代谢组学在转基因作物非预期效应评价中的应用

王 森,李健爽,杜晓燕*

(哈尔滨医科大学公共卫生学院,黑龙江 哈尔滨 150081)

 

摘 要:外源基因的非预期效应可能形成新的代谢产物或改变代谢模式,也可能引起转基因作物的营养成分发生改变,甚至可能会产生一些新的有毒物质,是转基因食品安全性评价的重要内容之一。本文主要对近年来代谢组学技术在转基因作物非预期效应评价中的最新应用做了总结,并阐述了对该研究领域的预期,以期促进转基因食品安全性评价体系的发展和完善。

关键词:转基因作物;代谢组学;非预期效应;评价

 

Applications of Metabolomics in Evaluation of Unintended Effects of Genetically Modified Crops

 

WANG Sen, LI Jian-shuang, DU Xiao-yan*

(College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150081, China)

 

Abstract: Unintended effects from exogenous gene may form new metabolites or change metabolic patterns and nutrients of genetically modified crops, and even generate some new toxic substances. The study on unintended effects is one of the important contents of safety evaluation of genetically modified foods. This review focuses on the latest applications of metabolomics in evaluation of unintended effects of genetically modified crops, and describes research expectations in this field, so as to promote the development and improvement of safety evaluation system for genetically modified foods.

Key words: genetically modified crops; metabolomics/metabonomics; unintended effects; evaluation

中图分类号:TS201.6 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)09-0312-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201409061

近年来,由于转基因作物的商业化和大面积种植,有关其非预期效应和生态安全的研究成为热点问题。在已颁布的管理法规、安全性评价原则及技术方案中,非预期效应的筛查和评价都被列为重要内容。非预期效应是指外源基因的转入导致农业转基因生物的表型性状和遗传性状在传代、生长、发育和代谢等过程中发生偏离基因工程设计目标的变异或抗生素抗性基因发生水平转移[1]。由于外源基因的非预期效应具有潜在性、非预见性,因此以实质等同性为基础的定向方法很难充分考虑到由基因修饰所引起的非预期效应。“实质等同性”这一概念是由世界经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)最早提出,其本质是比较原则,即将转基因食品与传统食品从表形性状、农学性状、组成成分等方面进行比较,从而得出转基因食品是否与传统食品具有实质等同性的结论,它是目前普遍公认的评价转基因食品安全性的有效途径。组学技术是近年发展起来的一门新兴技术,它的应用大大增加了筛查非预期效应的机会[2]。利用代谢组学技术从代谢水平上比较转基因作物与非转基因作物的代谢差异,是筛查转基因作物非预期效应的一个颇具前途的重要技术手段。

1 转基因作物非预期效应的来源

1.1 目标性状变异

目标性状包括与外源基因功能相关的表形性状和遗传性状。转基因作物任何目标性状变异直接或间接的与转录的变化、外源基因的表达及其调控功能有关。目标遗传性状变异是目标表型性状变异的一个内在因素。研究结果表明,转化效应、位置效应、重组效应和修饰效应都能导致转基因作物的目标遗传性状发生变异[3]。

1.2 非目标性状变异

非目标性状包括转基因生物的表型性状和遗传性状,转入基因的功能忽略不计,但是转入基因对受体内源基因的结构、转录、表达和调控功能的影响都可导致非目标性状发生变异。根据相关文献,非目标遗传性状变异与插入效应、诱导效应和异源效应有关[3]。这些效应可能导致非目标遗传性状变异,并且进一步引起表型性状变异。

1.3 基因水平转移

细胞间DNA水平转移的机制非常复杂,它受很多因素的限制。其中一个关键机制是DNA在细胞间转移,通过接合、转导或转化,DNA可以在同一物种以及不同物种的细胞间水平转移。另一个关键机制是外源基因的整合,DNA可以通过DNA重组插入到受体基因组中,包括同源重组、换位、位点特异性重组和DNA修复。基于这两个机制,在转基因作物中DNA可以水平转移到其他生物细胞内[3-4]。

