白鲢鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺优化

刘 闪，刘良忠*，李小娜，刘 亮，王 燕

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，武汉市水产品加工工程技术研究中心，湖北 武汉 430023）

摘 要：为减少淡水鱼加工过程中副产物对环境的污染和资源的浪费、提高淡水鱼的附加值，对白鲢鱼骨制备胶原多肽螯合钙的工艺进行研究。以白鲢鱼骨和氯化钙为原料，在一定条件下制备胶原多肽螯合钙，考察温度、鱼骨胶原多肽与氯化钙的质量比、时间、pH值对螯合率和螯合物中钙含量的影响。根据单因素试验结果，对胶原多肽螯合钙工艺进行四因子二次正交旋转设计优化，得到鱼骨胶原多肽螯合钙的最佳工艺参数为温度42 ℃、时间38 min、鱼骨胶原多肽与氯化钙的质量比2.1∶1、pH 6.8，此条件下的螯合率和螯合物中的钙含量分别为80.4%和12.1%。对螯合钙进行氨基酸组成成分分析，其总氨基酸含量为61.03%，且具备典型的胶原蛋白氨基酸组成特征。红外光谱扫描和电镜扫描观察表明：钙离子与胶原多肽发生了螯合反应，结合方式有离子结合、配位结合和吸附作用。

关键词：鱼骨；胶原多肽；螯合钙

Optimization of the Preparation of Calcium-Chelating Polypeptides from Silver Carp Bone Collagen

LIU Shan, LIU Liang-zhong*, LI Xiao-na, LIU Liang, WANG Yan

(Aquatic Products Engineering and Technology Research Center of Wuhan City, College of Food Science and Engineering,
Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract: In order to achieve value-added utilization of byproducts of freshwater fish processing and simultaneously reduce environmental pollution and resource waste, silver carp bone was used as the raw material to prepare calcium-chelating collagen polypeptides. Under given conditions, calcium binding capacity and chelated calcium content were investigated as a function of reaction temperature, mass ratio between bone collagen polypeptides and calcium chloride (P/C), time and pH. On the basis of the results of single-factor experiments, the four reaction parameters were optimized by a four-factor quadratic orthogonal rotational combination design to be 42 ℃, 38 min, a P/C ratio of 2.1:1 and pH 6.8, yielding a calcium binding capacity of 80.4% and a chelated calcium content of 12.1%. Amino acid composition analysis showed that the calcium-chelating collagen polypeptides obtained contained 61.03% amino acids in total and had typical amino acid composition characteristics. Infrared spectroscopic analysis and scanning electron microscopy observation confirmed the chelating reaction between calcium ion and collagen polypeptides by ionic bonding, coordination or adsorption.

Key words: fish bone; collagen peptide; chelated calcium

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）10-0076-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410014

我国渔业养殖产量占全球养殖产量的70%，2010年中国水产总量达到5373万 t，其中淡水鱼养殖产量为2346.53万 t，草鱼产量422.22万 t，位居首位；其次是白鲢鱼，产量为360.75万 t[1]。随着我国渔业的发展，水产品加工也越来越引起人们的重视。白鲢鱼为我国典型的淡水养殖经济鱼类，占水产养殖总量的25%左右，主要用于淡水鱼糜的加工。加工过程产生大量的废弃物，约占鱼体质量的40%左右，其中废弃鱼骨在废弃物总量中所占比例近50%。鱼骨中含有大量的Ca、Fe、Zn、Mg、P及胶原成分是开发鱼骨钙产品及鱼类胶原低聚肽的良好资源[2-3]。陆剑锋等[4]以斑点叉尾鮰鱼鱼骨制备胶原多肽，并与氯化钙进行螯合，制备胶原多肽螯合钙。余海霞等[5]以鮟鱇鱼骨为原料，利用酶法超微钙粉技术制备鱼骨超微钙粉，并对其进行了生物利用率的研究。Morimura等[6]利用酶解法从鱼骨中提取胶原蛋白，其具有降血压的功能，可以添加到食品中。Jung等[7]以鳕鱼骨为原料制备的鱼骨磷酸肽，并与钙进行螯合，得到的螯合钙进行小鼠实验，证明其可以防止小鼠体内矿物质的流失。

