离子交换固相萃取结合超高效液相色谱-串联
质谱法测定豆制品中乌洛托品残留量

马雪涛，牛之瑞，冯 雷，谭健林

（云南省产品质量监督检验研究院，云南 昆明 650223）

摘 要：建立了离子交换固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱测定豆制品中乌洛托品残留量的分析方法。通过0.4%高氯酸提取，固相萃取净化，超高效液相色谱-串联质谱在正离子模式下，通过多反应监测方式进行检测。比较了Strata-SCX、SepPak C18和Cleanert PCX三种不同的固相萃取小柱对豆制品中乌洛托品残留量的净化和富集，其中Cleanert PCX净化效果最好。在添加水平为5.0 μg/kg和50.0 μg/kg时，3种豆制品中乌洛托品的回收率范围在76.0%～83.6%，相对标准偏差低于6%。方法具有快速、灵敏、准确、重复性较好的特点，适合于日常大批量样品的测定。

关键词：乌洛托品；超高效液相色谱-串联质谱；豆制品

Determination of Urotropine Residue in Processed Soybean Products by Ion Exchange Solid-Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Xue-tao, NIU Zhi-rui, FENG Lei, TAN Jian-lin

(Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Kumming 650223, China)

Abstract: An analytical method for the determination of urotropine residue in processed soybean products was developed using ion exchange solid-phase extraction coupled with ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). Samples were extracted with 0.4% perchloric acid followed by clean-up using solid-phase extraction. The analysis was carried out under negative electrospray ionization mode using multiple reaction monitoring. Cleanert PCX cartridge showed better clean-up and enrichment than Strata-SCX and SepPak C18 cartridges for urotropine residue. The average recoveries of urotropine in three kinds of processed soybean products at spiked levels of 5.0 and 50.0 μg/kg ranged from 76.0% to 83.6% with relative standard deviations (RSDs) smaller than 6%. This method is rapid, sensitive, accurate, repeatable and suitable for routine analysis of large-scale samples.

Key words: urotropine; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); processed soybean products

中图分类号：O657.63；O657.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）10-0166-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410031

乌洛托品即六亚甲基四胺是一种化工产品，可用作酚醛塑料的固化剂、氨基塑料的催化剂等用途[1-3]。由于乌洛托品在酸性溶液中能分解放出甲醛和氨而具有杀菌作用，常用于医学上消毒防腐药物。近些年来有些不法豆制品生产厂家为了延长其产品的保质期和保持产品的色泽违规使用乌洛托品作为防腐保鲜剂，对豆制品质量安全和消费者身体健康带来安全隐患[4]。因此，对豆制品中乌洛托品含量检测与控制显得尤为必要。

乌洛托品的分析方法主要有分光光度法[5]、离子电极法[6]、气相色谱法[7-8]、液相色谱法[9]等，实际应用中以气相色谱法和液相色谱法居多，这两种方法都存在灵敏度不高，且溶液出现假阳性结果的弊端[10-12]。液相色谱与串联质谱的联用，使得检测结果的灵敏度显著提高，同时对阳性样品进行确认。

本实验研究固相萃取对乌洛托品的净化和富集，建立离子交换固相萃取结合液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer，UPLC-MS-MS）对豆制品中乌洛托品残留量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆腐皮样品购于昆明市场；乌洛托品标准品（纯度99.2%） 德国Dr. Ehrenstorfer GmnH公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸铵（均为色谱纯） 美国Fisher公司；氨水（分析纯） 重庆川东化工有限公司；高氯酸（分析纯） 金鹿化工有限公司；Strata-SCX固相萃取小柱（3 mL/60 mg） 美国Phenomenex公司；SepPak C18固相萃取小柱（6 mL/500 mg） 美国Waters公司；Cleanert PCX固相萃取小柱 美国Agela Technologies公司。

1.2 仪器与设备

UFLC-20A高效液相色谱 日本Shimadzu公司；API3200三重四极杆串联质谱联用仪 美国Applied Biosystems公司，CAPCELL PAK（CR）色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 µm） 日本Shiseido公司；Shim-pack XR-ODS色谱柱 （75 mm×3.0 mm，2.2 µm） 日本Shimadzu公司；GL-12B高速离心机 上海安亭科学仪器厂；N-EVAP氮吹仪 美国Organomation公司；CPA225D电子天平 德国Sartorius公司；十二孔固相萃取装置 美国Waters公司；Omni均质机 美国Pulsafeeder公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取10 mg乌洛托品标准品，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的标准物质储备溶液，避光保存于－20 ℃冰箱中。准确量取标准储备溶液1.0 mL，V（体积分数0.1%乙酸）∶V（乙腈）=8∶2溶解并定容至100 mL，质量浓度相当于1.0 μg/mL，使用时，以V（体积分数0.1%乙酸）∶V（乙腈）=8∶2稀释成2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 mg/L供高效液相色谱-串联质谱测定。

