黄秋葵黄酮的提取工艺和体外抗氧化活性研究

李加兴1,陈 选2,邓佳琴2,吴 越2,刘玲玲2,涂 媛2,周炎辉2

(1.吉首大学食品科学研究所,湖南 吉首 416000;2.湖南奇异生物科技有限公司,湖南 长沙 410008)

 

摘 要:研究黄秋葵黄酮的超声辅助提取工艺和体外抗氧化活性。在单因素试验基础上,采用响应面法优化黄秋葵黄酮的超声辅助提取工艺,并以VC为对照,对其还原力及羟自由基(•OH)、超氧阴离子自由基(O2-•)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力进行探讨。结果表明,在超声功率250 W的条件下,最佳提取工艺为料液比125 (g/mL)、提取时间21 min、提取温度75 ℃、乙醇体积分数50%,此条件下黄酮得率的验证实验平均值为4.85%,与预测值4.88%相近,最佳工艺切实可行,制得的黄秋葵黄酮对•OH、O2-• 、DPPH自由基的IC50分别为6.00、3.28、2.98 mg/mL,最大清除率分别达31.49%、64.40%、62.22%,且具有较强的还原力,表现出较好的体外抗氧化活性。

关键词:黄秋葵;黄酮;超声辅助提取;响应面;抗氧化

 

Extraction and Antioxidant Activity in vitro of Okra Flavonoids

 

LI Jia-xing1, CHEN Xuan2, DENG Jia-qin2, WU Yue2, LIU Ling-ling2, TU Yuan2, ZHOU Yan-hui2

(1. Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China;

2. Hunan Amazing Grace BiotechnologyLimited Company, Changsha 410008, China)

 

Abstract: This paper reports the results obtained for the ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity in vitro of flavonoids from fresh okras. The extraction process was optimized using response surface methodology. The evaluation of antioxidant activity was carried out by reducing power, hydroxyl, superoxide anion and DPPH radical scavenging assays in comparison to VC. The optimum extraction conditions were determined as 250 W, 1:25 (g/mL), 21 min, 75 ℃ and 50% for ultrasonic power, solid-to-solvent ratio, extraction time, temperature and ethanol concentration, respectively. The experimentally observed yield of flavonoids under the optimized conditions was 4.85% on average, which approximated the predicted value of 4.88%, showing the reliability of the optimized process. In hydroxyl, superoxide anion and DPPH radical scavenging assays, the IC50 of the flavonoids extracted from okra were 6.00, 3.28 and 2.98 mg/mL, and the maximum scavenging rates were 31.49%, 64.40% and 62.22%, respectively. Moreover, strong reducing power was observed. These results support strong antioxidant activity in vitro for okra flavonoids.

Key words: okra; flavonoids; ultrasound-assisted extraction; response surface methodology; antioxidant activity

中图分类号:201.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)10-0121-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410022

黄秋葵为锦葵科(Malvaceae)秋葵属(Abelmoschus Medic)的一年生草本植物,又名秋葵、补肾草、咖啡葵等,在国外被誉为“绿色人参”、“植物伟哥”。黄秋葵的果实、叶、芽、花均可食用,嫩果富含蛋白质、氨基酸、纤维素、碳水化合物和维生素、矿物质等众多营养成分,同时还含有黄酮、多糖等活性成分,具有抗疲劳、增强免疫力、温肾壮阳等功效,既可以作为高档蔬菜,又可以开发成新型保健食品[1-3]。

生物类黄酮是具有较强清除自由基和抗氧化能力的一种物质,一些生物类黄酮物质的抗氧化作用甚至数倍于VC、VE。而众多的生物类黄酮因其结构的不同,有的表现出生物活性,有的则没有生物活性[4]。黄秋葵是一种富含黄酮的植物,黄酮含量约为2.8%,同时还含有多糖、维生素等抗氧化活性物质[5-7]。目前,关于黄秋葵活性物质的研究大多集中于不同极性成分的分析上[8-11],而针对其黄酮的研究较少。因此,本实验以乙醇为提取溶剂,采用超声波辅助提取黄秋葵中的黄酮,并通过响应面法优化提取工艺,同时对黄秋葵黄酮的体外抗氧化性进行探讨,以期为黄秋葵中黄酮类化合物的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄秋葵,湖南湘纯农业科技有限公司浏阳栽培基地提供,采摘于7月份,浏阳本地品种。

