乳酸菌对发酵肉制品中肌肉蛋白降解作用的
研究进展

陈 倩，韩 齐，孔保华*，夏秀芳，刘 骞

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

摘 要：乳酸菌是发酵肉制品中常见的微生物之一，其对肌肉蛋白的降解作用是发酵肉制品风味形成及品质改善的关键因素。本文简述与肌肉蛋白水解作用相关的微生物酶类及其对品质特性的影响，综述在不同模拟体系——体外模拟体系和发酵肉制品体系中乳酸菌对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解作用，并提出现行研究中存在的问题和发展方向，这些对于功能性肉制品发酵剂的开发具有参考价值。

关键词：乳酸菌；发酵肉制品；肌肉蛋白；微生物酶；降解作用

Role of Lactic Acid Bacteria in Protein Degradation of Fermented Meat Products: A Review

CHEN Qian, HAN Qi, KONG Bao-hua*, XIA Xiu-fang, LIU Qian

(College of Food Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract: Lactic acid bacteria are one of the most common microorganisms in fermented meats. Hydrolysis of meat proteins is essential to the flavor development and quality improvement. This review provides a brief description of microbial enzymes involved in meat protein hydrolysis and their effects on meat quality characteristics as well as an overview of the role of lactic acid bacteria in degradation of sarcoplasmic and myofibrillar proteins in fermented meat products and simulated systems in vitro. Some disadvantages of recent research and future research trends are discussed. We hope that this paper could provide a value reference for the development of functional meat starter cultures.

Key words: lactic acid bacteria; fermented meat products; meat proteins; microbial enzymes; degradation

中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0279-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409055

乳酸菌是发酵肉制品中最常用的微生物之一，包括乳杆菌属、片球菌属和链球菌属（表1）。在肉制品发酵和成熟过程中，其可利用碳水化合物产酸，降低肉品pH值，进而抑制致病菌和腐败菌的生长[2-3]；使肌肉蛋白变性，改善肉制品的组织结构[4]；利于NO2－分解成NO，促进肉制品发色，有利于提高腌肉色泽的稳定性[5]。此外，乳酸菌可通过对游离氨基酸的释放与降解来调节挥发性与非挥发性化合物的组成，进而影响发酵肉制品风味的形成[6]。而对于大多数的非挥发性化合物，如多肽和氨基酸，是由蛋白质水解产生的，因此，蛋白质水解作用对发酵肉制品风味的形成至关重要。

表 1 发酵肉制品中常见的乳酸菌[1]

Table 1 Lactic acid bacteria in fermented meats[1]

1 与蛋白质降解相关的酶类

在发酵肉制品成熟过程中，蛋白质的降解是一个重要的反应过程。肌肉蛋白降解是肌肉内源酶和微生物蛋白酶共同作用的结果，发酵初期在内源酶（主要是组织蛋白酶）的作用下肌肉蛋白被分解成多肽，然后再由内源性氨肽酶以及微生物酶（如肽链端解酶）作用将多肽降解为小肽和游离氨基酸，其中许多氨基酸是风味物质，或者作为风味物质的前体物质，再通过微生物转氨、脱氨以及脱羧作用生成醛、酸、醇和酯等芳香化合物[7-9]。然而，与蛋白质降解相关的酶系非常复杂，目前尚不能完全确定它们在整个发酵和成熟过程中的专一性及反应历程。

近年来，很多学者研究了乳酸菌蛋白水解酶系统的复杂性与多样性。利用离子交换色谱以及凝胶过滤等提纯技术分离纯化并鉴定了与肌肉蛋白降解相关的酶类，基本上是清酒乳杆菌产生的（表2）[10-14]。通常，这些肽链端解酶可增加游离氨基酸含量，促进风味的形成。