近年来，我国居民钙营养不足的问题受到了广泛的重视。营养调查表明，我国居民钙摄取量普遍偏低，人均每日钙摄入量仅为钙的推荐供给量的50%左右[8]。目前市场上补钙产品主要为无机钙制剂和有机钙制剂2种。补钙效果与钙的吸收和其在骨骼中的沉积效果有关。高品质的补钙剂须达到吸收率高、易在骨骼中沉积且无毒副作用的要求。研究表明，胶原占骨质总量的80%，胶原的流失是骨病发生的主要原因之一 [9-10]。只有补钙的同时补充足够的胶原，才能保证骨骼成分的合理比例，防治骨类疾病的发生[11]。因此，以鱼骨为原料，研究开发胶原蛋白肽螯合钙具有重要的意义。

本研究以酶解法制备的白鲢鱼骨胶原多肽液，向其加入钙源，制备白鲢鱼骨胶原多肽螯合钙。通过单因素试验与四因子二次正交旋转设计优化，确定最佳的工艺参数。利用高效液相对螯合钙进行氨基酸组分分析，通过红外光谱和电镜扫描，确定胶原多肽与钙发生了化学反应，有新物质产生，为新型补钙产品的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钙（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯） 天津市化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯） 天津市百世化工有限公司；盐酸（分析纯） 中国平煤神马集团开封东大化工有限公司试剂厂；乙二胺四乙酸二钠、三乙醇胺（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；铬黑T（分析纯） 天津市河东区红岩试剂厂；盐酸羟胺（分析纯） 天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

pHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司；7200型分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；AR214O Adventure电子分析天平 美国Ohaus公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州科丰仪器设备有限公司；旋转真空蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥机 美国Labconco公司；1100型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Nicolet 6700傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司；S-3000N扫描电镜 日本
Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼骨胶原多肽酶解液的制备

取清洗干净、经80 ℃鼓风干燥箱烘干8 h的鱼骨30 g，磨粉后过60 目筛，用5.9%盐酸浸泡、搅拌、脱钙（30 min，43 ℃，料液比1∶5.5（mg/mL），脱钙率达到80%以上）；碱性蛋白酶（20AU/g）酶解（料液比1∶30（mg/mL），温度50 ℃，时间4 h，用1.0mol/L氢氧化钠、1.0 mol/L盐酸调节pH 9.0，加酶量5%（m/m）），100 ℃灭酶5 min，4 000 r/min离心10 min后，调节pH值至6，40 ℃条件下活性炭吸附40 min（添加量3%（m/m）），采用0.22 μm滤膜过滤（0.1 MPa，常温）后浓缩（45 ℃，0.1 MPa），制得鱼骨胶原多肽酶解液。

1.3.2 鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺流程

酶解液→调整螯合条件→加入适量氯化钙→乙醇沉淀（乙醇含量达到90%以上，静置沉淀3 h）→微滤→真空冷冻干燥（－50 ℃，4.0 Pa，72 h）

1.3.3 检测方法

钙含量的测定：采用EDTA络合滴定法[12]。按式（1）计算螯合物中钙含量：

（1）

螯合率的测定：移取5 mL待测液，加入无水乙醇沉淀（乙醇含量达到90%），静置3 h，微滤；将滤液再次浓缩后进行乙醇沉淀（乙醇含量达到95%以上）静置3 h，微滤，取滤液测定游离钙含量，按式（2）计算螯合率。

（2）

可溶性多肽的测定：Folin-酚法[13]。

1.3.4 单因素试验

根据单一因素对胶原螯合钙工艺参数的相关研究[15-19]，在水系中合成胶原多肽螯合物时，影响合成反应的主要因素有：pH值、反应时间、温度、质量比等。因此，试验以pH值、反应时间、温度、质量比为考察因素。

1.3.4.1 最佳质量比的确定

多肽与钙离子的结合有一定的配位比，设定pH 7.0、时间50 min、温度50 ℃条件下，选择酶解液中蛋白质与氯化钙的质量比为0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标确定最佳的质量比。

1.3.4.2 最佳pH值的确定

设定质量比为2∶1、时间50 min、温度50 ℃，选择pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标确定最佳的pH值。