亚硝酸钠、硝酸铝、VC、三氯乙酸、三羟甲基氨基甲烷、三氯化铁、邻二氮菲、硫酸亚铁、1,1-二苯基-2-三硝基苦肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、邻苯三酚、双氧水、邻二氮菲、芦丁标准品等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-250E医用超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;AM-0895分析天平 上海民新精密科学仪器有限公司;TDL-40C低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;QL-901型漩涡混合器 江苏其林贝尔仪器有限公司;722可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;HH-8数显恒温水浴锅 国华电器厂。

1.3 方法

1.3.1 黄秋葵黄酮的提取工艺流程

黄秋葵鲜果→洗净→干燥→粉碎过筛→加入乙醇→超声辅助浸提(功率250 W)→离心→过滤→蒸发浓缩→冷冻干燥→黄酮

1.3.2 影响黄秋葵黄酮得率的单因素试验

1.3.2.1 料液比对黄酮得率的影响

固定乙醇体积分数70%、提取时间25 min、提取温度55 ℃,探讨料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,g/mL)对黄酮得率的影响。

1.3.2.2 提取时间对黄酮得率的影响

固定乙醇的体积分数70%、提取温度55 ℃、料液比1∶20(g/mL),探讨提取时间(15、20、25、30、35 min)对黄酮得率的影响。

1.3.2.3 提取温度对黄酮得率的影响

固定乙醇体积分数70%、料液比1∶20(g/mL)、提取时间25 min,探讨提取温度(45、55、65、75、85 ℃)对黄酮得率的影响。

1.3.2.4 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

固定料液比1∶20(g/mL)、提取时间25 min、提取温度65 ℃,探讨乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)对黄酮得率的影响。

1.4 超声辅助提取工艺的响应面优化试验

在单因素试验的基础上,用Design-Expert 8.0.6.1软件设计Box-Behnken试验,试验因素与水平设计见表1。

表 1 试验因素与水平设计

Table 1 Factors and levels for response surface analysis

水平

A料液比(g/mL)

B提取时间/min

C提取温度/℃

D乙醇体积分数/%

-1

1∶15

20

55

50

0

1∶20

25

65

60

1

1∶25

30

75

70

 

 

1.5 芦丁标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准品1 g,以质量分数为30%的无水乙醇定容到100 mL;从中取出5 mL定容到100 mL,得到质量浓度为0.5 mg/mL的芦丁标准溶液;分别精确量取0、1、2、3、4、5、6 mL的芦丁标准液于25 mL的比色管中,用质量分数为30%的乙醇溶液稀释到10 mL,加入质量分数为5%的NaNO2 0.7 mL,混匀后静置6 min,加入质量分数为10%的Al(NO3)3 0.7 mL,混匀后静置6 min,加入质量分数为4%的NaOH 5 mL,用质量分数为30%的乙醇定容到25 mL,混匀,静置15 min后于510 nm处测吸光度,同时用试剂空白作为参比液。以芦丁质量浓度为X轴、吸光度为Y轴,绘制标准曲线;标准曲线的回归方程为:Y=0.386X+0.007,R2=0.999 3。

1.6 黄酮得率的测定

取10 mL方法1.3.1节中的滤液,用25 mL的比色管定容,然后按1.5节的方法于510 nm处测其吸光度,通过回归方程和稀释倍数计算提取液中的黄酮含量,然后按下式计算黄秋葵黄酮的得率:

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1.7 黄秋葵黄酮体外抗氧化活性实验

以最优工艺制备的黄秋葵黄酮为原料进行体外抗氧化活性实验,还原力的测定采用铁氰化钾还原法[12];•OH清除率的测定采用邻二氮菲法[13];DPPH自由基清除率的测定采用DPPH法[14];O2-•清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法[15]。

1.8 半抑制浓度(half maximal (50%) inhibitory concentration,IC50)的计算

将黄秋葵黄酮的质量浓度对•OH、DPPH自由基、O2-•的清除率作图并进行线性拟合。根据拟合的线性方程,当清除率为50%时所对应黄秋葵黄酮的质量浓度即IC50;以IC50值作为评价黄秋葵黄酮的抗氧化能力指标。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对黄酮得率的影响

