实时荧光聚合酶链式反应技术快速鉴定仿刺参

曹际娟1，徐君怡1，徐 杨1，荣 策2，陈 颖3

（1.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001；2.大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116034；

3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

摘 要：基于仿刺参线粒体COX1基因、NAD4基因分别设计特异性检测引物和探针，采用TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术进行仿刺参的特异性鉴定检测。对21种海参样品进行实时荧光PCR检测的特异性检验，并对每个样品做3个平行实验，计算Ct平均值、标准偏差及变异系数，评估检测方法的重复性。结果表明：所设计的引物和探针可以特异性的鉴别仿刺参，方法的变异系数均小于2%，表明本研究设计的引物和探针具有良好的重复性。本研究所建立的快速检测仿刺参的方法快速、简便，既克服了传统海参鉴别方法的局限性，同时又结合了荧光PCR技术高效率、低污染的优点，为仿刺参真伪鉴别研究提供了有价值的参考意见。

关键词：实时荧光聚合酶链式反应；鉴别；仿刺参

Rapid Identification of Apostichopus japonicas by Real-Time Fluorescence Polymerase Chain Reaction

Cao Ji-juan1, Xu Jun-yi1, Xu Yang1, Rong Ce2, Chen Ying3

(1. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China;

2. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China;

3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

Abstract: Objective: This study aimed to establish a rapid method for specific identification of Apostichopus japonicas (A. japonicas) by TaqMan® probe real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). Methods: Two sets of specific primers and probes were designed based on the COX1 and NAD4 genes of A. japonicas. Twenty-one sea cucumber samples were detected by RT-qPCR in three parallel repetitions for each sample. The average Ct value, standard deviation and coefficient of variation were calculated to evaluate the repeatability of the proposed detection method. Results: All the coefficients of variations obtained were under 2%, indicating the good repeatability and stability of this method. This is an efficient and handy method for rapid identification of A. japonicas, which overcomes the limitation of the conventional approach, and combines the merits of high efficiency and low pollution of real-time PCR. Conclusion: This study would provide a valuable reference for the identification and detection of A. japonicas.

Key words: real time fluorescence polymerase chain reaction; identification; Apostichopus japonicus

中图分类号：S917.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）08-0145-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410026

海参隶属于棘皮动物门海参纲，是海洋中一类无脊椎动物的总称。根据Pawson et Fell分类系统的划分原则，整个海参纲包含3 亚纲、6 目、24 科。迄今为止，在全世界范围内已发现900 余种海参，其中40 余种具有长期食用的记录，可作为食用海参[1-3]。仿刺参（Apostichopus japonicus）俗称辽参，从属于楯手目、刺参科、仿刺参属，是我国经济价值最高的海参品种，也是中国20多种食用海参中质量最好的一种。其种群主要分布于辽、冀、鲁、苏等北方沿岸浅海区，在日本北海道、俄属海参崴、朝鲜半岛也有生长[2]。仿刺参作为一种珍贵的海味被列为“八珍”之一，除具有其他食用海参的营养价值外，还含有一种重要营养物质——二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。DHA对大脑细胞，特别是神经传导和突触的生长发育有着极重要的作用。此外，仿刺参含有硫酸软骨素，有助于人体生长发育，能够延缓肌肉衰老/增强机体的免疫力。近几年，随着人们对仿刺参营养价值的认识以及仿刺参价位的飙升，已出现以次充好、作假造假的现象。因此开展精准的仿刺参鉴别方法研究具有重要意义。

