流式细胞术快速检测直投式发酵剂菌体活力

叶 雷1，陈庆森1,*，阎亚丽1,*，赵林森2，葛春美2，赵 培1，刘 芳1，董宇坤1

（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134；

2.河北一然生物科技有限公司，河北 石家庄 050800）

摘 要：利用荧光染料标记直投式发酵剂菌体细胞并结合流式细胞术快速检测和分析菌体细胞的活力以及生存状态，对科学地评价各种微生物发酵剂的品质具有现实意义。研究选用保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）两种直投式发酵剂以及制备的新鲜菌体细胞和热处理菌体细胞作为分析检测对象，利用流式细胞术结合羧基荧光素双乙酸酯（5-（6）-carboxyfluoresceindiacetate，5（6）-cFDA）和碘化丙啶（两种荧光染料检测了这些菌体的细胞活力。研究结果表明，5（6）-cFDA和PI双染色方法适合检测L. bulgaricus直投式发酵剂中菌体的存活力，该发酵剂中菌体存活率仅为4.7%，活力较低；而利用5（6）-cFDA单染色方法检测S. thermophilus直投式发酵剂中菌体存活力的效果较好，其菌体存活力接近于90%，活力较强；同时，发酵活力验证也得到了相同的结果；另外，研究证实了PI不能很好地区分S. thermophilus的死活细胞。因此，流式细胞术可作为直投式发酵剂生产行业快速检测评价产品质量的可靠方法。

关键词：荧光染料；流式细胞术；直投式发酵剂；存活力

Rapid Assessment of Bacterial Viability by Flow Cytometry in Direct Vat Set Yogurt Starter

YE Lei1, CHEN Qing-sen1,*, YAN Ya-li1,*, ZHAO Lin-sen2, GE Chun-mei2, ZHAO Pei1, LIU Fang1, DONG Yu-kun1

(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China; 2. Hebei Inatural Biotechnology Co. Ltd., Shijiazhuang 050800, China)

Abstract: Direct labeling of starter cells with the fluorescent dye in combination with flow cytometry for rapid assessment of cell viability and survival status has practical significance for the scientific evaluation of the quality of various microbial fermentation starters. Direct vat set yogurt starter consisting of either Lactobacillus bulgaricus or Streptococcus thermophilus as well as their freshly harvested cells and heat-killed cells were evaluated for their viability using flow cytometry combined with staining with two specific fluorescent dyes, 5(6)-cFDA and propidium iodide (PI). Double staining with 5(6)-cFDA and PI was suitable for evaluating the cell viability of L. bulgaricus in direct vat set starter, which was low, only 4.7%, while staining with 5(6)-cFDA alone could more effectively evaluate the viability of S. thermophilus in direct vat set culture, which was almost 90%. Also, the same results were observed in confirmatory experiments. Finally, our results also showed that PI did not give clear live/dead discrimination for S. thermophilus. Consequently, flow cytometry is a reliable tool to rapidly evaluate the viability of direct vat set starter cultures in dairy industry.

Key words: fluorescent dye; flow cytometry; direct vat set starter; viability

中图分类号：Q939.99 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）10-0139-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410025

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）作为益生菌在维持人体和动物的肠道健康方面具有重要作用，如今LAB在食品工业领域被广泛用于发酵乳制品如益生菌酸奶、益生菌发酵乳饮料、益生菌奶酪等，另外在功能性食品配料、食品添加剂和饲料微生态制剂方面也有广泛应用。通常根据发酵剂菌株的存活力、凝乳能力、酸化能力、发酵产物的口感、质地以及防腐性能来筛选发酵菌株。常用的发酵菌种大多为乳酸菌，如保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）等，这些益生菌具有维持宿主微生态平衡[1-3]、增强肠黏膜屏障功能[4-6]、降低胆固醇[7-9]、缓解乳糖不耐症以及肠道相关疾病[10-13]等作用。目前，乳品工业中发酵乳制品的生产，通常利用冷冻干燥技术将这些乳酸菌制备成接种量少、保质期长、产品质量稳定，可以直接投入发酵生产的多功能直投式发酵剂。保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌直投式发酵剂就是乳制品工业中成功应用的典型实例。然而，直投式发酵剂质量优劣与目标产品质量的好坏有极为密切的关系，发酵剂中发酵菌株的存活力不仅决定了发酵的成败，而且影响发酵周期以及产品的独特风味和质地。

