响应面法优化提高发酵桑叶茶中
1-脱氧野尻霉素含量工艺

肖 洪1,黄先智2,沈以红2,丁晓雯1,*,秦樱瑞1,曾艺涛1,杨 娟1,丁顺杰1,商 桑1

(1.西南大学食品科学学院,重庆市农产品加工重点实验室,重庆 400715;

2.家蚕基因组生物学国家重点实验室,重庆 400715)

 

摘 要:为优化提高发酵桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量工艺,采用响应面分析法,以发酵温度、发酵时间及接种量为自变量,1-脱氧野尻霉素含量为响应值,设计三因素三水平响应面回归分析。结果表明:提高发酵桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量工艺的最佳工艺条件为发酵温度30 ℃、发酵时间5.6 h、黑曲霉日本根霉绿色木霉=212菌液接种量3.75×107 CFU/100 g,在此条件下发酵桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量为133.882 mg/100 g。

关键词:发酵;桑叶茶;1-脱氧野尻霉素;响应面分析

 

Optimization of Fermentation Conditions for Enhanced 1-Deoxynojirimycin Content in Fermented
Mulberry Leaf Tea by Response Surface Methodology

 

XIAO Hong1, HUANG Xian-zhi2, SHEN Yi-hong2, DING Xiao-wen1,*, QIN Ying-rui1,
ZENG Yi-tao1, YANG Juan1, DING Shun-jie1, SHANG Sang1

(1. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, College of Food Science, Southwest University,

Chongqing 400715, China; 2. State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China)

 

Abstract: Response surface methodology was used to optimize the fermentation conditions for producing fermented mulberry leaf tea with higher 1-deoxynojirimycin (1-DNJ) content. The 1-DNJ content was investigated with respect to fermentation temperature, fermentation time and inoculum amount by response surface regression analysis. The optimum fermentation conditions that provided a 1-DNJ content of 133.882 mg/100 g dry weight of fermented mulberry leaf tea were determined as 30 ℃, 5.6 h, a ratio of Aspergillus niger to Rhizopus japonicus Vuillemin to Trichoderma viride of 2:1:2, and an inoculum amount of 3.75×107 CFU/100 g.

Key words: fermentation; mulberry leaves; 1-deoxynojirimycin (1-DNJ); response surface analysis

中图分类号:S886.9 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)10-0046-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410009

桑叶茶是由桑叶加工制作而成的新型茶品,目前一般采用直接烘干或自然发酵的方式生产。桑叶绿茶甘醇香甜;桑叶乌龙茶爽口醇和,有淡淡的花香;桑红茶甘甜醇厚,有近似香蕉的果香味[1]。但桑叶绿茶普遍存在汤色发黑,豆腥味重,感官品质不佳的问题,为此,人们尝试开发桑叶乌龙茶、红茶等产品。桑叶茶的主要功能成分包括γ-氨基丁酸 [2-3]、褪黑激素[4]、黄酮苷[5-6]、α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制剂[7],以及生物碱、茶多酚、花青素、绿原酸、白藜芦醇、氧化芪三酚、β-胡萝卜素等生物活性成分[8-9]。黄酮类物质具有降血压、抗氧化、防癌、抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等生理作用[10]。桑叶中含有的多糖具有显著的降血糖作用[11],可以抑制α-葡萄糖苷酶和猪胰液α-淀粉酶的活性[12]等作用。桑叶茶的矿物元素含量比茶叶高出3~6 倍;总糖、酚类物质、氨基酸含量都较高;同时桑叶叶面较薄,比茶叶易溶解出更多的有效成分,有利于人体的吸收[13]。

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,1-DNJ)是一种极性含N化合物,其化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶,分子式为C6H13NO4,相对分子质量为163[14-15],是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂,具有降血糖[16-17]、降血脂[18-19]、抗肿瘤[20]、抑制变形链球菌生长[21]、抗病毒[22]等功效。桑叶是植物中1-DNJ含量比较高的,但不同叶位、加工工艺等诸多因素都可能影响到桑叶茶中1-DNJ的含量[23-24]。