仿刺参线粒体的遗传方式为经典的母系遗传，不存在父本杂交[4]，因此线粒体DNA可作为仿刺参鉴定的最理想的物种标识基因。仿刺参线粒体DNA序列全长16096bp，共编码13个蛋白基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因[5]。其中COX1（细胞色素C氧化酶亚单
位Ⅰ）基因与16S rRNA基因是目前海参鉴定研究中应用最广泛的靶标序列。本研究基于仿刺参线粒体COX1基因、NAD4（脱氢酶基因亚基Ⅳ）基因分别设计特异性检测引物和探针，采用TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术进行仿刺参的特异性物种鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉和肉制品DNA提取试剂盒（Takara Code：D830）、Premix Ex Taq™（Takara Code：RR390A）、引物、探针由宝生物工程（大连）有限公司合成。本研究将21种在中国境内作为商品进行销售的海参作为实验样本（表1），其中仿刺参10种、其他种海参11种。所有实验样本均参考《中国动物志：棘皮动物门：海参纲》[2]及相关网络数据库[6-11]进行严格的形态学鉴定，确保实验样品的准确性。

表 1 海参样品信息

Table 1 List of sea cucumber samples

注：*.种名未知，以商品名代替；**.科/属的拉丁名如下：刺参科Stichopodidae、海参科Holothuriidae、尻参科Caudinidae、仿刺参属Apostichopus、刺参属Stichopus、梅花参属Thelenota、拟刺参属Parastichopus、海参属Holothuria、辐肛参属Actinopyga、海地瓜属Acaudina。

1.2 仪器与设备

Light Cycler® 480实时荧光PCR仪 瑞士Roche公司；Biofuge Primo R高速离心机 德国Thermo Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针设计

本研究采用DNAMAN V6进行序列比对，使用Primer Express 3.0进行引物及探针设计，根据仿刺参COX1基因序列设计引物COXF/COXR和探针COXP；根据仿刺参NAD4基因序列设计引物NADF/NADR和探针NADP，均用于特异性地鉴别仿刺参。所有引物和探针均通过BLAST进行确认，理论上不存在非特异性扩增的可能性。

表 2 仿刺参COX1基因和NAD4基因鉴定的引物和探针序列

Table 2 The primer and probe sequences designed based on the COX1 and NAD4 genes of Apostichopus japonicas

注：*.为了增加检测的特异性，所有引物和探针的设计均参考了多条Genbank登录序列。

1.3.2 核酸提取

取50 mg海参体壁（用灭菌剪刀尽量剪碎），放入装有0.5 mL DNA提取试剂的离心管中。将离心管置于水浴锅中70 ℃加热10 min（每隔2～3 min用手轻弹混匀）。然后置于离心机中12 000 r/min离心10 min（4 ℃）。此时离心管中将会分成4 层，即油脂层、含DNA的水层、组织残渣、吸附树脂。用移液枪吸取250 μL含DNA的水层作为PCR的模板。

1.3.3 实时荧光PCR扩增及结果判定

反应体系总体积为25 μL，其中：模板 DNA（10～100 μg/mL）2 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）
各0.5μL、探针（5 μmol/L）1 μL、Premix Ex Taq™（2×）12.5 μL、水8.5 μL。

反应条件如下：95 ℃预变性30 s（1 个循环）；95 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸34 s（40 个循环）。荧光阈值为设备默认值。

参照SN/T 2051—2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法：实时PCR法》[12]，结果判定原则为：扩增曲线指数期明显，且Ct≤35.0判定为阳性，表明检测样本为仿刺参。除此以外，均判定为阴性。

1.3.4 特异性和重复性实验

以22种海参DNA为模板，分别采用表2中的COX1和NAD4引物探针进行方法的特异性实验。每个样品做
3个平行实验，并计算Ct值的平均值、标准偏差及变异系数，从而评估检测方法的重复性。

2 结果与分析

2.1 特异性

如图1所示，表1中编号为A.jap 1～10的10种仿刺参样品，分别采用COX1引物探针和NAD4引物探针进行实时荧光PCR扩增，扩增曲线指数期明显，且Ct≤35.0（表3），即检测结果均为阳性。而表1中的其他11种海参的检测结果均为阴性。结果表明，本研究针对COX1基因和NAD4基因设计的引物和探针均能特异性地鉴别检测仿刺参。

