不同预处理方式对碱法提取米渣蛋白得率的影响

刘爱民，冯定山，张园园，卢存龙，曹圆圆

（安徽师范大学生命科学学院，生态环境与生态安全安徽省高校重点实验室，
重要生物资源的保护与利用研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241000）

摘 要：研究不同的预处理方式对碱法提取米渣蛋白得率的影响。结果表明：分别用质量分数0.5%柠檬酸或稀释20倍的醋酸（0.875 mol/L）对米渣在25 ℃处理180 min，再用0.1 mol/L NaOH溶液提取，温度50 ℃，提取时间27 h，则蛋白提取率有较大提高；蛋白质提取率分别为84.60%和80.1%，高于未经过酸处理的米渣蛋白提取率。质量分数为0.5%柠檬酸和稀释20 倍（0.875mol/L）的醋酸预处理的大米渣蛋白质经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，用体积分数18%分离胶有利于蛋白质电泳的分离；蛋白质在提取过程中分解成小的片段，主要集中在9.5 kD和4.1 kD附近，其中4.1 kD蛋白含量较多，且用质量分数0.5%柠檬酸预处理后碱法提取的蛋白质颜色纯白鲜亮，质地细腻润滑。

关键词：大米渣；预处理；蛋白质；提取率；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

Effect of Different Pretreatments on the Efficiency of Alkaline Extraction of Protein from Rice Residue

LIU Ai-min, FENG Ding-shan, ZHANG Yuan-yuan, LU Cun-long, CAO Yuan-yuan

(College of Life Sciences, Key Laboratories of Biotic Environment and Ecological Safety, Conservation and Utilization of Biological Resource in Anhui Province, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

Abstract: In this study, experiments were conducted to examine the effect of different pretreatments on the extraction efficiency of protein from rice residue using alkaline. The results showed the extraction efficiency of protein was increased largely compared to that without pretreatment, reaching 84.60% and 80.1%, respectively, when rice residue was soaked for 180 min in 0.5% citric acid or 0.875 mol/L acetic acid at 25 ℃ before being extracted at 50 ℃ for 27 h with 0.1 mol/L
NaOH. The rice proteins extracted from both pretreated samples were could be effectively separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) with 18% separating gel. During the extraction process, rice proteins were decomposed into fragments mostly having a molecular weight around 9.5 or 4.1 kD, especially around the smaller molecular weight. Moreover, the rice residue protein obtained with 0.5% citric acid pretreatment had a bright pure-white color and a smooth and delicate texture.

Key words: rice residue; pretreatment; protein; extraction efficiency; sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

中图分类号：Q819 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）10-0103-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410019

大米蛋白是一种优质植物蛋白，大米含有8%蛋白，按其溶解性分为清蛋白﹑球蛋白﹑醇溶蛋白[1]和谷蛋白，其中谷蛋白占80%以上。由于大米蛋白含量低，直接从大米中提取蛋白质的成本较高，经济性较差[2]。在以大米为原料发酵生产味精﹑葡萄糖等工业生产中仅用了大米中的淀粉，其中的大米蛋白没能得到很好地利用。大米经高温液化和糖化后得到的米渣，蛋白质含量约为50%，为原料大米蛋白质含量的5～7 倍[3]，是制备大米蛋白的理想原料[4]。米渣蛋白是热变性的大米蛋白，具有大米蛋白的一切优点，及良好的氨基酸组成配比，含有机体所需的必需氨基酸，尤其赖氨酸，具有口感温、低过敏性和降低胆固醇等优点[5]，从经济角度考虑，从米渣中制备大米蛋白更具经济性和实用性。大米蛋白主要是谷蛋白，在中性条件下溶解度较低，经过高温液化糖化后，米渣内部的蛋白溶解度进一步降低，限制了其在食品中的应用[6]。近年来已开始对米渣中蛋白质的提取进行研究，但由于米渣中蛋白质的溶解性极差，采用传统水溶液提取的方法很难将蛋白质提取出来，因此需要增加米渣蛋白的溶解度[7-8]。目前米渣主要用作饲料原料，而作为饲料原料出售价格低，经济效应不明显[9]。