2 转基因作物非预期效应的筛查方法

目前,转基因作物非预期效应的筛查方法主要包括定向方法和非定向方法。

2.1 定向方法

针对特定目标的检测方法称为定向方法。该方法主要是对一些重要营养素和关键毒物进行单成分分析,通过比较分析来确定转基因品种和亲本品种之间的是否存在差异,该方法已成功应用于第一代转基因作物的安全评价,并被国际组织广泛接受。然而,定向方法已被普遍认为存在以下两方面的局限性[5]:一是至今仍没有普遍公认的、统一的指导方针来确定分析的完整程度;二是定向方法仅关注已知化合物和可预见的变化,结果可能存在偏倚。

2.2 非定向方法

由于定向方法的局限性,研究者们开始关注非定向方法。以组学技术为基础的非定向方法已经逐步形成而且备受关注。组学技术包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学[6]。转录组学技术主要是研究转基因作物的基因表达变化,检测基因表达谱的差异性,作为基因修饰的非预期副作用的一个指证,以便为进一步研究毒理学的相关性提供信息[5]。但是转录组的变化并不一定会导致蛋白质组和代谢组也发生变化,因此不一定能预测到食品成分和质量的变化[7],转录组学在非预期效应评价中受到限制。蛋白质组学研究可以为理解基因修饰后生物过程的变化提供重要的信息[8]。因为蛋白质是基因转录和翻译的直接产物,蛋白质组学非常适合检测转基因作物在基因组、基因调控、或生化途径中的变化[9]。但是蛋白质组学分析不够快速,定量不典型,比较昂贵,并且需要专门的设备和软件[7]。因此,降低了其在安全评价中的应用优势。与其他组学相比代谢组学更能反应生物体的整体信息,并且基因表达和蛋白质变化对系统产生的影响都能在代谢水平上得到体现[10]。通过对转基因作物代谢谱或生物标志物的研究,可以从代谢水平了解转基因作物可能产生的异常生理状态,提高筛查效率。代谢组学技术有潜力成为筛查非预期效应最有力的技术手段。

此外,转基因生物的目标性状变异还存在另一种特殊形式,即转基因生物基因组中整合的表达抗生素抗性产物的外源基因发生向其他非靶生物细胞的转移而导致非靶生物细胞产生相应的耐药性。这种变异形式称为抗生素抗性基因的水平转移[11]。对转基因作物的抗生素抗性基因的水平转移的筛查方法一般是基于体内和体外检测模型[12]。转基因作物的抗生素抗性基因可以向环境中或是动物胃肠道内的细菌转移,根据模型,可以通过这两个途径检测抗生素抗性基因的水平转移。

3 代谢组学在转基因作物非预期效应评价中的应用

常用的代谢组学分析技术主要有核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术和色谱-质谱联用技术。

3.1 核磁共振技术

NMR技术是最早应用于代谢组学研究的手段之一,其优势在于能够对样品实现无创性、无偏向的检测,且无需对样品进行预处理,易于鉴定化合物的结构信息。它的缺点是检测灵敏度较低并且动态范围有限,难以同时对同一样品中浓度相差很大的物质进行检测[13]。

Piccioni等[14]采用一维和二维NMR技术对转Cry1Ab
基因玉米种子及其对应的传统玉米种子的代谢谱进行了分析。转基因样品与非转基因样品相比,除了乙醇、柠檬酸、甜菜碱、海藻糖,以及尚未完全确定的另一种化合物浓度升高外,转基因品种中没有出现新物质。Picone等[15]也采用NMR技术评估了转基因葡萄,发现基因修饰导致转基因葡萄与其对应的野生品种在代谢水平上发生了不同程度的变化。此外,Kim等[16]采用傅里叶变换红外光谱(fourier transformed infrared spectroscopy,FT-IR)和1H-NMR光谱结合多变量分析对转基因马铃薯块茎和野生型马铃薯块茎做了比较分析,转基因马铃薯和野生型马铃薯之间没有出现代谢差异,但是新鲜马铃薯和贮藏1周之后的马铃薯差异比较明显。