1.3.4.3 最佳螯合时间的确定

设定质量比为2∶1、pH值7.0、温度50 ℃，选择时间为20、30、40、50、60、70 min，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标确定最佳的螯合时间。

1.3.4.4 最佳螯合温度的确定

设定质量比为2∶1、pH值7.0、时间50 min，选择温度为30、40、50、60、70 ℃，以螯合率和螯合物中的钙含量为指标确定最佳的螯合温度。

1.3.5 四因子（1/2实施）二次回归正交旋转设计优化螯合工艺

在单因素试验的基础上，以螯合率和螯合物中钙离子含量为指标，采用四因子二次正交旋转设计，取3次平行测量的平均值，利用SPSS软件进行回归分析。试验的因素水平编码见表1。

表 1 因素水平编码表

Table 1 Factors and levels used in quadratic orthogonal rotational combination design

注：*. 星号臂长度，二次回归正交旋转组合设计时，四因素1/2实施，23个试验，9次零水平试验，经查表知r=1.682或者r=－1.682。

1.3.6 螯合物中氨基酸组成成分分析

用高效液相色谱仪测定样品氨基酸组成。取适量的胶原多肽螯合钙冻干粉样品，用6 mol/L HCl在110 ℃水解24 h，过滤、蒸干，再溶解并定容至50 mL容量瓶，作为测定氨基酸组成用的分析样。

1.3.7 傅里叶红外光谱分析

取适量的胶原多肽螯合钙冻干粉样品，在4 000～400 cm－1波段内用傅里叶红外光谱仪对样品进行扫描，分辨率0.1 cm－1。

1.3.8 扫描电镜分析

将适量的胶原多肽螯合钙冻干粉样品均匀涂于样盘双面胶上，喷金镀膜处理。处理好的样品放入扫描电镜抽真空，施加一定电压后，在4 000 倍下获取扫描图像。电镜扫描条件：高压15 kV；束流6.9×10－2 mA；工作距离16.2 mm。

1.4 数据处理

利用SPSS进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质与氯化钙质量比

图 1 酶解液中蛋白质与氯化钙的质量比对螯合率和
螯合物中钙含量的影响

Fig.1 Effect of protein to CaCl2 mass ratio on chelating capacity and chelated calcium content

由图1可以看出，酶解液中蛋白质与氯化钙的质量比对螯合率和螯合物中钙含量有非常显著的影响。配位体质量过高，肽的利用率下降，配位体过低，螯合物不稳定[20]。在质量比为0.5∶1时，尽管螯合物中钙含量比较高，但螯合率比较低，很多钙离子未参与螯合反应。随着质量比的不断增加，螯合率不断升高，当质量比达到2∶1后，变化的幅度逐渐缩小，说明配体质量比的增大有利于螯合反应的充分进行。当配体的质量比进一步增加，螯合物中钙含量降低，说明有多余的胶原多肽未被螯合，降低了胶原多肽的利用率。因此，选择质量比为2∶1较为合适。这一结果与单体氨基酸螯合物有些差别，可能是由于胶原蛋白水解物作为配体，其组成成分复杂，既有氨基酸，又有不同分子质量的多肽。因此，该配体与钙的螯合反应不像氨基酸那样单一。

2.2 pH值

图 2 pH值对螯合率和螯合物中钙含量的影响

Fig.2 Effect of pH on chelating capacity and chelated calcium content

由图2可知，pH值对于螯合率和螯合物中钙含量有较大影响，酸性条件和碱性条件下螯合率相对较低。其原因可能是当溶液中H＋大量存在时，H＋将会与Ca2＋争夺供电子基团，羧基配位能力较弱，不利于螯合物的形成[21]；而在碱性条件下，OH－与供电子基团争夺钙离子而形成羟桥化物，从而生成了氢氧化钙沉淀[22]，经无水乙醇洗后被除去。在中性条件下，配体受H＋和OH－影响较小，提供了充分的供电子基团，从而有利于钙通过配位键形成螯合物[23]。洪惠[24]和赵妍焉[25]等分别利用鱼骨和猪骨制备胶原多肽螯合钙，研究pH值对螯合效果的影响，得出螯合反应的最佳pH值分别为8.0和7.9。本实验在pH值为8.0时，螯合率与螯合物中钙的含量最高。