前期实验研究发现黑曲霉、日本根酶、绿色木霉复合发酵得到的桑叶茶综合品质好,且菌种比例为黑曲霉日本根霉绿色木霉=212时发酵桑叶茶品质最优。本实验旨在研究不同发酵条件对发酵桑叶茶中1-DNJ含量的影响,并用响应曲面优化提高发酵桑叶茶中1-DNJ的工艺条件,为桑叶的深度开发利用提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种

黑曲霉(Aspergillus niger,GSICC 60108) 甘肃省微生物菌种保藏中心;日本根霉(Rhizopus japonicus Vuillemin,GIM3.119)、绿色木霉(Trichoderma viride,GIM3.443) 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心;以上3 种菌种的安全等级均高,其生物危害程度为4 类,在通常情况下不会引起人类或者动物疾病。

1.1.2 实验样本

采摘的桑品种为湖桑,种植与于西南大学桑园;人工发酵桑叶茶由本实验室自制。

1.2 试剂与仪器

1-DNJ标准品 北京德威钠生物技术有限公司;甘氨酸(Gly)、9-芴基氯甲酸甲酯(9-fluorenylmethyl chloroformate,FMOC) 美国Sigma公司;乙腈(色谱纯) 天津市四友精细化学品有限公司;其他常用试剂均为分析纯。

1525高效液相色谱仪 美国Waters公司;5810型台式高速离心机 德国Eppendorf公司;旋涡混合器 上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵桑叶茶的制备

采摘从顶芽往下数4~10 片的新鲜桑叶,去柄,切为4 cm×4 cm的小叶片,混匀后称取100 g叶片用微波杀青90 s,揉捻,研究发酵条件(发酵温度、发酵时间、菌接种量)对黑曲霉+日本根酶+绿色木霉菌液10 mL,复揉,不同温度条件下发酵不同时间,微波干燥,制得桑叶茶。

本实验开始的时间为2012年11月上旬,因为桑叶的季节性,在每年11月底需要对桑树进行剪枝,且桑叶在4 ℃保存时间较短,在-18 ℃保存解冻后会造成大量的汁液流失,导致单因素试验中所用原料湖桑桑叶采摘时间为2012年11月初,而工艺优化所用原料湖桑桑叶采摘时间为2013年5月初。

1.3.2 1-DNJ的HPLC法测定

准确称取20 mg 1-DNJ标准品,将其在烧杯中溶于少量水中,移入25 mL容量瓶,冲洗烧杯和玻璃棒5 次并移入容量瓶,加超纯水定容至25 mL,即得0.8 mg/mL的1-DNJ标准溶液。用时将1-DNJ标准液配制成质量浓度为60、120、180、240、300、480 μg/mL备用。

1-DNJ的提取:精确称取待测样品0.5 g,加入35 mL超纯水,80 ℃水浴浸提2 h(每20 min摇匀一次),抽滤后,用超纯水定容至50 mL,即得样品提取液。

1-DNJ衍生化:取1-DNJ提取液(或1-DNJ标准液)300 μL于5.0 mL的离心管,加入0.4 mol/L硼酸钾缓冲液(pH 8.5)300 μL,再加入5 mmol/L的FMOC-Cl(溶解于乙腈中)600 μL,混匀后,25 ℃水浴20 min。加入1 mol/L
的甘氨酸300 μL中和剩余的FMOC-Cl以终止反应,加入体积分数1%的醋酸液300 μL及超纯水1 200 μL稀释,8 000 r/min离心20 min,以0.45μm微孔滤膜过滤器过滤,收集滤过液备测。

空白实验:以蒸馏水代替样品,空白对照衍生化反应以蒸馏水代替进行衍生化反应。

色谱条件:色谱柱:C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);紫外检测器;检测波长:254 nm;流动相:乙腈-0.1%醋酸(5050,V/V);流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10 μL

1.3.3 响应面试验

提高发酵桑叶茶中1-DNJ工艺优化响应面分析试验因素与水平设计见表1。

表 1 响应面试验因素水平表

Table 1 Independent variables and their coded values tested in response surface analysis