在以往的研究中,都是以体外评价模型为基础,采用代谢组学方法分析转基因作物的代谢物是否发生了非预期的代谢差异,Cao Sishuo等[17]通过代谢组学技术建立了一个新的体内评价模型来评价转基因作物的安全性。在这项研究中,分别饲喂大鼠转基因水稻和非转基因水稻90d,收集0、30、60、90 d 4 个时间点的24 h尿液,用1H-NMR检测大鼠尿液代谢物的变化,以考察与非转基因水稻相比较转基因水稻是否诱导了大鼠尿液的代谢物发生变化,并采用多变量分析和方差分析分别来确定差异和差异的显着性。多变量分析结果表明,在转基因组与非转基因组之间,与零时间点比较,3个时间点大鼠尿液中的α-酮戊二酸和马尿酸有不同的变化趋势,而且在所有3个时间点中转基因组大鼠尿液的乙酸量都高于非转基因组。然而,方差分析的结果表明,在第1个月转基因组大鼠尿液中的α-酮戊二酸,马尿酸和乙酸与非转基因组有显著差异,但是在第2个月和第3个月,转基因组与非转基因组比较大鼠尿液中的这些代谢物没有差异。鉴于这些变化的不稳定性和不连续性,不能认为这些变化与转基因水稻有关。最终得出结论,这些差异并不具有生物学意义。这是首次采用NMR技术对转基因产品90d喂养大鼠尿液进行代谢物分析,该方法是对传统转基因作物安全评价方法的补充。作为一种非侵入性、动态监测方法,代谢组学将会为转基因作物及其食品的安全性评价开辟新的道路。

3.2 色谱-质谱联用技术

利用色谱的分离作用和质谱的鉴定作用能够对代谢物进行准确定量和快速定性分析,色谱-质谱联用技术在代谢组学研究中显示出了巨大的发展潜力,常用的色质联用技术主要有以下几种。

3.2.1 气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)

由于GC-MS具有较高的分离效率和灵敏度,易于操作且较为经济,被广泛应用于代谢组学分析。但是GC-MS仅限于分析挥发性的物质,无法分析热不稳定性和分子质量较大的代谢产物[13,18]。

为了研究转两种抗虫基因(cryIAcsck)水稻在代谢水平上是否导致了非预期效应,Zhou Jia等[19]采用气相色谱-火焰离子化检测器(gas chromatography-flame ionization detection,GC-FID)和GC-MS相结合的方法寻找转基因水稻与非转基因水稻之间的代谢变化。为了确定环境因素对代谢物的影响,还检测了不同播种日期或地点的野生型样品。对谷物中的极性化合物进行提取和三甲基硅烷化后,再用GC-FID进行分析。利用偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)和主成分分析(principal component analysis,PCA)来区分转基因水稻和野生型水稻,挑选出有显著性差异的代谢物,然后通过GC-MS进行鉴定。研究结果发现,环境因素对水稻某些代谢物诱导了相似的影响,如转基因和非转基因样品中3-磷酸甘油、柠檬酸、油酸、蔗糖等的含量都有较大幅度增加。而与非转基因水稻比较,转基因水稻中的蔗糖、甘露醇和谷氨酸含量增加较显著,提示这几种代谢物的差异可能与基因修饰相关。他们的研究区分了环境因素与基因修饰所导致的代谢物差异,对评价转基因作物的非预期效应有着重要意义。当然,要获得更多关于转基因水稻安全评价的信息,还有很多工作有待完成。另外,Frank等[20]采用GC-MS调查了转Bt基因玉米及其对应的非转基因品种的代谢差异,发现观察到的大部分差异都与环境因素导致的自然变异有关,与基因修饰关系不大。由于非预期效应不但会出现在转基因作物中,也会出现在传统农作物的育种和生长过程中,转基因产品非预期效应的筛查更加困难。代谢组学技术在鉴别基因修饰和环境因素导致的非预期效应方面表现出了极大的潜力。