1.3.2 样品的制备

取样品中有代表性的约200 g，用组织捣碎机捣碎，准确称取2 g试样（精确到0.01 g）于10 mL比色管中，加入体积分数0.4%高氯酸溶液定容至10 mL，用均质器以10 000 r/min均质2 min，再以10 000 r/min离心5 min，取出上清液于50 mL离心管中，加入10 mL石油醚，用均质器以10 000 r/min均质2 min，再以10 000 r/min离心5 min，用滴管吸去有机相，留水相备用。

1.3.3 净化

固相萃取柱使用前分别用3 mL甲醇和体积分数0.4%高氯酸溶液预处理，并保持柱体湿润。准确吸取4.0 mL水相溶液过固相萃取柱，依次用3.0 mL体积分数0.1%乙酸，1.0 mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去流出液，在2 kPa以下减压抽3 min使柱体干涸；用6.0 mL V（氨水）∶V（甲醇）=5∶95洗脱，洗脱液在40 ℃下用氮吹仪浓缩至近干，用1.0 mL V（体积分数0.1%乙酸）∶V（乙腈）=8∶2溶解残渣，经0.22 mm滤膜过滤，供LC-MS-MS测定。

1.3.4 色谱-质谱条件

色谱条件：流动相A相为10 mmol/L乙酸铵溶液（用乙酸调pH值到4.5），流动相B为乙腈，流动相梯度见表1。流速：0.4 mL/min；进样量5 μL；柱温：40 ℃。

表 1 流动相的梯度洗脱程序

Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

质谱条件：扫描方式：电喷雾正离子模式（electrospray ionization mass，ESI+）；检测方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；喷雾电压：5 500 eV；气帘气：68.9 kPa；碰撞气：68.9 kPa；去溶剂温度：450 ℃；雾化气：413.5 kPa；辅助气：344.6 kPa；其他参考条件参见表2。

表 2 乌洛托品的质谱分析参数

Table 2 Mass spectral parameters for urotropine analysis in MRM mode

注：*. 定量离子对。

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件的优化

分别比较了CR和XR-ODS两种不同类型的色谱柱，前者分离效果较好。乌洛托品属于低分子质量高极性化合物，在反相材料C18的色谱柱上保留时间较短，无法和干扰物质完全分离，需要使用离子对试剂才能获得较好的分离效果，而离子对试剂会对质谱产生损害，所以无法应用。在CR色谱柱上，由于其分子结构中含有氨基活性基团，保留时间相对较长，峰型较好，而且，可以通过调节流动相pH值调节乌洛托品在色谱柱上的保留时间。相对于标准SN/T 2226—2008《进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法：液相色谱-质谱-质谱法》中推荐使用的HILIC色谱柱，实验组对峰型也进行了比较，二者相差不多。因此，本实验最终选择使用CR色谱柱进行分离。

2.2 质谱条件的优化

同时考察了不同溶剂对乌洛托品质谱响应的影响，包括V（水）∶V（乙腈）=9∶1、0.1%（体积分数）乙酸水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸铵溶液（pH 4.5）-乙腈等溶液对质谱响应的影响，结果证明采用10 mmol/L乙酸铵溶液（pH 4.5）-乙腈体系时乌洛托品的响应最强，同时考虑到乌洛托品在酸性溶液中较为稳定，因此采用10 mmol/L乙酸铵溶液（pH4.5）-乙腈体系作为流动相，以体积分数0.1%乙酸水溶液-乙腈水溶液作为样品定容溶液。

采用10 mg/mL乌洛托品标准溶液以针泵直接进样的方式，分别在正负离子模式下进行母离子扫描，以确定乌洛托品的准分子离子，乌洛托品在正离子模式下灵敏度比负离子模式下响应要高，且稳定性好。然后再以准分子离子m/z 141.1作为母离子，对其子离子进行全扫描。对碰撞能量、去簇电压等质谱条件优化后得到子离子m/z 112.1和m/z 85.1，选取干扰小、丰度强的离子对141.1/85.1作为定量离子对，优化后的质谱参数见表2。