直投式发酵剂的优劣一般通过发酵剂中菌体存活力和代谢活力进行衡量，对于菌体存活力的检测人们常习惯于传统的平板活菌计数法，然而这种方法具有耗时长且只能检出可培养菌体，而对那些活的非可培养菌体则无法检出等缺点。所以寻找能够灵敏快速的检测直投式发酵剂中菌体存活力的方法对科学地评价各种微生物发酵剂的品质具有现实意义。近些年，应用荧光染色技术结合流式细胞仪评价微生物的存活力和细胞活性有了一些报道，该方法是利用细胞表面特性和结构的不同而产生的不同荧光特性以及散光特性来区分具有不同细胞活力的菌体，可以快速灵敏的检测细胞的存活力[14-16]。用于分析评价细菌菌体活性的染料第一类为羧基荧光素双乙酸酯（5-（6）-carboxyfluorescein diacetate，5（6）-cFDA），它本身无荧光，在细胞的非特异性脂酶的催化下，5（6）-cFDA生成荧光素，后者经480nm激光激发出波长530 nm左右的绿色荧光。死细胞的细胞膜不完整，生成的荧光素很快扩散出细胞，不能检测到带有绿色荧光的细胞，所以该染料用于检测活细胞。另一类为核酸染料碘化丙锭（propidium iodide，PI），它不能进入具有完整细胞膜的活细胞，当菌体细胞死亡或细胞膜不完整时，PI进入细胞与DNA相结合，在488 nm的激光激发下，在波长660 nm左右检测到红色荧光，所以该染料用于检测死细胞[17]。

已有研究表明5（6）-cFDA和PI染色并结合流式细胞仪的分析技术能够灵敏有效的测定细菌的存活力和生存状态[17-20]。然而，该方法在分析评价直投式发酵剂中菌体细胞存活力方面的应用目前还未有报道，因此本研究以
L. bulgaricus和S. thermophilus两种直投式发酵剂以及制备的新鲜菌体细胞和热处理菌体细胞作为分析检测对象，首先验证流式细胞术检测发酵剂中菌体存活力方法的可靠性，然后应用这种快速检测的方法来评价和比较乳品工业中常用的L. bulgaricus和S. thermophilus直投式发酵剂中菌体的存活力，为该技术的广泛应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L. bulgaricus直投式发酵剂 某益生菌制剂公司； S. thermophilus直投式发酵剂 河北一然生物科技有限公司；乳酸细菌肉汤培养基 北京奥博星生物技术有限公司；羧基荧光素双乙酸酯（5（6）-cFDA）、碘化丙锭（PI） 美国Sigma公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 北京索莱宝科技有限公司；0.2 μm膜过滤的磷酸盐（phosphate buffer solution，PBS）缓冲液。

1.2 仪器与设备

FACS Calibur型流式细胞仪（双激光配置） 美国Becton，Dickinson and Company；ECLIPSE E200普通光学显微镜 日本Nikon公司、血球计数板 盐城市恒泰玻璃仪器厂；3k15生化离心机 美国Sigma公司；紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；高压灭菌锅 日本三洋公司；微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 直投式发酵剂的菌悬液制备

分别将两种直投式发酵剂菌株（L. bulgaricus和
S. thermophilus）室温下解冻5～10 min，并将解冻的菌体分别用PBS缓冲液悬浮，制备的菌悬液以备使用。

1.3.2 流式细胞术分析的菌体样品的制备

1.3.2.1 直投式发酵剂菌株的新鲜菌体的制备

分别将1.3.1节中制备的菌体悬浮液以1%的接种量接种于MRS液体培养基，培养至对数期，4 000×g，4 ℃离心10 min，用PBS缓冲液反复洗涤两次，获得新鲜菌体。将离心获得菌体悬浮于PBS缓冲液使菌体数接近于106 CFU/mL。

1.3.2.2 5（6）-cFDA和PI荧光染色双阴性对照菌体样品的制备

分别取1 mL上述制备新鲜菌体悬浮液不进行任何染色，作为双阴性对照，用于流式细胞仪检测消除背景。

1.3.2.3 5（6）-cFDA单阳性对照菌体样品的制备

取1 mL两种新鲜菌体悬浮液，分别加入10 μL
5（6）-cFDA染液（5 mg/mL），37 ℃避光孵育10 min，荧光染色过程均在暗室中操作（下同），14 000×g，4 ℃离心1 min，1 mL PBS缓冲液重悬，用于5（6）-cFDA染液对两种活菌染色效果的评价。