大米蛋白的制备主要有碱溶酸沉法﹑酶法﹑物理分离法和排杂法等[10]。采用碱溶酸沉法可提取得到纯度相对较高的大米蛋白[11]，王亚林等[12]在pH 12、碱提2 h、温度40 ℃，蛋白质提取率可达49.9%，产品蛋白质含量为71.1%。酶法制备大米蛋白主要利用蛋白酶等对大米蛋白进行降解和修饰，使其变成可溶性肽后被提取出来[13]。顿新鹏等[14]提出酶法水解米渣中蛋白质制备小分子肽方法[15]，温度50 ℃﹑时间6 h水解条件下，蛋白质提取率能达63.4%。单纯使用碱法或酶法存在优劣，人们开始考虑采用复合提取方法，既保证产品质量和产率又尽可能地降低生产成本。陈季旺等[16]通过碱酶两步法从碎米中提取大米蛋白，大米蛋白提取率可达到70.22%，纯度为85.75%。排杂法是通过各种手段，尽量把各种非蛋白成分除去，最终获得高纯度的米渣蛋白。近几年有利用发酵法提高大米蛋白纯度的相关报道，纪凤娣等[17]对以乳酸菌发酵提纯大米蛋白的方法进行了探讨，并与水洗法和淀粉酶酶解法进行比较，结果表明，以乳酸菌发酵提纯大米蛋白效果最好，大米蛋白由初始的65%提高到89%，虽然发酵制备的大米蛋白纯度较高，但是发酵周期较长。Liao等[18]用醋酸来处理小麦谷蛋白去酰胺化，使得酶解更容易，口味更接近谷蛋白且营养更丰富。国内对米渣蛋白在食品应用的研究还处于初试阶段，所以前景很广阔[19-20]。

本实验采用大米渣为原料，在前人研究基础之上，改进方法，通过先弱酸处理后碱提取，使米渣蛋白改性，使之更易提取，提高其提取率和蛋白质纯度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米渣由某糖浆加工厂家提供大米渣干燥而成，其蛋白质含量经测定含量为58.2%。

氢氧化钠（分析纯）、95%乙醇（含量≥95%） 无锡市展望化工试剂有限公司；冰乙酸（含量99.0%，17.5 mol/L） 上海试剂一厂综合经营公司；三羟甲基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris，含量≥
99.0%） 上海惠兴生化试剂有限公司；无水柠檬酸（纯度≥99.5%）、丙烯酰胺（acrylamide，Acr，含量≥
99.9%）、N,N-亚甲基双丙烯酰胺（N,N’-methylene bis acrylamide，Bis，含量≥99.0%）、N,N,N,N,-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamin，TEMED，含量≥99.0%）、超低分子质量标准蛋白（Marker 4 100～66 000 D）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS，SB0485含量≥99.0%） 生工生物工程（上海）股份有限公司；考马斯亮蓝R250 上海化学试剂站分装厂。

1.2 仪器与设备

TDL80-2B台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造；HWS-28电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；KDN-O8消化炉 浙江托普仪器有限公司；Freezone 215L冷冻干燥机 USA LABCONCO公司；SKY-2102C恒温摇床 上海苏坤实业有限公司；DYY-Ⅲ24型垂直电泳槽 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米渣常规成分含量的测定

蛋白含量的测定：凯氏定氮法（固体总蛋白）[21]和GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》方法；脂肪的测定：索氏抽提法[22]和GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》方法；还原糖和总糖的测定：DNS法[23]。

1.3.2 柠檬酸和醋酸对米渣蛋白预处理

米渣先经过研磨处理，然后过100 目筛子处理，收集粒度为0.15 mm的米渣，称取米渣分为11份，每份3 g于烧杯中，分别加入质量分数0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%柠檬酸和稀释0、2、5、10、20倍醋酸（即浓度为17.5、8.75、3.5、1.75、0.875 mol/L）各10 mL，另外一组作为对照不做任何预处理。混合并适当搅拌，在25 ℃条件下处理60、90、120、180、240 min等不同时间，再将米渣用纱布过滤去酸，置于65 ℃烘干米渣，取0.2 g加入0.1 mol/L NaOH溶液10 mL，放入50 ℃水浴锅中慢慢搅拌均匀，处理27 h，使蛋白质在碱性状态下溶解。3 000 r/min离心20 min，分离去渣，取蛋白液加入0.1 mol/L的盐酸调节蛋白液至等电点4.0，4 ℃冰箱静置一夜，蛋白质沉淀完全后3 000 r/min离心10 min后分离，真空冷冻干燥即得成品，测定含量[19]。

