 h。麸皮固态培养基培养条件：从基础种子培养液中按2%接种于固态培养基，搅拌均匀后置于隔水式恒温培养箱培养。

1.4 单因素培养条件试验

采用两阶段培养模式，即前期低温培养和后期高温培养，实验中固定高温（60 ℃）与培养时间（24 h），研究低温培养温度（简称培养温度）、低温培养时间（简称培养时间）、原料比对TTMP产量的影响。固定原料比（麸皮与花生粉质量比）为7∶3、水分含量为50%、温度为45 ℃，考察培养时间（24、30、36、42、48 h）对TTMP产量的影响；固定麸皮与花生粉质量比为7∶3、水分含量为50%、培养时间为48 h，考察培养温度（29、33、37、41、45、49 ℃）对TTMP产量的影响；固定麸皮与花生粉质量比为7∶3、温度为45 ℃、时间为48 h，考察水分含量（45%、50%、55%、60%、65%、70%）对TTMP产量的影响；固定培养时间为48 h、水分含量为50%、培养温度为45 ℃，考察麸皮与花生粉质量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6，即固态培养基中花生粉不同含量（10%、20%、30%、40%、50%、60%）对TTMP产量的影响。同一水平实验重复3 次。

1.5 响应曲面分析法

在单因素研究的基础上，选取培养时间、培养温度和水分含量3 个因素为自变量，以TTMP含量为响应值，根据Box-Behnken设计原理，设计响应曲面分析试验。

1.6 TTMP的测定方法

1.6.1 TTMP的提取

称取发酵后培养基5 g，捣碎，置于100 mL三角瓶中，加50 mL 12%乙醇溶解，浸泡10 min，超声30 min，4 500 r/min离心10 min，吸取5 mL上清液于试管，并加入1.4 mL乙酸丁酯，混匀溶液，萃取TTMP。将萃取液置于4 ℃冰箱中静置，以防止萃取相中溶剂的挥发。

1.6.2 气相色谱法测定TTMP

样品处理：将萃取液除去乳化层，用1 000 μL移液器吸取上清液于2 mL离心管，用乙酸丁酯定容至1.5 mL，再用10 μL进样器加1 μL内标30 mg/mL 2-乙酰基吡啶，混匀[19-20]。

TTMP的定量分析：进样量1 μL，进样口温度为50 ℃，N2流速为1.0 mL/min；氮磷检测器温度为250 ℃，N2为载气，流速为2 mL/min，H2流速为3 mL/min，Air流速为60 mL/min。毛细管色谱柱为Agilent 19011F-102（25 m×0.2 mm，0.30 μm），恒压模式。程序升温：50 ℃以10 ℃/min速率升温至100 ℃，恒温5 min，以5 ℃/min
速率升温至150 ℃，恒温10 min，再以10 ℃/min速率升温至210 ℃，保持5 min。

TTMP的标准曲线：y＝0.032 2x－0.035 8。其中，y是TTMP与内标2-乙酰基吡啶的峰面积之比，x是TTMP的质量浓度/（μg/mL）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 培养时间对产TTMP的影响

如图1所示，培养时间为24～30 h时，TTMP产量平稳上升；培养时间为30～36 h时，TTMP产量上升趋势较陡；培养时间为36～42 h时，TTMP产量下降趋势较陡；培养时间42～48 h时，TTMP产量平稳下降。这表明，TTMP对培养时间很敏感。随着培养时间的增加，培养基能提供充足的碳源、氮源，细胞处于生长期，代谢旺盛，中间产物不断增加，为TTMP的积累提供前体，TTMP产量相应地提高，在培养时间36 h时，TTMP产量达到最大值。然而，当培养时间大于36 h时，由于高温培养时间过短，低温时生成中间产物未能完全转化为TTMP，因而TTMP生成量开始下降。因此，培养时间应选择36 h。