水平

因素

X1发酵温度/℃

X2发酵时间/h

X3接种量/(107 CFU/100 g)

-1

0

1

25

30

35

5

6

7

2

4

6

 

 

1.4 数据统计与分析

各实验至少重复3 次以上,实验数据用Excel和Design Expert 8.05b进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 1-DNJ标准曲线线性回归方程、相关系数及色谱图

按照1.3.2节的实验方法,对不同质量浓度1-DNJ标准溶液进行测定,以峰面积y为纵坐标,1-DNJ质量浓度x(μg/mL)为横坐标,得到1-DNJ的标准曲线线性回归方程为y=15 776x-70 392,相关系数r=0.999 6。

将空白、1-DNJ标准品、桑叶茶样品经衍生化后上高效液相色谱仪进行测定,分别得到如图1所示色谱图。

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DNJ-FMOC. 1-DNJ衍生物;Gly-FMOC. 9-芴基氯甲酸甲酯和甘氨酸衍生物;FMOC-OH. 9-芴甲醇。

图 1 空白(a)、1-DNJ标准品(b)和桑叶茶样品(c)色谱图

Fig.1 Chromatograms of blank sample (a), 1-DNJ standard(b) and mulberry leaf tea sample (c)

由色谱图1可知,在本实验条件下,1-DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留时间为2.731 min,与Gly-FMOC和FMOC-OH的峰间距分别相差2.719 min和4.243 min,表明这两种物质均不干扰1-DNJ的测定。

2.2 1-DNJ的检测分析

对实验中所用的3 种菌种单一和复合接种于不添加桑叶的马铃薯培养基,在培养基中未检测到1-DNJ。2013年5月初做响应面优化试验时测得桑叶中1-DNJ含量为119.986 mg/100 g。

2.3 单因素对发酵桑叶茶中1-DNJ含量的影响

2.3.1 发酵温度

取100 g桑叶分别在25、30、35、40、45、50 ℃条件下加入107CFU的黑曲霉日本根霉绿色木霉=212的菌液10 mL发酵5 h生产桑叶茶,探究发酵桑叶茶中1-DNJ含量的变化。

由图2可知,随着发酵温度的升高,发酵桑叶茶中的1-DNJ含量先增加后降低,然后又略有增加,在25~50 ℃条件下,随着温度的变化,1-DNJ含量没有规律性的变化,可能与使用3 种菌种进行复合发酵有关,因为不同菌种的最适生长温度略有差别。桑叶茶发酵的一种可能是以酶为催化剂的生物转化反应过程,合适的发酵温度才能确保酶促反应的顺利进行,温度过低会降低酶的活性,温度过高会使酶失活。温度为30 ℃时发酵桑叶茶中1-DNJ含量最高,这可能是因为30 ℃为3 种复合菌种的最适生长和产酶温度,更利于1-DNJ的产生;但在发酵温度为40 ℃以后1-DNJ含量略有增加,但没有0 ℃时得到的1-DNJ含量高,这可能是高温一定程度的抑制了菌种的生长和酶活,另外可能是桑叶为微生物生长提供所需的碳源或氮源。由此确定发酵温度为30 ℃最佳。

567165.jpg 

图 2 不同发酵温度条件下发酵桑叶茶中1-DNJ含量

Fig.2 Effect of fermentation temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

2.3.2 发酵时间

取100 g桑叶分别在25 ℃条件下加入107 CFU的黑曲霉日本根霉绿色木霉=212的菌液10 mL发酵1、2、3、4、5、6、7 h、生产桑叶茶,探究其1-DNJ含量的变化。

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图 3 不同发酵时间条件下发酵桑叶茶中1-DNJ含量

Fig.3 Effect of fermentation time on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

由图3可知,随着发酵时间的延长,发酵桑叶茶中的1-DNJ呈现出先缓慢增加然后降低的趋势,在发酵6 h时发酵桑叶茶中的1-DNJ含量最高,之后1-DNJ含量又逐渐降低,所以选择发酵时间为6 h较为合适。

