聚合酶链式反应快速检测畜肉食品中鸭源性成分

史艳宇1,刘金华2,王 莹1,邴 炜1,华 蕾1,刘晓晖1,王 颖1,周 亮1,王 潇1

(1.吉林省产品质量监督检验院,吉林 长春 130022;2.吉林出入境检验检疫局,吉林 长春 130062)

 

摘 要:目的:建立一种快速、特异、灵敏的鸭源性成分检测方法。方法:以鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ(CO)基因序列为靶位点设计引物,进行聚合酶链式反应扩增,建立鸭源性成分检测方法;以常见畜禽肉,包括羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等参考动物物种进行特异性检测;以50 mg/kg羊肉DNA作为稀释液,对鸭肉DNA进行梯度稀释,检测灵敏度。结果:该方法能够有效的对鸭源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高(0.1 μg/kg),且羊肉成分的存在对鸭肉灵敏度检测没有影响,可以快速、准确检测畜肉食品中掺杂的鸭源性成分。

关键词:鸭源性成分;细胞色素C氧化酶Ⅲ基因;聚合酶链式反应;检测

 

A Polymerase Chain Reaction Method for Rapid Detection of Duck-Derived Materials in Meat Products

 

SHI Yan-yu1, LIU Jin-hua2, WANG Ying1, BING Wei1, HUA Lei1, LIU Xiao-hui1, WANG Ying1, ZHOU Liang1, WANG Xiao1

(1. Jilin Product Quality Supervision Inspection, Changchun 130022, China;

2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China)

 

Abstract: This report describes a rapid polymerase chain reaction (PCR) method to detect duck-derived DNA by using primers corresponding to the duck CO gene. The method was duck specific, free from interference from lumb DNA (50 mg/kg). Its sensitivity was sufficient to detect as low as 0.1 μg/kg duck-derived materials. It can provide a rapid and accurate way to identify duck-derived materials adulteration in meat products without interference of mutton DNA.

Key words: duck-derived materials; cytochrome oxidase Ⅲ (CO) gene; polymerase chain reaction (PCR); detection

中图分类号:S853.74 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)08-0163-03

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410030

市售牛羊肉及肉制品中,很多都掺杂鸭肉以冒充牛羊肉进行销售;为弥补羊肉味不足,有些不法商家甚至掺入羊肉粉、羊肉精膏等添加剂来粉饰其掺假行为。为了确定畜肉食品的真实性,已经有很多动物源性成分鉴别的方法,包括物理、化学、免疫学和分子生物学等方法,其中尤以分子生物学方法中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)最为快速且灵敏[1-16],其中相关标准也很多,涵盖牛、羊、猪、狗、鸡、马、驴、鹿、兔、骆驼等动物种类[17-22],但尚无对鸭源性成分鉴别检测的相关标准,满足不了检测需求。

研究中建立的畜肉食品中鸭源性成分鉴别检测方法,采用主要选择鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ(CO)DNA 作为研究对象,设计了PCR特异性引物,建立了PCR技术鉴别检测鸭源性成分的方法,适用于不同类型的样品检测,操作简便,准确可靠,灵敏度高,实用性强。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

家鸭(雁形目鸭亚科河鸭属的绿头鸭[23])、羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉均购于长春市地方市场;冰冻羊肉卷、肉板、酱鸭脖、酱鸭肠等畜肉加工食品购于长春市超市。

AxyPrepTM DNA提取试剂盒 美国Axygen公司;Ex TaqDNA聚合酶、dNTP(各10 mmol/L)、10×缓冲液、6×Loading buffer、100 bp DNA Ladder Marker、PCR引物合成 宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 仪器与设备

Microfuge 22R高速冷冻离心机 美国Beckman公司;IKA M20食物研磨器 德国IKA公司;Biometra T gradient-96PCR扩增仪 德国Biometra公司;BioSpecmini DNA/RNA/蛋白分析仪 日本岛津公司;SAVANT PS500A电泳仪 美国Axygen公司;EDAS290凝胶成像系统 美国柯达公司;HH-S恒温水浴锅 上海博珍仪器设备制造厂。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

取500 mg固体样品加入50 mL离心管,加入约2 倍体积的双蒸水,充分混匀,12 000 r/min离心5 min并弃去上清液,重复1次,必要时用三氯甲烷清洗样品1次。酱汁等悬乳浊或浊状的液体食品样品可以通过添加电解质(无机酸、碱、盐类)等物理方式破坏胶体稳定性再分离、浓缩。取500 mg样品加入2 mL离心管,12 000 r/min离心5 min并弃去上清液,再次加入500 mg样品,12 000 r/min离心5 min并弃去上清液,必要时用三氯甲烷清洗样品1 次。

1.3.2 DNA提取

按试剂盒说明书提取DNA,并用DNA分析仪检测其纯度及浓度。

十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB)法提取DNA:取200 mg研磨成粉状的样品于1.5 mL离心管中,加入600 μL CTAB、15 μL蛋白酶K、65 ℃温育30 min;加入500 μL酚-氯仿-异戊醇(25241,V/V)混合液剧烈振荡,12000 r/min离心15 min;吸取上清液加入等体积异丙醇,剧烈振荡后12000 r/min离心10 min,弃上清液;用70%乙醇洗涤2~3次,弃上清液;用200 μL TE缓冲液溶解;加等体积氯仿-异戊醇(241,V/V)重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其纯度及浓度。