2.3 螯合时间

由图3可知，螯合时间在30～50 min内，随着时间的延长，螯合率和螯合物中钙含量不断升高，随后螯合率和螯合物中钙含量不断下降，可能原因是在合适的温度下，螯合时间过短，反应不彻底，有大量的游离钙和配体；螯合时间过长，已经螯合的钙发生了解离，可能由于羰基与氨基发生了羰氨反应，减少了可以与钙发生螯合的羰基和氨基的数量。由此，可以进一步推理出，钙的螯合反应较羰氨反应更迅速，但与钙螯合的键的强度较羰氨反应的键的强度峰弱，但是这一机理还需要进一步的研究。该试验中，螯合时间在50 min时螯合率和螯合物中钙含量达到最大值。

图 3 时间对螯合率和螯合物中钙含量的影响

Fig.3 Effect of chelating time on chelating capacity and chelated calcium content

2.4 螯合温度

图 4 温度对螯合率和螯合物中钙含量的影响

Fig.4 Effect of chelating temperature on chelating capacity and chelated calcium content

由图4可知，螯合率和螯合物中钙含量在40 ℃时达到最大值，此后随着温度的升高，螯合率和螯合物中钙含量逐渐降低。反应温度过高，可能会使氨基酸或小肽发生羰氨反应，与钙离子形成竞争；反应温度过低则螯合反应速度过慢而且造成螯合效率降低 [26]。由于氨基酸或小肽与金属离子的螯合为吸热反应，因此适当的提高反应温度有利于提高多肽的溶解度使螯合反应顺利进行，选择温度为40 ℃时螯合效果最佳。

2.5 四因子（1/2实施）二次回归正交旋转设计

由表2可知，螯合率和螯合物中钙含量2个参考指标受质量比影响较大，两者具有负相关性。胶原多肽与氯化钙质量比增大，螯合率升高，螯合物中钙含量降低；反之，螯合率下降，螯合物中钙含量升高，且通过螯合率可以计算出螯合物中的钙含量。因此，选择其中1个指标进行回归分析。利用SPSS对螯合率进行回归分析，对数据进行二次回归拟合，结果见表3、4。

以螯合率为响应值，进行回归拟合，得到回归方程为Y=73.796＋12.261X1－0.684X2＋1.045X3－0.753X4－5.813X12－1.695X22－2.225X32－2.137X42，R值为9.458，
P＜0.01，表明回归方程有显著性意义。在回归方程的基础上进行规划求解，得到螯合率为80.5%，此时的质量比、时间、温度、pH值分别为2.1∶1、38 min、42 ℃、6.8。在此条件下进行验证实验，螯合率达到80.4%，螯合物中的钙含量为12.1%，说明该模型可以很好的预测结果。

表 2 四因子二次回归正交旋转设计结果

Table 2 The experiment results of quadratic orthogonal rotational combination design

表 3 回归系数估计值

Table 3 Estimated coefficients of the regression model

表 4 方差分析结果

Table 4 ANOVA

2.6 螯合物的氨基酸组成分析

表 5 螯合钙中氨基酸组分

Table 5 Amino acid composition of calcium-chelating collagen polypeptide

g/100g

在优化条件下制备的螯合钙经酸解进行氨基酸组成成分分析。由表5可知，螯合钙中的主要氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸等，而胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸含量相对较少。因此其符合典型的胶原蛋白氨基酸组成特征[27-28]。