乳酸菌对蛋白质的降解作用主要是这些酶系共同作用的结果。首先，肌肉蛋白在乳酸菌胞外蛋白酶和肌肉内源酶的共同作用下生成多肽，其中生成的小肽（分子质量小于3 000 D）与风味形成有关[15]。尽管不能完全通过多肽的亲水疏水性来判断它对风味形成的贡献，但研究表明，亲水性肽更容易产生鲜味和甜味，促进发酵风味的形成[16]。随后，乳酸菌的各种肽酶降解多肽生成游离氨基酸，这是乳酸菌作用形成风味的主要途径。除了乳杆菌外，片球菌也可增加游离氨基酸含量，但同一菌属、不同菌株以及在不同体系中所表现的的活力不尽相同，这主要受实验条件的影响，比如pH值、湿度以及氯化钠含量等因素。游离氨基酸可作为风味物质或者风味物质的前体物质进一步参与风味的形成[17]。其中，谷氨酰胺代谢产生的谷氨酸在发酵后期会大量积累，它能够产生鲜味；此外，一些支链氨基酸也会有所增加，这些氨基酸可以在转氨酶的作用下进一步代谢生成α-酮酸，它是可以产生麦芽味的醛类，果香味的醇类以及其他发酵风味物质的前体化合物[18]。总之，乳酸菌对蛋白质的降解以及风味形成的作用值得我们探究。

2 乳酸菌对蛋白质降解作用

为了阐述肉制品在发酵过程中乳酸菌对蛋白质的降解作用，采取了不同的模拟体系。一种是排除肌肉内源性蛋白酶作用，单独考察乳酸菌对肌肉蛋白质的降解能力。通常是建立一个体外模拟体系，即向液体培养基中添加肌肉蛋白提取物，还有少数的研究在发酵肉制品中添加抑菌剂以及肌肉蛋白酶抑制剂，考察乳酸菌对两种蛋白的降解情况。在这种体外模拟体系中，测定乳酸菌对肌肉蛋白提取物的水解作用，更具有针对性；另一种是发酵肉制品体系，在有内源酶存在的条件下研究乳酸菌对肌肉蛋白的降解情况，这种方法更能真实地反映发酵肉制品中乳酸菌对肌肉蛋白降解的能力，同时也适合肉制品发酵剂的筛选。

2.1 体外模拟体系

在早期研究中，这种模拟体系就是含有一定浓度肌肉蛋白提取物的溶液，随后将其改良，在培养基中添加一定量的肌肉蛋白提取物。在提取肌肉蛋白的过程中，肌肉内源性蛋白酶遭到破坏失去活性，因此这种体系几乎可完全排除肌肉内源性蛋白酶的影响，同时模拟乳酸菌在肉基质中生长的条件，利于分析仅由乳酸菌作用引起的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白降解。研究多集中在考察乳杆菌的全细胞悬浮液（whole cell suspension，WCS）、无细胞提取物（cell-free extract，CFE）以及两者的等比例混合物对猪肉肌浆蛋白以及肌原纤维蛋白提取物分解能力，其中CFE作为酶的一个来源。

Fadda等[19]采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳和反相高效液相色谱研究了植物乳杆菌CRL681对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白在0d和4d的降解情况。不接菌的肌浆蛋白在0d和4d的电泳条带基本一致，说明在肌浆蛋白提取过程中大部分内源酶被破坏（图1a）；而不接菌的肌原纤维蛋白第4天的电泳条带发生了现在的降解，这可能是其中残留的内源酶作用的结果（图1b）。从结果可看出，该株乳酸菌对肌肉蛋白有一定的水解作用，并且对肌浆蛋白的水解作用较强（图1a），添加WCS后，97、45、37、26kD处的条带发生了不同程度的降解，同时发现添加CFE可促进肌浆蛋白的水解。从图1b可知，该株乳酸菌对肌原纤维蛋白的水解作用不大，添加WCS后200kD和45kD处的条带发生了轻微的降解，产生了新的条带，但是添加CFE对肌原纤维蛋白降解没有显著的促进作用，这说明肌肉蛋白质可能不适合作为CFE表现其胞内酶活性的底物，而且植物乳杆菌CRL681 CFE中可能没有水解肌肉蛋白提取物的蛋白酶；另外，可初步推断水解肌肉蛋白提取物的蛋白酶活性是同此菌体细胞的细胞壁相连的，并存在于活的全细胞中[20-21]。此外，从经过乳酸菌作用后的条带复杂程度说明肌原纤维蛋白不容易被乳酸菌降解。

图 1 植物乳杆菌对肌浆蛋白（a）和肌原纤维蛋白（b）提取物的降解[19]

Fig.1 SDS-PAGE of hydrolysis of sarcoplasmic protein (a) and myofibrillar protein (b) by Lactobacillus plantarum[19]