Kim等[21-22]应用气相色谱-飞行时间质谱(gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,GC-TOF-MS)对增强转基因作物的营养价值所导致的非预期变化进行了评估。该方法准确、灵敏,而且非常快速。他们采用GC-TOF-MS检测了β-胡萝卜素生物强化水稻的14种亲脂性化合物[21];又采用同样的方法分析了类胡萝素生物强化水稻和5种传统水稻品种的52种极性代谢物,均未出现非预期的不良变化[22]。

3.2.2 液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)

LC-MS也是一种在转基因作物代谢组学研究中常用的手段。LC-MS不需要对样品进行衍生化预处理,并且具有较高的灵敏度和较宽的动态范围,可重复定量分析,适用于分离和分析那些极端复杂的样品[13,23]。目前,LC-MS技术已发展成为代谢组学研究的主流技术手段。

Chang Yuwei等[24]采用快速高分离液相色谱-四极杆飞行时间质谱(rapid resolution liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry,RRLC-TOF-MS)分析了水稻种子。研究发现该方法的线性、重现性、日内精密度和日间精密度都非常好。故采用该方法研究转基因水稻及其亲本作物在代谢水平上的差异。此外,还比较了不同播种时间和不同播种地点的水稻以评价环境因素可能产生的效应。多元数据分析发现不同播种地点的水稻存在代谢差异,并找到了对环境变化比较敏感的物质甲烟酸内盐。结果表明对于多数代谢产物,如色氨酸、9,10,13-三羟基十八碳-11-烯酸、溶血磷脂酰乙醇胺(160),环境因素比基因修饰起到了更大的作用。而对于植物鞘氨醇、棕榈酸及其他3个未鉴定的代谢物,其含量的轻微变化更倾向于与基因修饰相关。其研究通过比较环境因素和基因修饰诱导的变化,表明由基因修饰引起的代谢物变化是否包含在环境因素导致的变化范围之内。

García López等[25]采用反相高效液相色谱-电喷雾质谱法(reversed-phase high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry,RP-HPLC-ESI-MS)对转基因玉米和非转基因玉米进行了代谢组学分析。该方法具有灵敏度高,检测范围宽等优点,这是第一次采用RP-HPLC-ESI-MS来分析玉米品种,结果发现被测样本之间存在一些相似性和差异性。Kim等[26]采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(high-performance liquid chromatography-diode array detection,HPLC-DAD)和HPLC-MS研究转基因中国白菜和非转基因中国白菜的代谢指纹谱,没有找到可以区分转基因中国白菜与非转基因中国白菜的差异代谢物。

3.2.3 毛细管电泳-质谱联用(capillary electrophoresis-mass spectrometry,CE-MS)

与其他类型联用技术相比,CE-MS具有更高的分离速度和效率,且样品和试剂消耗量少,分析速度快,近年来在代谢组学的研究中越来越受到重视[18,27]。

Levandi等[28]采用毛细管电泳-飞行时间质谱(capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry,CE-TOF-MS)来识别和定量3种转基因玉米及其对应的非转基因品种的主要代谢物。为了从玉米面中提取出数量最多的代谢物,提取过程中对超声条件和溶剂选择进行了优化。由于在线电喷雾-TOF-MS质量精度非常好,识别代谢物精准,故采用该手段识别代谢物。引入分子式到不同的数据库中后,初步鉴定出27种代谢物。数据分析发现转基因玉米与其对应的非转基因品种相比,有一些代谢物有显著性差异,如L-肉碱和水苏碱,这些差异代谢物可能是转基因玉米的生物标志物。在一个类似的研究中,García-Villalba等[29]采用同样的方法对转基因大豆和非转基因大豆的代谢谱进行了比较分析,该方法初步鉴定出40多种代谢物。结果表明所检测到的代谢物中有一些没有发生变化,而另一些在转基因大豆与传统品种中表现出了显著性差异。