图 1 培养时间对产TTMP的影响

Fig.1 Effect of culture time on the yield of TTMP

2.1.2 培养温度对产TTMP的影响

现已证实，微生物生长、代谢产物的合成均与酶的催化作用有关，在微生物代谢产物的合成过程中，培养温度对微生物的生长，关键酶酶活性具有重要影响[12]。如图2所示，当培养温度从29 ℃升高到41 ℃时，产物TTMP含量呈上升趋势，当温度高于41 ℃时，TTMP含量呈下降趋势。在试验设计范围内，培养温度41 ℃时TTMP产量达到最大值，比初始培养温度（29 ℃）时的TTMP产量提高了7.68 倍。这表明产TTMP过程对培养温度较为敏感。培养温度过低，菌株生长缓慢，生长延滞期长；温度过高，则导致微生物细胞内酶系失活，菌株生长和产物的合成受到抑制；适宜的培养温度有利于菌体的生长，同时酶活力较高，利于中间产物的积累，TTMP的产量最高。因此，选择培养温度36 h进行响应面优化试验。

图 2 培养温度对产TTMP的影响

Fig.2 Effect of culture temperature on the yield of TTMP

2.1.3 水分含量对产TTMP的影响

如图3所示，当水分含量低于60%时，产物TTMP产量呈上升趋势；当水分含量为60%时， TTMP产量最高；当水分含量高于60%时，呈下降趋势。这表明，产TTMP S0507枯草芽孢杆菌对水分含量十分敏感，随着水分含量的增加，枯草芽孢杆菌发酵活动比较活跃，TTMP产量也相应地提高。当水分含量从45%上升至60%时，TTMP产量提高了1.64 倍。水分含量过高，培养基结块，造成氧气含量不够，影响微生物生长代谢。因此，培养基水分含量选择60%。

图 3 水分含量对产TTMP的影响

Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of TTMP

2.1.4 原料比对产TTMP的影响

图 4 花生粉含量对产TTMP的影响

Fig.4 Effect of wheat bran-to-peanut meal on the yield of TTMP

如图4所示，随着原料比（麸皮与花生粉质量比）的下降，即花生粉含量的增大，产物TTMP含量增加。当原料比（麸皮与花生粉质量比）为5∶5，即花生粉含量为50%时，TTMP含量开始下降，且变化趋势较平稳。这表明，枯草芽孢杆菌S0507产TTMP的过程对花生粉含量较敏感，随着花生粉含量的增加，枯草芽孢杆菌的发酵活动较平稳，菌体生长代谢稳定，TTMP产量也相应地提高，但是提高幅度不大。当花生粉含量增加至50%时，TTMP产量仅提高了0.69 倍；当花生粉含量继续增加时，麸皮含量较少，微生物代谢所需的碳源不够，导致TTMP含量下降。因此，花生粉含量为30%～50%时，最利于TTMP的生成和积累，且变化趋势较平稳。结合实际生产成本，麸皮2.0～5.0 元/kg，花生粉16.0～22.0 元/kg，综合考虑，固定花生粉含量为30%，即麸皮、花生粉质量比为7∶3。

2.2 响应曲面试验结果与分析

2.2.1 Box-Behnken设计试验

以培养时间（X1）、培养温度（X2）、水分含量（X3）为自变量，以TTMP产量为响应指标，采用
Box-Behnken方法设计响应面分析试验，试验设计及结果如表1所示。

表 1 响应面试验设计及结果

Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型建立与方差分析

根据表1的试验结果，利用Design Expert v8.0.1.6软件对试验数据进行分析，所得主要分析结果如表2所示。

表 2 回归与方差分析结果

Tbale 2 Results of regression and variance analysis

注：*.差异显著（P＜0.05）； **.差异极显著（P＜0.01）。

二次模型中回归系数的显著性检验（表2）表明：因素X1、X2对产TTMP效果的线性效应极显著，因素X3对产TTMP效果的线性效应不显著；因素X12、X22、X32对产TTMP效果的曲面效应显著，因素X1X2、X2X3、X1X3对产TTMP效果的交互影响不显著。对试验数据进行多次拟合回归，以TTMP产量（Y）为因变量，培养时间（X1）、培养温度（X2）、水分含量（X3）为自变量建立回归方程模型为：Y ＝320.39－58.24X1＋42.92X2－11.55X3＋11.37X1X2－6.45X1X3－0.93X2X3－77.08X12－103.82X22－90.83X32。

另外，由表2可知，试验各因素对TTMP产量影响显著程度由大到小依次为培养时间＞培养温度＞水分含量；模型的回归F值为28.021，P ＝ 0.000 9（P＜0.05），表明该模型极显著；多元相关系数R2 ＝0.981，调整
R2 ＝0.946，表明模型对试验实际情况拟合较好，但由于失拟较显著（失拟P ＝0.015 3），需对实验结果进行验证。