2.3 固相萃取小柱的选择

本实验研究了SN/T 2226—2008中的样品前处理方法[13]，发现该方法相对繁琐，且在处理豆制品样品时油脂较难去除干净，所以选择采用水相提取的办法。分别选用乙腈、甲醇和体积分数0.4%高氯酸溶液进行提取效率实验，结果表明三者提取效率均能满足要求，其中用乙腈、甲醇提取样品基质时，样品中油脂较多，对接下来进行的净化和仪器测定有一定的影响，体积分数0.4%高氯酸溶液提取时，溶出杂质少，对大分子基质具有一定的沉降作用，同时可以简化操作步骤，最终采用体积分数0.4%高氯酸溶液作为提取溶剂。

表 3 3种固相萃取小柱的回收率精密度实验（n=5）

Table 3 Effect of solid-phase extraction cartridges on the recovery and precision (n = 5)

质谱MRM模式下，样品基质对测定的干扰较大，故在实验设计时考虑采用SPE小柱对样品进行净化[14-18]。采用相同的提取方法，分别采取Strata-SCX、SepPak C18和Cleanert PCX固相萃取小柱对样品进行净化，通过对回收率及RSD的比较，选择出最佳的处理方案。通过反复试验，对确定净化操作的淋洗和洗脱条件进行了优化，确定步骤为用3.0 mL体积分数0.1%乙酸、1.0 mL甲醇淋洗，用6.0 mL V（氨水）∶V（甲醇）=5∶95洗脱，洗脱液在40 ℃下用氮吹仪浓缩至近干，用1.0 mL V（体积分数0.1%乙酸）∶V（乙腈）=8∶2溶解残渣。这样操作，一方面可以最大程度地降低基质干扰，另一方面保证了较好的回收率及重复性。通过比较，发现C18柱效果较差；在使用Strata-SCX和Cleanert PCX固相萃取小柱时，回收率都相对较高，3种固相萃取小柱的回收率结果见表3。这是由于乌洛托品在C18小柱硅胶基的硅烷化填料上保留时间很短，极易被洗脱，所以整个净化过程也较难控制，乌洛托品的回收率较差。乌洛托品分子结构中带有氨基，呈弱碱性，利用其在酸性条件下带正电，具有阳离子交换特性，选择带有强阳离子交换反相吸附剂的固相萃取柱进行选择性交换吸附，再通过氨化甲醇将其替换洗脱下来，能够取得更好的富集浓缩效果。但相比较而言，Strata-SCX检测时，其采用的填料过细，极易堵塞，不适合批量样品检测；而Cleanert PCX操作简便，因此更加适用于豆制品中乌洛托品残留量的检测工作。

2.4 方法线性范围和定量限

以空白豆腐皮作为基质空白，将乌洛托品配制成相应浓度的系列标准溶液添加到空白样品当中，以乌洛托品的峰面积作为纵坐标，乌洛托品的质量浓度2.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 µg/L作为横坐标进行线性回得方程y=397x－976，结果表明乌洛托品在2.0～500.0 µg/L时，相关系数为0.999，相关系数良好。根据3 倍信噪比确定该方法的检出限为2 μg/kg，10倍信噪比确定该方法的定量限为5 µg/kg。乌洛托品的50.0 μg/L
基质标准溶液总离子流图见图1。

质量浓度为50.0 µg/L。

图 1 乌洛托品总离子流图

Fig.1 TIC chromatogram of urotropine standard solution at 50.0 μg/L

2.5 回收率、精密度实验

分别进行5.0、50.0 μg/kg的回收率实验，每份样品重复测定3 次，结果见表4。从表4可知，其平均回收率分别为76.0%～83.6%，相对标准偏差均小于6%。

表 4 回收率精密度实验（n=6）

Table 4 Average recoveries and precision (RSD) of urotropine in real samples (n = 6)

2.6 实际样品的测定

通过对昆明市场上的30个样品进行测定，并未发现阳性样品，结果表明昆明市场上豆制品未发现非法添加乌洛托品的违法行为。

3 结 论

本方法采用Cleanert PCX固相萃取小柱对样品进行处理，超高效液相色谱-串联质联用方法检测豆制品中的乌洛托品。本方法具有分析速度快、操作简单、高选择性和高灵敏度的特点。

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