此外，他们还详细分析了其蛋白水解产物如多肽、氨基酸的类型及产生这些物质的前体和原因。结果表明在WCS或WCS和CFE共同作用下，肌原纤维蛋白和肌浆蛋白降解生成的多肽性质不尽相同。肌原纤维蛋白和肌浆蛋白在全细胞的作用下都会生成亲水性多肽，这种亲水性多肽利于形成良好的腌肉风味；而添加无细胞提取物后一些疏水性多肽含量会增加，这表明外源酶的加入或者多肽酶的过表达可能是风味化合物产生的关键。Visessanguan等[22]也同意该观点，缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸可能是由肌肉蛋白水解作用产生的，它们在后期的成熟过程中占主导，这对发酵肉制品风味的形成有一定贡献。

其他报道[23-27]也利用同样的方法研究了干酪乳杆菌CRL705、弯曲乳杆菌CECT904、清酒乳杆菌CECT4808、植物乳杆菌CRL 681和植物乳杆菌6003对肌肉蛋白质的水解作用，结果表明这些菌株对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解有潜在的作用；随后，Pereira等[28]的研究证明弯曲乳杆菌和同型腐酒乳杆菌两株乳杆菌有胞外蛋白水解酶活性，并且菌株在对数生长期表现出最大的蛋白水解活性。

实际上，在发酵过程中蛋白质水解除了与乳酸菌酶类水解活力有关外，还与乳酸菌产酸代谢相关。Saunders等[29]研究表明pH值低于4.5利于肌原纤维蛋白的降解，并且在pH 3.0时降解程度达到最大。Fadda等[30]采用不同
pH4.0和pH 6.0的发酵体系，研究经植物乳杆菌CRL681在30 ℃发酵96 h后肌浆蛋白的降解情况。结果表明，在这两个pH值下，菌株能够在可溶性肌肉蛋白中生长并且对其有降解能力。实验发现在pH 4.0条件下植物乳杆菌对肌浆蛋白的降解能力很强，并且在发酵香肠体系中也有同样的结果，这是肉源性酸性蛋白酶、菌株蛋白水解活力以及乳酸菌发酵产酸等方面协同作用的效果；在pH 6.0条件下蛋白质发生轻微的水解，这可能是乳酸菌蛋白酶水解的作用（图2）。

M. Marker；对照.未添加植物乳杆菌的样品；0～96h.植物乳杆菌处理不同时间后样品。

图 2 植物乳杆菌在pH4.0（a）和pH6.0（b）下对
肌浆蛋白提取物的降解[30]

Fig.2 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein hydrolysis by Lactobacillus plantarum incubated at controlled pH 4.0 (a) and pH 6.0 (b) for 96 h at 30 ℃[30]

Fadda等[31]选择了改良的模拟体系，在培养基中补充添加肌肉蛋白提取物，考察从发酵香肠分离出的清酒乳杆菌对肌肉蛋白的降解能力。结果表明，合成培养基（CDM）在0 h和72 h时，电泳图中均未出现条带（图3，泳道1、2），而接种清酒乳杆菌的CDM电泳图中有极其微弱的条带（泳道3）产生，这可能是菌体蛋白产生的；添加肌浆蛋白和肌原纤维蛋白提取物的CDM（S-CDM和M-CDM）在0h和72h时分别出现了相应的蛋白条带（泳道4、5、8、9）。S-CDM和M-CDM经30 ℃处理72 h后与0 h相比，电泳图存在差别： S-CDM条带未发生显著变化（泳道5），而M-CDM在42～134kD范围内条带数增加（泳道9），这可能是肌原纤维蛋白在提取过程中残余的内源酶作用所致；然后在S-CDM和M-CDM中接种清酒乳杆菌发酵72 h，肌浆蛋白发生降解，产生了67 kD和22 kD两个条带（泳道6），而肌原纤维蛋白降解产生了较多新的条带（泳道10）。这些新条带的产生一方面是内源酶和清酒乳杆菌共同作用的结果；另一方面，可能是菌体细胞裂解产生了一些菌体蛋白所致。