1.3.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

NaOH提取的蛋白质液加酸中和至pH 7左右，吸取200 µL放入离心管中，12 000 r/min离心10 min，吸取50 µL与2 倍样品缓冲液混合，100 ℃水浴10 min后立即上样。

根据郭尧君[23]分别制备体积分数12%、15%、18%分离胶和体积分数5%浓缩胶，电泳上下槽倒入缓冲液，取出备用样品，待溶化后12 000 r/min离心10 min后，微量注射器吸取15 µL上样，刚开始100 V，待染色带进入分离胶后增加至120 V，当染料带抵达底部约1 cm处，电压缓缓归零，取出胶，左上角切一小块以标记样品顺序，考马斯亮蓝R250染色1 h左右，然后脱色2～3 h左右，直至背景清晰。

1.3.4 产品提取率的计算

式中：G为米渣蛋白得率/%；M为分离物中米渣蛋白的质量/g；N为米渣中蛋白质含量/g。

1.3.5 数据处理

Excel 2003分析和SPSS Statistics 19.0分析处理数据。

2 结果与分析

2.1 米渣基本成分分析

表 1 米渣基本成分

Table 1 Proximate composition of rice residue

米渣各成分含量如表1所示，米渣中蛋白的含量为58.2%，含量较高，是制备米渣蛋白的良好原料。米渣中除蛋白成分外，其非蛋白成分主要有糖、脂肪、纤维等。

2.2 不同预处理方式对米渣蛋白碱法提取率的影响

2.2.1 不同质量分数柠檬酸对米渣蛋白提取率的影响

取不同质量分数柠檬酸0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%处理180 min后的烘干米渣0.2 g，粒度为0.15 mm，加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL搅匀，置于50 ℃水浴锅中保温27 h，离心取其上清液等电点处沉淀米渣蛋白，冷冻干燥后称质量。

图 1 柠檬酸质量浓度对米渣蛋白质碱法提取率的影响

Fig.1 Effect of different concentrations of citric acid on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由图1可知，在柠檬酸质量分数在0.5%以下时，用碱法提取的大米渣蛋白质提取率随柠檬酸质量浓度增加而逐渐升高，当柠檬酸质量分数超过0.5%后，蛋白质提取率有下降趋势。而用质量分数0.5%柠檬酸预处理后，蛋白质提取率高达84.60%，比未用酸处理的米渣蛋白提取率高出38.60%。

2.2.2 柠檬酸预处理时间对米渣蛋白提取率影响

取质量分数0.5%柠檬酸常温处理60、90、120、180、240 min后，过滤去酸，烘干米渣，粒度为0.15 mm，取0.2 g加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL搅匀，置于50 ℃水浴锅中保温27 h，离心取其清液等电点处沉淀米渣蛋白，冷冻干燥后称质量。

图 2 柠檬酸处理时间对米渣蛋白质碱法提取率影响

Fig.2 Effect of citric acid pretreatment time on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由图2可知，在柠檬酸处理时间为180 min 处，蛋白质提取率已经达到最大值，为81.03%，此后随处理时间增加，蛋白质提取率增加并不明显，这是因为柠檬酸处理时发生去酰胺反应在180 min左右比较完全，有利于碱法提取蛋白质。

2.2.3 醋酸浓度对米渣蛋白提取率的影响

取不同稀释浓度醋酸处理180 min后的烘干米渣0.2 g，粒度为0.15 mm，加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL搅匀，置于50 ℃水浴锅中保温27 h，离心取其上清液等电点处沉淀米渣蛋白，冷冻干燥后称质量。