2.2.3 响应面图及等高线图分析

由响应曲面图和等高线图（图5～7）可知，培养温度与培养时间交互作用、水分含量与培养时间交互作用、水分含量与培养时间交互作用均不显著，与表2中交互项P值的分析结果一致。

图 5 培养温度与时间及其交互作用对TTMP产量影响的
响应面和等高线图

Fig.5 Response surface and contour of effect showing the interactive effect of culture temperature and time on the yield of TTMP

由图5可知，响应曲面的坡度较为陡峭，表明TTMP产量对培养时间和温度的变化较为敏感。在培养时间不变的条件下，随着培养温度水平的逐渐提高，TTMP产量呈先上升后下降的变化趋势；在培养温度不变的条件下，随着培养时间的逐渐增加，TTMP产量呈先上升后下降的趋势，且变化较大。从等高线可看出培养时间变化对TTMP产量的影响比培养温度变化对TTMP产量的影响更大。等高线呈圆形，表明两因素之间的交互作用强度较弱，影响不显著。

由图6可知，响应曲面的坡度较为陡峭，表明TTMP产量对培养时间和水分含量的变化较为敏感。在水分含量不变的条件下，随着培养时间的逐渐增加，TTMP产量先上升后下降；在培养时间不变的条件下，随着水分含量的逐渐增大，TTMP产量先上升后下降。从等高线可看出培养时间变化对TTMP产量的影响比水分含量变化对TTMP产量的影响大。等高线呈圆形，表明两因素之间的交互作用强度较弱，影响不显著。

图 6 水分含量和培养时间对TTMP产量交互作用影响的
响应面和等高线图

Fig.6 Response surface and contour showing the interactive effect of solid-to-liquid ratio and culture time on the yield of TTMP

图 7 水分含量和培养温度对TTMP产量交互作用影响的
响应面和等高线图

Fig.7 Response surface and contour showing the interactive effect of solid-to-liquid ratio and culture temperature on the yield of TTMP

由图7可知，响应曲面的坡度较为陡峭，表明TTMP产量对培养温度和水分含量的变化较为敏感。在水分含量不变的条件下，随着培养温度的逐渐提高，TTMP产量先上升后下降；在培养温度不变的条件下，随着水分含量的逐渐增大，TTMP产量先上升后下降。从等高线可看出培养温度变化对TTMP产量的影响比水分含量变化对TTMP产量的影响大。等高线呈圆形，表明两因素之间的交互作用强度较弱，影响不显著。

通过Design Expert（v8.0.1.6）软件分析，枯草芽孢杆菌S0507产TTMP的最佳培养条件为培养时间33.84 h、培养温度41.75 ℃、水分含量59.63%，此条件下TTMP产量的理论值为335.49 mg/kg。

2.2.4 回归模型的验证实验

为检测所得结果的可靠性，对上述优化条件进行3 次平行实验，即麸皮与花生粉质量比为7∶3、接种量为2%、培养时间为33.84 h、培养温度41.75 ℃、水分含量59.63%，50 g的麸皮固态培养基，共培养时间共48 h，实际测得的平均TTMP产量为332.70 mg/kg，理论值与实验值的相对偏差为0.84%，证明应用响应曲面法优化枯草芽孢杆菌S0507产TTMP的培养条件是可行的。

3 结 论

本实验通过单因素试验分析了培养条件对TTMP产量的影响，并结合Box-Behnken设计及响应面分析，建立了枯草芽孢杆菌S0507发酵条件的二次多项式模型，并经显著性检验证明了该模型具有可靠性。所得二次回归方程为：Y＝ 320.39－58.24X1＋42.92X2－11.55X3＋11.37X1X2－6.45X1X3－0.93X2X3－77.08X12－103.82X22－90.83X32。该方程回归系数极显著，调整R2较高，实际拟合度较好。对方程进行优化，得枯草芽孢杆菌S0507最佳发酵条件：低温培养时间为33.84 h、培养温度为41.75 ℃、水分含量为59.63%、麸皮与花生粉质量比为7∶3。在此条件下，TTMP实际产量为332.70 mg/kg，理论值（335.49 mg/kg）与实验值的相对偏差为0.84%，表明应用响应曲面法优化枯草芽孢杆菌S0507产TTMP的培养条件是可行的。

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