C. 合成培养基；S-CDM. 含有肌浆蛋白的合成培养基；M-CDM. 含有肌原纤维蛋白的合成培养基。1. CDM未接菌第0小时；2. CDM未接菌第72小时；3. CDM接菌第72小时；4. S-CDM未接菌第0小时；5. S-CDM未接菌第72小时；6. S-CDM接菌第72小时；8. M-CDM未接菌第0小时；9. M-CDM未接菌第72小时；10. M-CDM接菌第72小时。

图 3 接种和未接种清酒乳杆菌对补充添加以及未补充添加肌浆蛋白和肌原纤维蛋白提取物的培养基电泳图[31]

Fig.3 SDS-PAGE of CDM supernatants (C, S-CDM and C-CDM) inoculated with or without L.sakei 23K[31]

2.2 发酵肉制品体系

Verplaetse等[32]在香肠加工过程中加入微生物抑制剂以及蛋白酶抑制剂，结果发现，添加蛋白酶抑制剂的肌动蛋白和肌球蛋白的降解程度要比添加微生物抑制剂的小。这表明内源性蛋白酶在蛋白质降解过程中比微生物分泌的蛋白酶发挥的作用要大，特别是在加工过程的初期。尽管如此，在成熟后期细菌蛋白水解活力对肌肉蛋白的降解作用还是很大的，它可以降解多肽生成大量的小肽和氨基酸，这些多肽和氨基酸是风味化合物以及一些风味化合物的前体物质，促进成熟过程[33]。在发酵肉制品体系中研究乳酸菌对肌肉蛋白质的降解作用更具有实践意义，在发酵剂的筛选以及发酵工艺优化等方面具有指导作用。

Villani等[34]分析了传统意大利发酵香肠在发酵和成熟过程中的菌相变化，并且分离鉴定出在此过程中的优势菌株，其中主要的乳酸菌有弯曲乳杆菌BVL7、清酒乳杆菌BVL6和清酒乳杆菌BVL26，然后再将其作为发酵剂添加到香肠中发酵14 d，考察它们对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解情况。电泳结果如图4所示，在内源酶和微生物酶两种酶水解体系的作用下，14～45 kD区域内的蛋白条带发生了变化，肌浆蛋白中的肌红蛋白（14 kD）降解的最为严重，另外接种弯曲乳杆菌BVL7和清酒乳杆菌BVL的43 kD处对应的条带也降解消失了，这是1种重要的骨骼肌酶——肌酸激酶，34 kD处的条带也有轻微的降解（图4a）。这3 种乳酸菌对肌原纤维蛋白的降解作用远不如对肌浆蛋白的明显（图4b），降解的部分主要是集中在14～75 kD区域内，只是发生了轻微的变化。25、20 kD这两个条带分别对应肌球蛋白轻链-1和轻链-2，与对照组相比，这两个条带强度稍微减弱了。

M. Marker；C0.未接菌种对照组；C14.对照组处理14d样品。

图 4 乳杆菌对发酵香肠中肌浆蛋白（a）和肌原纤维蛋白（b）的降解[34]

Fig.4 Hydrolysis profiles of sarcoplasmic protein (a) and myofibrillar protein (b) of Italian fermented sausages with different Lactobacillus strains [34]

Fadda等[35]选择了市场上常见的10种阿根廷干发酵肠，通过SDS-PAGE和低分子质量多肽的分离鉴定来评价肌肉蛋白的水解作用。SDS-PAGE结果亦表明在内源酶和乳酸菌作用下，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白发生了水解，并且肌浆蛋白的水解程度较大。其中有一种产品的蛋白水解较强烈，这可能与其发酵技术有关，如发酵温度和发酵时间[36]。接下来通过考察感官特性、理化特性（pH值和水分活度）以及安全性（腐败菌和致病菌），从这10 种香肠中筛选出了5 种。将香肠的蛋白提取物进行超滤，得到分子质量低于3 000 D的多肽，这些与风味有关的多肽就分离出来了。分子质量大于3 000 D的部分经过反向高效液相色谱进行分析，收集那些发生改变的峰，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）仪对这部分碎片进行质谱分析。结果表明，在发酵和成熟过程中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白降解生成了低分子质量的多肽（1 000～2 100 D），经序列分析发现其氨基酸组成很复杂，由亲水性和疏水性氨基酸组成。从多肽的断裂点可推断出其在亲缘蛋白质上的位置，断裂点的位置反映出水解体系的复杂性，肌浆蛋白发生水解的位点较肌原纤维蛋白的要多。肌动蛋白水解得到了4 种多肽，它们对应着蛋白质N端及其中心区域，而肌球蛋白水解得到了3 种多肽，只源于N端区域。这些结果也说明了在发酵肉制品中肌原纤维蛋白降解的作用较肌浆蛋白的要弱。