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图 1 料液比对黄酮得率影响

Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of flavonoids

由图1可知,随着溶剂体积的增大,黄酮得率提高。这主要是由于溶剂中溶质的质量浓度小,所以溶剂能够溶解的物质质量在不断增大所致。当料液比达到1∶20 (g/mL)
时,再增大提取溶剂用量,黄酮得率提高并不显著,反而会增加后续浓缩的难度和成本[16]。综合考虑,选取料液比为1∶20(g/mL)较为合适。

2.1.2 提取时间对黄酮得率的影响

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图 2 提取时间对黄酮得率的影响

Fig.2 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

由图2可知,随着提取时间的变化,黄酮得率呈先增加后降低的趋势,当提取时间为25 min时,黄酮得率达最大值。提取时间过短,黄酮提取不完全;提取时间过长,能耗增加,同时黄酮类物质的稳定性将变差,并会随着提取溶剂的不断蒸发而损失或分解,从而导致得率降低[17-18]。因此,提取时间选择为25 min较为适宜。

2.1.3 提取温度对黄酮得率的影响

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图 3 提取温度对黄酮得率的影响

Fig. 3 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

由图3可知,开始时随着提取温度升高,黄酮得率随之增加,当温度到达65 ℃时,黄酮得率出现一个峰值,之后由于过高的温度对黄酮类物质产生破坏[19],黄酮得率反而降低。因此,以提取温度为65 ℃较为适宜。

2.1.4 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

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图 4 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

由图4可知,黄酮得率随着乙醇体积分数的增加呈先上升后下降的趋势,在乙醇体积分数为60%时,黄酮得率达到最大值。这是由于不同体积分数的乙醇极性不同,黄酮类化合物具有较高的极性,根据相似相溶原理,黄秋葵黄酮在乙醇体积分数为60%时溶出效果较好[20]。因此,选择乙醇体积分数为60%较为合适。

2.2 响应面分析及黄秋葵黄酮提取工艺的优化

表 2 响应面分析方案及结果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

试验号

A

B

C

D

黄酮得率/%

1

-1

-1

0

0

2.94

2

1

-1

0

0

4.28

3

-1

1

0

0

2.67

4

1

1

0

0

3.97

5

0

0

-1

-1

3.66

6

0

0

1

-1

3.86

7

0

0

-1

1

3.22

8

0

0

1

1

2.87

9

-1

0

0

-1

3.09

10

1

0

0

-1

4.24

11

-1

0

0

1

2.64

12

1

0

0

1

3.58

13

0

-1

-1

0

3.34

14

0

1

-1

0

3.07

15

0

-1

1

0

3.47

16

0

1

1

0

3.22

17

-1

0

-1

0

3.04

18

1

0

-1

0

3.62

19

-1

0

1

0

2.31

20

1

0

1

0

4.26

21

0

-1

0

-1

3.93

22

0

1

0

-1

3.67

23

0

-1

0

1

2.85

24

0

1

0

1

3.08

25

0

0

0

0

3.62

26

0

0

0

0

3.49

27

0

0

0

0

3.46

28

0

0

0

0

3.69

29

0

0

0

0

3.65

 

表 3 方差分析

Table 3 Analysis of variance

方差来源

平方和

自由度

均方

F

P

模型

6.820

14

0.490

27.840

<0.000 1**

A

4.390

1

4.390

250.930

<0.000 1**

B

0.110

1

0.110

6.080

0.0272*

C

1.333×10-0.004

1

1.333×10-0.04

7.617

0.931 7

D

1.480

1

1.480

84.380

<0.000 1**

AB

4.000×10-0.004

1

4.000×10-0.04

0.023

0.882 0

AC

0.470

1

0.470

26.810

0.000 1**

AD

0.011

1

0.011

0.630

0.440 7

BC

1.000×10-0.05

1

1.000×10-0.05

5.713×10-0.03

0.940 8

BD

0.060

1

0.060

3.430

0.085 3

CD

0.076

1

0.076

4.320

0.056 5

A2

0.043

1

0.043

2.430

0.141 2

B2

0.065

1

0.065

3.690

0.075 4

C2

0.180

1

0.180

10.520

0.005 9**

D2

0.036

1

0.036

2.070

0.172 1

残差

0.250

14

0.018

 

 

失拟项

0.200

10

0.020

1.990

0.265 6

纯误差

0.041

4

0.010

 

 

总误差

7.070

28

 

 

 

 