1.3.2.4 PI单阳性对照菌体样品的制备

取1 mL两种新鲜菌体悬浮液80 ℃水浴30 min，热处理杀死所有菌体，分别加入30 μL PI染液（1 mg/mL），37 ℃避光孵育30 min，用于PI染液对两种灭活的菌染色效果的评价。

1.3.2.5 PI/5（6）-cFDA双染色菌体样本的制备

分别取0.5 mL两种新鲜菌体悬浮液80 ℃水浴30 min，热处理杀死所有菌体，与0.5 mL新鲜菌体悬浮液混合，然后分别加入1 mL PI染液37 ℃避光孵育20 min，再加入1 mL 5（6）-cFDA染液37 ℃避光孵育10 min，14 000×g，4 ℃离心1 min，1 mL PBS缓冲液重悬，用于评价两种染液区分死活细菌的效果。

1.3.2.6 待测发酵剂菌体样品的制备

分别取1 mL 1.3.1节中制备的两种菌体悬浮液，稀释至菌体数接近于106 CFU/mL，按上述染色剂量和染色时间进行PI和5（6）-cFDA染色。

1.3.3 流式细胞（flow cytometry，FCM）仪检测

将上述1.3.2节制备的各种菌体样品在充分混匀的前提下进行流式细胞仪分析检测。FCM检测光源为氩离子激光，氩离子激发光波长488 nm，发射光光波长大于630 nm，检测器FL1检测波长530 nm，检测器FL3检测波长670 nm，每个样品收集30 000个细胞。以未进行5（6）-cFDA和PI荧光染色的菌体样品作为双阴性对照，以前向散射角（forward scatter，FSC）和侧向散射角（side scatter，SSC）建立FSC-SSC点图，设R1“门”以圈定待测的目标细胞；5（6）-cFDA和PI两种荧光染液分别用来检测活细胞和死细胞，5（6）-cFDA进入FL1荧光通道，PI进入FL3荧光通道，获取FL1-FL3点图或者FL1-H、FL3-H柱状图。

1.3.4 平板菌落计数

对1.3.1节中得到的菌悬液用无菌PBS缓冲液进行梯度稀释，于MRS固体平板上37 ℃培养48 h后，进行菌落计数，每个稀释度做3 个平行，计数结果与FCM结果进行比较。

1.4 数据分析与处理

利用FACS Calibur型流式细胞仪专用的数据分析软件CELL Quest program 6.0对实验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 L. bulgaricus直投式发酵剂菌体细胞存活力的检测

2.1.1 PI和5（6）-cFDA单染色区分L. bulgaricus死菌和活菌效果的评价

研究按方法1.3.2.2、1.3.2.3和1.3.2.4节的方法制备待分析样品，利用流式细胞仪分析检测，其结果如图1所示。

从图1可以看出，PI和5（6）-cFDA能够很好的区分L. bulgaricus的死菌和活菌。图1a建立的FSC-SSC点图用于圈定待测目标菌体；图1b是双阴性菌体的FL1-FL3荧光点图，用于去除背景荧光。从图1c可以看到有94%热处理后的L. bulgaricus染上红色荧光并分布在荧光点图的左上区域，荧光强度接近102；相反，从图1d可以看到有97%新鲜的L. bulgaricus染上绿色荧光，荧光强度接近103，集中分布在荧光点图右下区域。虽然在图1c和图1d中PI和5（6）-cFDA染色会有少量偏差，这可能是由于热处理未完全致死菌体细胞，或者是由于实验中产生的受损菌体和细胞碎片干扰所造成，但这并不影响PI和5（6）-cFDA区分L. bulgaricus的死菌和活菌效果。

a.待测目标菌体散点图；b.双阴性对照菌体散点图；c.热处理杀死菌体的PI单染荧光散点图；d.新鲜菌体的5（6）-cFDA单染荧光散点图。

图 1 L. bulgaricus PI和5（6）-cFDA染色荧光信号散点图

Fig.1 Dot plots representing PI and 5(6)-cFDA fluorescent signals of
L. bulgaricus