2.3.3 菌接种量

取100 g桑叶分别在25 ℃条件下加入0.5×107、1×107、2×107、4×107、6×107、8×107、10×107 CFU的黑曲霉日本根霉绿色木霉=212的菌液10 mL发酵5 h生产桑叶茶,探究其1-DNJ含量的变化。

由图4可知,适宜的接种量以4×107 CFU/100 g为宜。在接种量低于4×107 CFU/100 g时,发酵桑叶茶中的1-DNJ含量随接种量的增加呈上升的趋势,接种量超过4×107 CFU/100 g时,发酵桑叶茶中的1-DNJ含量明显降低。这可能是由于在接种量较低时,菌种自身繁殖代谢慢,发酵不彻底,发酵桑叶茶中的1-DNJ含量低;但当接种量大于6×107 CFU/100 g时,随着接种量的增大,发酵桑叶茶中的1-DNJ含量又略有增加,这可能与使用3 种菌种进行复合发酵有关,具体原因需要进一步的探究。所以选择接种量为4×107 CFU/100 g。

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图 4 不同菌接种量下发酵桑叶茶中活性成分含量

Fig.4 Effect of inoculum amount on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

2.4 回归模型的建立及显著性检验

按照表1试验方案进行三因素三水平试验,结果见表2。将所得的试验数据采用Design Expert 8.05b软件进行多元回归拟合,得到以1-DNJ含量为目标函数的二次回归方程。1-DNJ含量对发酵温度X1、发酵时间X2、接种量X3二次多项回归方程为:

Y=-100.947 10+12.583 29X1+16.005 43X2+2.579 05X3+0.358 10X1X2+0.370 93X1X3-0.768 38X2X3-0.271 50X12-2.116 40X22-1.22954X32

为检验方程的有效性,对1-DNJ含量的数学模型进行方差分析,结果见表3。由表3可知,一次项X1、X2、X3中X2、X3极显著(P<0.01),说明发酵时间、接种量对发酵桑叶茶中1-DNJ含量有极显著影响。交互项X1X2、X1X3、X2X3均显著(P<0.05)说明发酵温度和发酵时间、发酵温度和接种量、发酵时间和接种量对发酵桑叶茶中1-DNJ含量有显著影响。二次项X12、X22、X32均具有极显著差异(P<0.01)。二次回归模型的F值为44.57,P<0.01,说明该模型极显著,失拟项P值大于0.05,表明失拟不显著,模型的修正相关系数平方R2Adj=0.960 8,说明该模型能反映96.08% 响应值的变化,因而该模型拟合程度较好,试验误差小,较好地反映了1-DNJ含量与发酵温度、发酵时间、接种量的关系,因此可以用此模型对发酵桑叶茶中1-DNJ含量进行分析和预测。

表 2 1-DNJ工艺优化响应面分析试验设计及结果

Table 2 Experimental design and corresponding results for
response surface analysis

试验号

X1

X2

X3

1-DNJ含量/(mg/100 g)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

-1

-1

-1

-1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1

1

1

-1

1

0

0

-1

1

-1

1

0

0

0

0

0

-1

1

0

0

0

0

-1

1

-1

-1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

-1

1

123.307

121.921

126.483

116.429

128.330

127.321

128.121

120.965

132.591

132.797

131.851

134.086

134.769

123.128

123.904

119.179

123.962

 

表 3 1-DNJ含量回归方程方差分析表

Table 3 Analysis of variance for the regression model for
1-DNJ content

变异源

平方和

自由度

均方

F

P

模型

463.53

9

51.50

44.57

<0.000 1**

X1

X2

X3

X1X2

X1X3

X2X3

X12

X22

X32

残差

失拟项

纯误差

总和

1.10

23.72

17.51

12.82

55.03

9.45

193.97

18.86

101.85

8.09

2.49

5.60

471.62

1

1

1

1

1

1

1

1

1

7

3

4

16

1.10

23.72

17.51

12.82

55.03

9.45

193.97

18.86

101.85

1.16

0.83

1.40

 

0.95

20.52

15.15

11.10

47.62

8.17

167.84

16.32

88.13

 

0.59

 

 

0.361 7

0.002 7**

0.006 0**

0.012 6*

0.000 2**

0.024 4*

<0.000 1**

0.004 9**

<0.000 1**

 