3.2.4 多平台方法

多种代谢组学技术平台相结合的方法在代谢组学领域的应用越来越受到青睐。这种多平台方法可以对代谢组进行全面检测,并可为人们理解生物系统中差异代谢谱的意义提供有价值的信息。

Leon等[30]采用CE-TOF-MS和傅里叶变换离子回旋共振质谱法(Fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometry,FT-ICR-MS)结合的方法研究了3种转基因玉米及其对应的野生型品种的代谢差异。上机之前采用加压溶剂萃取(pressurized liquid extraction,PLE)对被测物品进行提取和分离。由于FT-ICR-MS不能区分不同异构体之间的结构,所以采用CE-TOF-MS对化合物进行识别,两者的结合大大提高了筛选新的生物标志物的效率,并且FT-ICR-MS的超高分辨率和灵敏度刚好弥补了CE-TOF-MS重复性较差且灵敏度很低的缺点。结果发现与野生型品种比较转基因品种的某些代谢途径被改变,存在代谢差异。这是首次报道采用CE-TOF-MS,FT-ICR-MS和PLE三者结合的方法研究转基因作物。为了研究转基因番木瓜的潜在非预期成分变化,Jiao Zhe等[31]采用HPLC,GC-MS和LC-MS对转基因番木瓜和非转基因番木瓜的一些特定成分进行了分析,发现二者的这些特定成分含量相似,但是不同时期收获的木瓜表现出更高程度的成分变化。此外,Jiao Zhe等[32]还采用近红外光谱法(near-infrared reflectance,NIR)、GC-MS、HPLC和电感耦合等离子体发射光谱(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy,ICP-AES)并结合化学计量学方法对3种抗逆转基因水稻进行了代谢组学研究,发现转基因水稻发生了一些非预期的成分变化,营养物质如蛋白质、3种氨基酸、两种脂肪酸、两种维生素以及几个元素都发生了不同程度的变化,而抗营养因子肌醇六磷酸没有显著改变。Kusano等[33]也采用多平台方法评估了转基因番茄。为了减少化学偏倚,研究者通过GC-MS、LC-MS和CE-MS等多种仪器采集数据,没有发现非预期的代谢变化。

4 结 语

代谢组学作为一种高通量、高灵敏度、高精确度的现代分析技术,近年来被广泛应用于转基因作物的非预期评价中,它可以为转基因食品的安全性评价提供有力的科学依据。但是,代谢组学仍面临着许多挑战和亟待解决的关键问题。首先,在实验设计与分析方面没有一致性,很多已经发表的关于观察到转基因作物与传统作物存在差异性的研究都缺少生物验证,甚至没有生物重复实验。因此,迫切需要建立一个标准来规范和报告实验设计与分析的细节[34-35]。其次,代谢组学的终极目标是检测鉴定机体内的所有代谢产物,但目前所广泛采用的仪器设备几乎做不到这一点,即使能检测到,往往也鉴定不了化学结构。面临这些瓶颈问题,开发灵敏度高、检测范围广的检测技术,建立并扩展代谢产物鉴定数据库是代谢组学在未来的主要发展方向[36]。此外,任何一种组学技术平台的单独使用提供的信息都是有限的,不同组学技术间的数据整合将会提供更多的信息,如何整合不同组学技术平台和不同组学技术的数据将会是一个重要挑战[37]。在以后的研究中,将需要更灵敏的技术以检测更大范围的非预期效应。定向方法与非定向方法的结合可能会是评价转基因作物生物安全性的更好的方法。

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收稿日期:2013-05-17

基金项目:农业部转基因生物新品种培育国家重大科技专项(2011ZX08011-005)

作者简介:王森(1984—),女,硕士研究生,研究方向为食品检验技术及代谢组学。E-mail:644326653@163.com

*通信作者:杜晓燕(1954—),女,教授,学士,研究方向为生物传感器及生物、食品检验技术。E-mail:duxiaoyanha@163.com