2.1.2 PI/5（6）-cFDA双染色区分L. bulgaricus死菌和活菌效果的评价

为了确认PI/5（6）-cFDA双染色对于杀灭的和新鲜的L. bulgaricus菌体同时存在下的区分效果，按1.3.2.5节中的方法将50%的热处理菌体和50%新鲜菌体混合，PI/5（6）-cFDA双染色得到的荧光信号点图如图2所示。分析结果可知，5（6）-cFDA和PI标记上的菌体在FL1-FL3荧光信号点图中可以很好的被区分开，根据染色特征菌体被分在4个不同的区域。位于荧光信号点图左下区域的未染色菌体和细胞碎片仅占计数群体的0.2%，位于荧光信号点图左上区域被PI标记的死菌数和右下区域被5（6）-cFDA标记的活菌数分别占计数群体的42%和44%；而位于荧光信号点图右上区域被PI和5（6）-cFDA同时标记上的菌体数占计数群体的12%，这部分菌体细胞膜受损但是仍具有酯酶活性。结果显示，PI/5（6）-cFDA双染色可以很好的区分3种不同生理状态下的
L. bulgaricus菌体，进一步确认了PI/5（6）-cFDA双染色用于检测L. bulgaricus直投式发酵剂中菌体存活力的准确性。

图 2 L. bulgaricus新鲜菌体（50%）和热处理菌体（50%）混合后PI/5（6）-cFDA双染色荧光信号散点图

Fig.2 Dot plots representing PI/5(6)-cFDA fluorescent signals of a mixture containing heat-killed (50%) and freshly harvested (50%) cells of L. bulgaricus

2.1.3 L. bulgaricus直投式发酵剂中菌体存活力的检测

图 3 直投式发酵剂中L. bulgaricus PI/5（6）-cFDA
双染色荧光信号散点图

Fig.3 Dot plots representing PI/5(6)-cFDA fluorescent signals of
L. bulgaricus in Direct Vat Set starter

PI/5（6）-cFDA双染色用于检测直投式发酵剂中
L. bulgaricus的存活力，图3为发酵剂中L. bulgaricus菌体PI/5（6）-cFDA双染色荧光信号点图。从图3可以看到，发酵剂中菌体大部分被PI所标记，集中分布在左上区域，死菌数目比较多。研究为了证实方法的可靠性，对该直投式发酵剂又进行了3次平行检测分析，结果均与图3显示的结果类似，表1中总结了4次检测的结果。研究采用PI/5（6）-cFDA双染色后，经流式细胞仪检测得到该直投式发酵剂中L. bulgaricus菌体存活力较弱，处于荧光点图右下区域，具有显著活性的菌体仅占总菌体数的4.7%；而被PI标记的处于左上区域的死菌占菌体总数的63.9%；另外，处于荧光点图右上区域的菌体也超过了24%，表明受损细胞也较多。

表 1 L. bulgaricus直投式发酵剂菌体活力FCM检测结果

Table 1 Viability of L. bulgaricus in direct vat set starter obtained by flow cytometry

2.2 S. thermophilus直投式发酵剂中菌体存活力的检测

2.2.1 PI和5（6）-cFDA染色区分S. thermophilus死菌和活菌效果的评价

a.阴性对照菌体FL1-H柱状图；b.新鲜菌体的5（6）-cFDA单染FL1-H柱状图；c.新鲜菌体（50%）和热处理菌体（50%）混合后5（6）-cFDA单染FL1-H柱状图；d.阴性对照菌体FL3-H柱状图；e.热处理菌体PI单染FL3-H柱状图；f.新鲜菌体（50%）和热处理菌体（50%）混合后PI单染FL3-H柱状图。

图 4 S. thermophilus 5(6)-cFDA染色荧光信号柱状图

Fig.4 Histogram representing 5(6)-cFDA fluorescent signals of
S. thermophilus

从图4a～4c可以看出，5（6）-cFDA染色能够很好的区分热处理和新鲜的S. thermophilus菌体。通过图4a中阴性菌体划定界限，M1区域表示FL1荧光信号弱或者无荧光信号的菌体，即未标记上5（6）-cFDA的菌体；M2区域表示FL1信号强的菌体，即标记上5（6）-cFDA的活菌。图4b建立的FL1-H柱状图中处于M2区域内活菌菌体数达到94%，且荧光信号超过103，菌体活力较强；虽然检测结果与实验设计存在部分偏差，这可能是由于样品制备过程中产生少量死菌造成。另外，从图4c分析结果可知，处于M1区域的具有较弱荧光或者无荧光的菌体占总数的50.69%，而处于M2区域被5（6）-cFDA标记上的有活力菌体数也达到了49.31%，荧光强度超过103；并且两个区域内峰型较好，细胞群在空间上分群非常明显，几乎无偏差。因此，利用5（6）-cFDA染色标记区分
S. thermophilus的死菌和活菌的效果非常好，可以用于发酵剂中菌体存活力的检测。