图 3 不同浓度醋酸对米渣蛋白碱法提取率影响

Fig.3 Effect of acetic acid at different concentrations on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由图3可以看出，经过醋酸预处理的米渣蛋白提取率在80%左右，而未经醋酸处理的米渣蛋白碱法提取率只有45.25%。由于醋酸对米渣蛋白有去酰胺作用，即酰胺基团中的氨基变成高亲水的羧基，分子内氢键的减少和分子间静电排斥的增加使米渣蛋白溶解性提高。但如果醋酸浓度太高，水洗时会浪费大量水，且腐蚀仪器设备，稀释20倍的醋酸处理后，蛋白质提取率达80.10%，比未用酸处理的米渣蛋白提取率46%高出34.1%，比王亚林等[12]在pH 12、碱提2 h、温度40 ℃，蛋白质提取率49.9%，高出30%左右。

2.3 酸处理后碱提取的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳

图4显示，用体积分数为18%分离胶效果较好，SDS-PAGE电泳结果可以看出，质量分数为0.5%柠檬酸和稀释20 倍醋酸预处理后蛋白电泳相似，且谱带清晰，但醋酸预处理蛋白电泳D部分电泳是独有的，D部分条带明显小于4.1 kD。两者A部分电泳条带拖尾较严重，相对分子质量集中在35～66 kD之间。B部分集中在6.5～9.5 kD（主要集中在9.5 kD附近），C部分蛋白集中在4.1kD附近，含量较多，说明大米渣的蛋白质经过柠檬酸与醋酸处理后碱法提取对米渣蛋白有水解作用，在提取过程中米渣蛋白被分解成小片段或者亚基，这与王章存[4]测的米渣蛋白谷蛋白最低13 kD要小很多，说明蛋白质在提取过程中分解了。另外提取米渣谷蛋白边缘不太清晰，这是糖蛋白共同特征[23]。

1. Marker；2.0.5%柠檬酸处理；3.稀释20倍（0.875mol/L）
的醋酸处理；A、B、C、D为电泳条带。

图 4 酸预处理后提取的米渣蛋白的SDS-PAGE图谱（18%分离胶）

Fig.4 SDS-PAGE patterns of rice residue protein obtained with acid pretreatments (18% separating gel)

2.4 酸处理后碱提取米渣蛋白样品图

取酸处理后和未处理的烘干米渣各0.2 g，加入0.1 mol/L NaOH溶液10 mL搅匀，置于50 ℃水浴锅中保温27 h，离心取其清液等电点处沉淀米渣蛋白，冷冻干燥。

a

c

b

d

a.先用质量分数为0.5%柠檬酸预处理后再碱提米渣蛋白样品；b.未用酸预处理而直接碱提米渣蛋白样品；c.先用稀释20 倍的醋酸预处理后再碱提米渣蛋白样品；d.原料大米渣。

图 5 不同预处理大米渣蛋白样品

Fig.5 Rice residue protein samples after different pretreatments

从图5可以看出，图5d原料大米渣，未过筛，样品粗糙，色泽黄；而图5a中用质量分数0.5%柠檬酸预处理后再碱法提取的米渣蛋白色泽纯白，细腻润滑，质地较好；图5c为稀释20倍（0.875 mol/L）醋酸预处理后再碱法提取的米渣蛋白，色泽有点偏黄；图5b为未用酸处理而直接用碱法提取的米渣蛋白。由此可见，质量分数0.5%柠檬酸预处理米渣后对碱法提取米渣蛋白的样品颜色有增白效果，产品质量较高。

3 结 论

通过分析不同预处理方式对碱提取米渣蛋白率影响可知：先用质量分数为0.5%柠檬酸或稀释20倍（0.875mol/L）
的醋酸对米渣蛋白25 ℃预处理180 min，然后用0.1 mol/L NaOH溶液、50 ℃提取27 h，米渣蛋白提取率大幅度提高，分别为84.60%和80.1%，比未用酸处理的米渣蛋白提取率46%分别高出38.60%和34.1%。而质量分数0.5%柠檬酸处理后米渣提取蛋白颜色纯白，细腻润滑，质地较好。此法尚未见报道，产品质地也优于目前已报道的。

SDS-PAGE凝胶电泳分析表明，酸处理后碱法提取的米渣蛋白主要集中在9.5 kD和4.1 kD左右，其中4.1 kD蛋白含量较多，蛋白质在提取过程中分解成较小的片段。

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