0.651 6

 

注:*.差异显著(P<0.05);**.差异极显著(P<0.01)。确定系数R2=0.982 8,调整确定系数R2Adj=0.960 8。

 

2.5 各因素交互作用响应面分析

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图 5 发酵时间与发酵温度交互作用对1-DNJ含量影响

Fig.5 Interactive effects of fermentation time and temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

从图5可以看出,当接种量为4×107 CFU/100 g时,发酵温度和发酵时间的交互作用显著影响发酵桑叶茶中1-DNJ含量。在发酵时间一定的情况下,随着发酵温度的升高,发酵桑叶茶中1-DNJ含量均呈现出先增加后降低的趋势。发酵温度大于30 ℃时,随着发酵温度的升高发酵桑叶茶中1-DNJ含量降低,可能30 ℃是3 种复合菌种的最适生长和产酶温度。

572614.jpg 

图 6 接种量与发酵温度交互作用对1-DNJ含量影响

Fig.6 Interactive effects of inoculum amount and fermentation temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

从图6可知,当发酵时间为6 h时,发酵温度和接种量的交互作用显著影响发酵桑叶茶中1-DNJ含量。在发酵温度一定的情况下,随着菌接种量的提高,发酵桑叶茶中1-DNJ含量均呈现出先增加后降低的趋势。菌接种量大于4×107 CFU/100 g时,随着菌接种量的增加发酵桑叶茶中1-DNJ含量降低,这可能是接种量过大时,菌种繁殖旺盛,需要消耗大量桑叶中的营养成分和生物活性物质分来完成自身代谢。

572630.jpg 

图 7 接种量与发酵时间交互作用对1-DNJ含量影响

Fig.7 Interactive effects of inoculum amount and fermentation time on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

从图7可以看出,当发酵温度为30 ℃时,发酵时间和菌接种量的交互作用显著影响发酵桑叶茶中1-DNJ含量。当发酵时间大于6 h时,随着发酵时间的增加发酵桑叶茶中1-DNJ含量降低。

2.6 最佳工艺条件的确定和实验验证

通过对二次回归模型的分析,可以确定提高发酵桑叶茶中1-DNJ含量的最佳工艺条件为发酵温度29.41 ℃、发酵时间5.59 h、接种量3.74×107 CFU/100 g,在该工艺条件下,模型预测的发酵桑叶茶中1-DNJ含量为133.689 mg/100 g。为便于实际应用,取发酵温度30 ℃、发酵时间5.6 h、接种量3.75×107 CFU/100 g,在此条件下进行验证实验,得发酵桑叶茶中1-DNJ含量为133. 882 mg/100 g,此数值与模型预测值的相对误差为1.443%,预测精度较高,说明此模型可靠。

3 结 论

响应面法获得的提高发酵桑叶茶中1-DNJ含量的最佳工艺参数为发酵温度30 ℃、发酵时间5.6 h、接种量3.75×107 CFU/100 g,发酵桑叶茶中1-DNJ含量为133.882 mg/100 g,与桑叶中1-DNJ含量(119.986 mg/100 g)比较,经发酵后桑叶茶中的1-DNJ含量有一定的提高,发酵所得的桑叶茶营养丰富,开发前景广阔。

由于桑叶的季节性,对本实验结果造成了一些误差;其次,与桑叶对比可知经发酵后桑叶茶中1-DNJ含量增加不是特别显著,在今后的研究中本课题组会用更多的菌种进行实验,以期能得到提高发酵桑叶茶中1-DNJ含量的优势菌种。

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收稿日期:2013-07-03

基金项目:国家现代农业(蚕业)产业技术体系建设专项(CARS-22-ZJ0503);重庆市科委应用技术项目(cstc,2012gg-yyjs80022)

作者简介:肖洪(1989—),男,硕士研究生,研究方向为食品安全与质量控制。E-mail:xiaohong463108359@163.com

*通信作者:丁晓雯(1963—),女,教授,博士,研究方向为食品安全与功能食品。E-mail:xiaowend@sina.com