然而，从图4d～4f的分析结果显示，PI染色区分
S. thermophilus死菌和活菌的效果不好。虽然图4e中显示热处理后的菌体有超过98%的菌体被PI标记，但图4f显示的新鲜菌体（50%）和热处理菌体（50%）混合后有85%的菌体被PI标记，仅15%的菌体未被标记，这与研究设计的检测结果产生较显著的偏离；另外，两个区域的峰形较差，细胞群体没有明显界限，所以利用PI染色区分
S. thermophilus死菌和活菌的效果不好。

2.2.2 S. thermophilus直投式发酵剂中菌体存活力的检测

基于2.2.1节中的分析结果，利用5（6）-cFDA单染色来检测直投式发酵剂中S. thermophilus的活力状态，图5为直投式发酵剂中S. thermophilus 5（6）-cFDA染色荧光信号柱状图。

图 5 直投式发酵剂中嗜热链球菌5（6）-cFDA染色荧光信号柱状图

Fig.5 Histogram representing 5(6)-cFDA fluorescent signals of
S. thermophilus in Direct Vat Set starter

从图5可以看出，发酵剂中S. thermophilus菌体大部分被5（6）-cFDA标记，集中分布在M2区域，且荧光强度均在103左右，菌体活力较强。为了证实分析结果的可靠性，对直投式发酵剂又进行了3次平行验证实验，结果与图5显示的结果一致，将4次实验的结果归纳在表2。研究提示采用5（6）-cFDA单染色标记菌体细胞，经流式细胞仪检测获得该直投式发酵剂中有接近90%的
S. thermophilus菌体被5（6）-cFDA标记，处于柱状图的M2区域，且荧光强度均较强，发酵剂中菌体存活力强。

表 2 S. thermophilus直投式发酵剂菌体活力FCM检测结果

Table 2 Viability of S. thermophilus in Direct Vat Set obtained by flow cytometry

2.3 FCM技术和平板菌落计数法检测效果的比较

比较传统的平板菌落计数法和FCM技术检测发酵剂中菌体细胞活性的效果，结果如表3所示。结果显示，FCM技术检测发酵剂中菌体细胞活性的结果与传统的平板菌落计数的结果基本一致，并略高于传统的平板菌落计数结果，说明FCM技术在检测菌体细胞活性时具有更高的灵敏度和精确度。

表 3 FCM技术和平板菌落计数法检测发酵剂中
菌体细胞活性的结果比较

Table 3 Comparison of cell viability in direct vat set starters evaluated by flow cytometry and plate count experiments

3 结论与讨论

由于传统的平板计数法具有耗时长且对细菌存活力检测偏低等缺点，所以应用能反映细胞内酶活性的染料5（6）-cFDA以及能与核酸结合的荧光染料PI，双染色或者单染色标记后，经流式细胞仪快速检测和评价
L. bulgaricus和S. thermophilus直投式发酵剂中菌体的存活力和生存状态。Amor等[18]利用5（6）-cFDA和PI双染色结合流式细胞仪评价了双歧杆菌对胆汁酸的敏感性，并根据染色情况将菌体分成活细胞、受损细胞和死细胞3 种不同生理状态下的细胞，发现流式细胞术能够快速灵敏的评价益生菌在应激状态下的生理状态和稳定性；汪清美等[19]利用这种方法成功的评价了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌对模拟人体胃酸和胆汁盐的耐受力。

本研究通过设计的双阴性对照、制备活菌与死菌、单标记和双标记染色等方案，利用流式细胞技术全面地检测并评价了两种直投式发酵剂中菌体细胞的活力状态。结果显示，评价的L. bulgaricus直投式发酵剂中菌体的活力很低，这可能是因为直投式L. bulgaricus对冷冻条件较为敏感，在发酵剂生产过程中，冷冻干燥工艺使得菌体受损甚至死亡，造成发酵剂中菌体细胞活力下降；也可能是由于直投式发酵剂在生产过程中添加的冷冻保护剂效果不佳，冷冻保存时间过长使得菌体细胞受损严重，活力显著降低。Rault等[20]的研究证实了L. bulgaricus在经过冷冻干燥后菌体活力下降了10%～50%，并且受到冷冻保存时间的影响，充分证实直投式发酵剂生产过程中的冷冻干燥技术的把握对菌体的活力影响很大，所以本研究提示在生产高效力发酵剂时，寻找有效的冷冻保护剂来维持菌体细胞的活力是必须的。

综上所述，一种快速分析、评价发酵菌剂活力及菌体细胞完整性的流式细胞术的技术方法具有很高的可靠性，这为各种微生物发酵菌剂优劣的科学评价提供一条具有实用以及推广价值的方法。

参考文献：

[1] 王友湘, 陈庆森. 瑞士乳杆菌对小鼠肠道微生物区系的影响[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 542-546.