2.7 胶原多肽及其螯合钙的红外光谱分析

图 5 胶原多肽与胶原多肽螯合钙红外光谱图

Fig.5 Infrared spectra of collagen peptide and its chelate with calcium

由图5可以看出，胶原多肽与钙螯合后图谱发生了移动。属于蛋白质红外光谱的酰胺A和酰胺B的谱带分别位于3 344 cm－1和3 074 cm－1波段处，主要由N—H的伸缩振动所致；一般认为，3 080 cm－1波段附近是多肽
（—CONH－）的特征吸收峰，而在2 970.63 cm－1波段出现了吸收峰，说明了胶原多肽具有多肽特征。而由C=O的伸缩振动引起的1 654 cm－1波段处的吸收峰属于酰胺Ⅰ带；1 558 cm－1波段处的吸收峰属于酰胺Ⅱ带，是由N—H
面内弯曲和部分的C—N伸缩振动产生的；1 447 cm－1波段处的吸收峰属于胶原多肽氨基酸残基的侧链基团，应是—COO－的吸收峰。由于胶原多肽的甘氨酸和特征氨基酸（羟脯氨酸和脯氨酸）含量高，且形成独特的Gly-Pro-Hyp序列，使得多肽在1 200～1 400 cm－1波段范围内具有其他蛋白质所没有的红外光谱特征，1 068.04 cm－1和1 388.83 cm－1波段处的吸收峰归属于酰胺Ⅲ带，是C—N伸缩和N—H弯曲振动的偶合，它与酰胺II带不同，主要以C—N伸缩振动为主；胶原多肽的特征氨基酸Hyp的特征吸收峰在1 121.33 cm－1和836.71 cm－1波段处也被表征出[26,28]。

对比胶原多肽的红外光谱图，可以发现胶原多肽与钙进行螯合后，整个波形发生了移动。在特征区，氨基的伸缩振动吸收峰（N—H）由3 344 cm－1移到3 299 cm－1，说明胶原多肽中的N—H键发生了化学变化；在指纹区，C=O的吸收峰移动到了1 661 cm－1，—COO－的吸收峰移至1 407 cm－1，说明氨基上的氮原子与羧基上的氧原子均参与了螯合反应，也说明反应产物确实为胶原多肽螯合钙，胶原多肽与钙发生了配位、离子结合反应。

2.8 胶原多肽及其螯合钙的电镜扫描结果

A

B

图 6 胶原多肽（A）及其螯合钙（B）的电镜扫描图

Fig.6 Scanning electron micrographs of collagen peptide and its chelate with calcium

由图6可以看到，胶原多肽螯合钙表面镶嵌着不少的白色晶体，应该是吸附在胶原多肽粉上面的钙晶体。付文雯[29]对牛骨胶原多肽螯合钙的电镜照片显示胶原多肽表面“镶嵌”着白色晶体，胶原多肽与钙之间有一定的吸附作用。因此，胶原多肽与钙之间的螯合反应除了有离子结合、配位结合，还有一定的吸附作用。

3 讨 论

本实验首次选用白鲢鱼骨制备胶原多肽，并与钙进行螯合，得到既能够补充人体胶原，又能补充钙的胶原多肽螯合钙。通过单因素和四因子二次正交旋转组合优化实验，得到胶原多肽液和钙离子的最佳螯合条件为：温度42 ℃、pH 6.8、时间38 min，胶原多肽与钙的配比为2.1∶1，此条件下的钙螯合率为80.4%，螯合物中钙含量为12.1%。此结果略低于杨燊[30]和陆剑锋[4]等分别对南海低值鱼蛋白和斑点叉尾鮰鱼骨胶原多肽与钙进行螯合（螯合率分别为81.75%和83.53%），明显高于黄薇等[31]利用复合酶解制备鳕鱼皮复合肽（其螯合率为58.85%），也高于彭巧云等[32]利用胶原多肽制备螯合钙（其螯合物中钙含量为7.77%）。产生这种差异的原因，可能是由于原料、制备的多肽氨基酸组分、分子质量不同，导致最佳螯合条件不同，使其螯合率有高低。

对螯合物进行氨基酸分析，具有典型的胶原蛋白氨基酸组成特征。红外光谱分析表明胶原多肽的氨基和羧基都与钙发生了配位、离子结合，胶原多肽与钙进行了成功的螯合。电镜扫描分析表明部分钙离子吸附在胶原多肽上，说明胶原多肽与钙离子也有一定的吸附作用。

胶原多肽螯合钙由骨胶原蛋白水解肽与钙离子螯合而成，在螯合过程中胶原蛋白肽除了与钙离子发生螯合作用外，同时还存在其他一些反应，如羰氨反应等，发生羰氨会减少与钙离子螯合的基团。多肽螯合钙的功能性、毒性和不同分子质量的吸收性能以及不同条件下不同分子质量螯合钙的溶解性和稳定性，可作为下一步研究的重点。

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