1.3.3 引物设计

在GenBank中检索到的1个潜鸭族基因全序列(accession AF090337)、其绿头鸭的mtDNA部分序列(accession L22476、L16770、L22477)及家鸭线粒体CO基因序列(accession DQ655706)。用Lasergene软件中的MegAlign对基因序列进行序列同源性比较分析,根据基因序列中同源性较高部分用Primer Express 3.0设计引物。在GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中,经Blast软件对相似序列搜索后,筛选出一套最优且与常见畜禽肉无交叉反应的引物。正向引物:5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’,反向引物:5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’,扩增片段201 bp。

1.3.4 反应体系和反应条件

反应体系(共25 µL):10×Ex Taq Buffer(Mg2+ plus)2.5 µL,dNTP s Mixture(各10 mmol/L)0.5 µL,上下游引物(10 µmol/L)各1 µL,Ex Taq(5 U/µL)0.2 µL,模板DNA 2 µL,补水至25 µL。

反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环;最后72 ℃延伸10 min。

1.3.5 特异性实验

分别用羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等对引物进行特异性实验。

1.3.6 灵敏度实验

用羊肉DNA(50 mg/kg)溶液对鸭肉DNA进行10倍梯度稀释,使羊肉DNA中分别含有100、10、1 mg/kg和100、10、1、0.1 µg/kg的鸭肉DNA,进行PCR扩增,观察该方法灵敏度及羊肉成分的存在对鸭肉检测灵敏度的影响。

2 结果与分析

2.1 引物特异性

在优化好的PCR反应体系和反应条件下,以羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等DNA为特异性实验对照进行PCR检测。电泳结果显示,仅有家鸭被扩增出条带,而其他对照以及空白对照均未扩增出条带(图1)。

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M.100 bp DNA Marker;1.家鸭;2.鸡;3.鹅;4.羊;5.牛;6.兔;7.马;8.鹿;9.空白对照。

图 1 PCR特异性检测结果

Fig.1 Specificity of the PCR method

2.2 灵敏度

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M. 100 bp DNA Marker;1. 100 mg/kg;2. 10 mg/kg;3. 1 mg/kg;
4. 100 µg/kg;5. 10 µg/kg;6. 1 µg/kg;7. 0.1 µg/kg;8.阴性对照。

图 2 PCR灵敏度检测结果

Fig.2 Sensitivity of the PCR method

对用羊肉DNA溶液稀释的各质量浓度鸭肉DNA进行PCR检测,结果显示,设计的引物对鸭肉的检测敏感度可达到0.1 µg/kg。同时,高质量浓度羊肉DNA的存在并不影响鸭肉的检测灵敏度(图2)。

2.3 市售羊肉卷和肉板中鸭源性成分的检测

应用特异引物对2份市售的羊肉卷及肉板(经证明已掺入鸭肉)进行PCR检测,结果表明该方法能有效检测出试样中掺入的鸭源性成分(图3)。

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1.阴性对照;2. 100 bp DNA Ladder Marker;3.羊肉卷;4.肉板。

图 3 检测样品中的鸭源性成分

Fig.3 Qualitative detection of duck-derived materials in commercial meat products

2.4 市售加工肉制品中鸭源性成分的检测

加工肉制品由于需要经过高温处理或添加盐类等调料制品,这些处理方式对DNA的提取效果均有影响。应用特异性引物对市售的鸭脖、鸭肠制品进行PCR检测,结果表明样品通过洗涤方式去除样品中的盐、糖和色素后,经PCR扩增仍能够检测出鸭源性成分(图4)。

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1. 100 bp DNA Ladder Marker;2.鸭肠;3.鸭脖。

图 4 检测加工制品中的鸭源性成分

Fig.4 Qualitative detection of duck-derived materials in
processed meat products

3 结 论

本研究根据鸭CO基因序列设计特异性引物,成功建立了鸭源性成分的PCR检测方法,填补了鸭源性成分检测方法及标准的空白。

在本研究中,对所设计引物进行特异性预测及实际检验,结果表明所用引物与常见畜禽物种间无同源性,引物具有较高的特异性。另外,采用50 mg/kg羊肉DNA溶液对鸭肉DNA进行稀释,结果表明较高质量浓度羊肉DNA的存在不影响鸭肉检测的灵敏度(0.1 μg/kg),能够满足实际检测需要。另外,肉制品经加工等工序后,DNA会受到影响,特别是加热时DNA片段会变短,因此要求引物扩增的目的片段较短[24-25]。本研究中设计的引物所扩增的目的片段为201 bp,适于加工的肉制品中鸭源性成分的检测。本研究中所采用方法可应用于肉制品掺假诊断、食品生产环节污染监控及食品监督部门检测等各个领域,为检测食品中掺假、造假提供技术支持,同时为食品安全工作顺利开展打下良好技术基础。

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收稿日期:2013-07-10

基金项目:国家质检总局科技计划项目(2012QK169)

作者简介:史艳宇(1977—),女,高级工程师,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:shiyanyu219@163.com