3 乳酸菌对蛋白质降解作用研究存在的问题

肌肉蛋白水解作用是发酵肉制品特殊风味形成的一个重要途径。作为应用最为广泛的肉品发酵剂之一，乳酸菌对肌肉降解作用得到了广泛的研究，但是关于乳酸菌酶系对肌肉蛋白降解作用的机制和历程以及一些发酵工艺对乳酸菌水解蛋白质的影响等问题尚待阐明。

3.1 研究中存在的问题及发展趋势

目前，多数研究集中在模拟体系中考察乳酸菌是否对不同的肌肉蛋白具有降解作用以及降解的程度，进而对分离出的低分子肽进行鉴定，并分析其性质，但是关于肌肉蛋白在降解过程中乳酸菌酶系的作用机制研究较少，肌肉内源酶与微生物酶系怎样调节蛋白降解以及这些酶的专一性等问题仍需探究。另外，乳酸菌之间可能因菌株个体差异性使得其对蛋白质水解作用机制不同，例如，肉源性乳杆菌的胞外蛋白酶活力远不如乳源性乳杆菌的强，肉源性清酒乳杆菌32K的基因组没有编码外源性蛋白酶的基因[31]。

3.2 研究深度

蛋白组学作为后基因时代主要研究任务之一已得到了迅速的发展，目前在肉品科学中也得到了广泛应用[37-39]。Aldo等[40]利用蛋白质组学技术研究了发酵火腿在成熟过程中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的变化情况，双向电泳法比SDS-PAGE法更为详尽地阐述了蛋白质的变化。

由于蛋白质降解受基因调控，因此可通过蛋白组学来研究乳酸菌对肌肉蛋白质的降解作用，从分子水平认知乳酸菌的功能和作用机制[41]。Fadda等[26]利用研究清酒乳杆菌23 K在肌肉蛋白提取物中的生长适应性，使用双向电泳技术，分析菌株在不同肌肉蛋白中生长72 h后其胞内蛋白质组的变化情况，然后通过MALDI-TOF/MS鉴定具有显著作用的调节蛋白。结果表明，从31 个表达点看，在有肌原纤维蛋白提取物存在时存在16 个点，而在有肌浆蛋白提取物存在时有6 个点，这与SDS-PAGE所得到的蛋白质降解模式具有相关性。当有肌原纤维蛋白提取物存在时，清酒乳杆菌23K会过度表达与能量和嘧啶代谢相关的蛋白质，同时也与丙氨酸和酪氨酸合成酶以及翻译有关，而其他与普通应激反应以及嘧啶、维生素和辅因子的生物合成相关的蛋白表达受到了抑制。当应激蛋白处于调控状态下，添加肌肉蛋白提取物可调整与翻译、多肽/氨基酸代谢以及产能相关蛋白质的过度表达。这项研究加深了在有肌肉蛋白存在时，清酒乳杆菌23K的分子应激反应和生长机制的理解。我们需加深对这些调控基因功能性的研究，建立基因组序列和其生物学作用之间的连系，为筛选良好适应性的菌株，生产高质量的发酵产品提供基础。在基因后时代，为了从基因数据获得更多的信息，引进生物信息学是很关键的。蛋白质组学与转录分析表达结合之后，可提供更多有价值的基因和蛋白质。

4 结 语

在发酵过程中，肌肉蛋白质的降解与内源性蛋白酶和乳酸菌的水解作用密切相关，除此之外，乳酸菌产酸代谢作用可促进其降解程度。在此过程中，肌浆蛋白比肌原纤维蛋白更易发生水解。分析这两种蛋白质降解产生的多肽，表明它们与发酵特殊风味形成有关。今后的研究会沿着对多肽形成的机制方向进行，采用更多的检测分析手段鉴定风味化合物。蛋白质组学的应用也可为乳酸菌在肌肉环境中适应性以及乳酸菌作用产生风味物质的机制研究提供分子生物学信息。

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