[2] CAVALLINI D C, SUZUKI J Y, ABDALLA D S, et al. Influence of a probiotic soy product on fecal microbiota and its association with cardiovascular risk factors in an animal model[J]. Lipids in Health and Disease, 2011(10): 126.

[3] 王友湘, 陈庆森. 益生菌和肠道粘膜免疫关系的研究进展[J]. 食品科学, 2007, 28(8): 537-542.

[4] OELSCHLAEGER T A. Mechanisms of probiotic actions: a review[J]. International Journal of Medical Microbiology, 2010, 300(1): 57-62.

[5] 余晶仪, 郝小燕, 龙敏, 等. MUC2基因表达对益生菌调节肠屏障作用的影响[J]. 南方医科大学学报, 2013, 33(2): 197-201.

[6] DAI K, ZHAO D H, JIAN G M. VSL# 3 probiotics regulate the intestinal epithelial barrier in vivo and in vitro via the p38 and ERK signaling pathways[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2012, 29(2): 202-208.

[7] SATOSHI H, YUKIKO K, HIROAKI M. Effect of cheese consumption on the accumulation of abdominal adipose and decrease in serum adiponectin levels in rats fed a calorie dense diet[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(10): 1224-1231.

[8] NGUYEN T D T, KANG J H, LEE M S. Characterization of Lactobacillus plantarum PH04, a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 113(3): 358-361.

[9] FAZELI H, MOSHTAGHIAN J, MIRLOHII M, et al. Reduction in serum lipid parameters by incorporation of a native strain of Lactobacillus plantarum A7 in Mice[J]. Iranian Journal of Diabetes and Lipid Disorders, 2010(9): 1-7.

[10] RIJKERS G T, BENGMARK S, ENCK P, et al. Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: current status and recommendations for future research[J]. The Journal of Nutrition, 2010, 140(3): 671-676.

[11] GIANOTTI L, MORELLI L, GALBIATI F, et al. A randomized double-blind trial on perioperative administration of probiotics in colorectal cancer patients[J]. World Journal of Gastroenterology: WJG, 2010, 16(2): 167.

[12] ISHIKAWA H, AKEDO I, OTANI T, et al. Randomized trial of dietary fiber and Lactobacillus casei administration for prevention of colorectal tumors[J]. International Journal of cancer, 2005, 116(5): 762-767.

[13] MIELE E, PASCARELLA F, GIANNETTI E, et al. Effect of a Probiotic Preparation (VSL# 3) on induction and maintenance of Remission in children with ulcerative colitis[J]. The American Journal of Gastroenterology, 2009, 104(2): 437-443.

[14] AUTY M A E, GARDINER G E, MCBREARTY S J, et al. Direct in situ viability assessment of bacteria in probiotic dairy products using viability staining in conjunction with confocal scanning laser microscopy[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(1): 420-425.

[15] BUNTHOF C J, ABEE T. Development of a flow cytometric method to analyze subpopulations of bacteria in probiotic products and dairy starters[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(6): 2934-2942.

[16] BUNTHOF C J, VAN SCHALKWIJK S, MEIJER W, et al. Fluorescent method for monitoring cheese starter permeabilization and lysis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(9): 4264-4271.

[17] 肖安风, 周祥山, 周利, 等. 应用流式细胞术检测毕赤酵母的细胞活性[J]. 微生物学通报, 2006, 33(6): 22-26.

[18] AMOR K B, BREEUWER P, VERBAARSCHOT P, et al. Multiparametric flow cytometry and cell sorting for the assessment of viable, injured, and dead Bifidobacterium cells during bile salt stress[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(11): 5209-5216.

[19] 汪清美, 陈庆森. 流式细胞术分析与评价酸奶菌种对模拟胃酸和胆汁盐的耐受力[J]. 食品科学, 2010, 31(21): 384-389.

[20] RAULT A, BEAL C, GHORBAL S, et al. Multiparametric flow cytometry allows rapid assessment and comparison of lactic acid bacteria viability after freezing and during frozen storage[J]. Cryobiology, 2007, 55(1): 35-43.