1.编号为A.jap 1～10的10种仿刺参；2～4分别为绿刺参、花刺参、梅花参的部分代表样品。

图 1 采用COX1引物探针（A）和NAD4引物探针（B）
进行实时荧光PCR扩增的图谱

Fig.1 Real-time PCR amplification plots with COX1 probe (A) and NAD4 probe (B)

2.2 重复性

表 3 方法的重复性实验结果

Table 3 Repeatability of the proposed PCR method

以编号为A.jap 1～10的10种仿刺参为对象，针对COX1基因和NAD4基因，每个样品做3份平行检测，以验证方法的重复性，结果见表3。结果表明，本研究所建立的检测方法的变异系数均小于2%，即方法的平行检测Ct值基本无差别，检测方法具有良好的重复性。

3 讨 论

海参、鱼类等水产加工品的真伪鉴定目前已经成为水产加工业中面临的重要问题。传统鉴定方法的主要依据是海参的外部形态与骨片特征。廖玉麟等[2]根据传统鉴定方法对我国134种海参进行了详尽的统计。然而，目前的商品海参通常经过蒸煮、腌制、烘烤、晒干等加工过程，最终以干品形式进行销售。因此，商品海参与活体海参在外部形态上存有较大差异。骨片指的是海参真皮表层所包含的内骨骼，其形状、大小常随种类而异，因此成为海参种类鉴定的主要手段[2]。但是，某些海参并非仅具有唯一一种骨片样式，例如绿刺参（Stichopus chloronotus）、智利海参（Athyonidium chilensis）就存在3种类型的骨片，而红腹海参（Holothuria edulis）则有
4种骨片样式[13]。因此，应用传统方法鉴定海参的工作仅限于具有丰富鉴别经验的专业人员，这使得对海参种类的鉴别难以普及。而加工后的海参更无法从形态上加以鉴别，需要采用分子生物学方法手段才能得以实现。

分子生物学技术是目前物种鉴定领域中应用最为广泛的一类方法，能够有效地解决生物体表现型无法真实反映物种种类的问题。目前，已有许多研究采用了分子生物学技术对海参、鱼类等水产加工品进行物种鉴别。姚琳等[14]综述了基于DNA检测技术鉴定水产加工品原料的研究进展，分析了不同鉴定方法的优缺点，举例说明了这些方法的实际应用。李新光[15]和Zhang[16]等应用DNA条形码技术进行鱼肉及其制品鉴别研究。梁君妮等[17]根据海参COX1基因与16S rRNA基因分别设计引物，采用普通PCR、克隆、测序等技术鉴别了包括仿刺参在内的11种海参。文菁等[18]应用3种核酸内切酶对海参16S rRNA基因片段的PCR产物进行酶切，建立了应用限制性片段长度多态性技术鉴定16种海参的方法。律迎春等[19]应用普通PCR、硝酸纤维素膜斑点杂交技术对仿刺参进行特异性的鉴定，并初步验证了斑点杂交方法应用于海参品种鉴定的可行性。陈丽梅等[20]利用COI基因分析了4种海参的进化关系。然而，上述方法均存在着操作繁琐、不易推广的缺点。与前述方法相比，实时荧光PCR技术具有快速、准确、简便的优势，并在虾[21]、鱼[22]、鹿[23]等真伪鉴别中被广泛应用。

本研究在设计引物和探针的过程中发现，不同种群仿刺参的COX1、NAD4基因在某些位点上存在碱基的单点突变，而这一发现某些研究结论相一致[24-25]。然而突变碱基的位点并无规律可言，且基因内的其他位点能否会出现类似的单点突变也很难断定。针对这一问题，本研究一方面在设计引物及探针过程中尽量避开碱基突变的位点，另一方面又建立了针对线粒体COX1和NAD4基因同时特异性检测的方法，增加了鉴定结果的可靠性。

本研究应用实时荧光PCR技术，建立了一种快速鉴定仿刺参物种的方法。整个检测过程可在2h内完成。此方法既克服了传统海参鉴别的局限性，同时又结合了荧光PCR技术高效率、低污染的优点，为仿刺参的真伪鉴别研究提供了有价值的参考意见。

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