注:*. P<0.05,差异显著;**. P<0.01,差异极显著。

在单因素试验的基础上,依据Box-Behnken试验原则,安排料液比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数对得率影响的响应面试验,并采用响应面法对提取工艺条件进行优化。响应面设计方案和试验结果见表2,包括24 个析因试验,5 个中心试验,用来估算试验误差。

用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2的数据进行处理,其方差分析结果见表3,并对响应值与各个因素进行回归拟合,其拟合方程为:

R=3.58+0.16A-0.094B+3.333×10-3C-0.35D-0.01AB+0.34AC-0.053AD+5.0×10-3BC+0.12BD-0.14CD-0.081A2-0.10B2-0.17C2-0.075D2

由表3的方差分析可知,回归方程模型极显著
P<0.01),方程失拟项不显著,表明该回归模型与实测值能较好地拟合。回归系数R2=0.965 3>0.9,表明该模型相关度好。各项的方差分析表明,ADACC2对黄酮得率有极显著的影响。根据各影响因素标准回归系数的大小:DABC,可知各因素对黄酮得率的影响大小顺序为:乙醇体积分数>料液比>提取时间>提取温度。在交互项对黄酮得率的影响中,AC即料液比和提取温度的交互作用对黄酮得率有较大影响,其响应面和等高线见图5。由于其他因素的交互作用对黄酮得率的影响较小所以未列出。

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图 5 料液比和提取温度对黄酮得率影响的响应面和等高线

Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of solid-to-liquid ratio and temperature on the extraction yield of flavonoids

根据回归方程模型,得到预测的最优工艺条件为料液比1∶25(g/mL)、提取时间20.77 min、提取温度75 ℃、乙醇体积分数50%,在此条件下黄酮得率的预测值可达4.87%。为便于实验操作,将最佳工艺条件修正为料液比1∶25 (g/mL)、提取时间21 min、提取温度75 ℃、乙醇体积分数50%,并进行3次平行验证实验,得到的黄酮得率实际平均值为4.85%。该实际值和预测值大小相近,因此利用响应面法优化所得的工艺条件具有可行性。

2.3 黄秋葵黄酮的体外抗氧化活性

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图 6 黄秋葵黄酮的还原力及OH、O2 、DPPH自由基清除率

Fig.6 Reducing power and hydroxyl, superoxide anion and DPPH radical scavenging activities of okra flavonoids

由图6可知,在所考查的质量浓度范围内,黄秋葵黄酮和VC的还原力均随着质量浓度的增加而增加,并且呈现出较好的量效关系,其中3.2 mg/mL的黄秋葵黄酮的还原力与250 μg/mL的VC相当。黄秋葵黄酮对•OH、O2、DPPH自由基均具有清除效果,且存在剂量效应,当黄秋葵黄酮质量浓度为4 mg/mL时,其最大清除率分别达31.49%、64.40%、62.22%,表现出良好的抗氧化活性。对黄秋葵黄酮的•OH、O2、DPPH自由基清除率与浓度进行线性拟合,其线性拟合方程分别为:YOH)=
0.096 7X-0.080 2,R²=0.994 1;Y(O2)=0.1796X-0.0889,R²=0.9955;YDPPH自由基=0.152 1X+0.047,R²=0.993 8,均呈现出良好的线性量效关系;由此可计算出黄秋葵黄酮的•OH、O2、DPPH自由基的IC50分别为6.00、3.28、2.98 mg/mL。

3 结 论

黄秋葵作为营养保健型的绿色蔬菜,正日益受到消费者喜爱,其研究和开发也在逐步深入。本实验采用超声辅助法提取黄秋葵中的黄酮,并探讨了其体外抗氧化活性,对黄秋葵黄酮类化合物的开发利用具有较大指导意义。经响应面优化,在超声功率250 W条件下,黄秋葵黄酮的最佳提取工艺为料液比1∶25 (g/mL)、提取时间21 min、提取温度75 ℃、乙醇体积分数50%,此条件下黄酮得率的实际平均值可达4.85%,与预测值4.88%相近,该最佳工艺切实可行,制得的黄秋葵黄酮对•OH、O2-•、DPPH自由基的IC50分别为6.00、3.28、2.98 mg/mL,
最大清除率分别达31.49%、64.40%、62.22%,且具有较强的还原力,表现出较好的体外抗氧化活性。

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