氢化物发生-原子荧光光谱法测定富硒
杂粮中的有机硒和无机硒

刘 恒，马 盼，王浩东，黄 婷*

（安康学院化学化工系，陕西 安康 725000）

摘 要：采用氢化物-原子荧光光谱法与无水乙醇提取相结合的方法测定了富硒杂粮中总硒、无机硒和有机硒的含量，并对仪器的试验参数进行优化。结果表明，富硒杂粮样品中硒主要以有机硒的形态存在，占硒总量的63.02%～95.10%，其中黄玉米有机硒含量最高，达到95.10%。该方法检出限为0.01 μg/L，总硒回收率为97.31%～103.53%，无机硒回收率96.10%～105.45%。本方法操作简单、灵敏度高、回收率好，适合富硒杂粮有机硒和无机硒的测定。

关键词：氢化物-原子荧光光谱法；有机硒；无机硒；富硒杂粮

Determination of Organic Selenium and Inorganic Selenium in Selenium-Enriched Grains by
Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry

LIU Heng, MA Pan, WANG Hao-dong, HUANG Ting*

(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Ankang University, Ankang 725000, China)

Abstract: A novel method for the determination of inorganic, organic and total selenium in Se-enriched grains was developed using hydride generation-atomic fluorescence spectrometry (HG-AFS) after anhydrous ethanol extraction. The instrumental parameters were optimized. The results showed that selenium was found to exist mainly in the form of organic Se compounds in selenium-enriched grains in the range of 63.02%–95.10% relative to total Se amount. Among the selenium-enriched grains investigated, yellow corn was the richest in organic Se, accounting for 95.10% of total Se amount. The detection limit (3σ) of the proposed method was 0.01 μg/L. Recoveries ranged from 97.31% to 103.53% for total Se and 96.10% to 105.45% for inorganic Se. This method has the advantages of simple operation, high sensitivity and high recovery rate, and is suitable for the determination of organic selenium and inorganic selenium in selenium-enriched grains.

Key words: hydride generation-atomic fluorescence spectrometry (HG-AFS); organic selenium; inorganic selenium; selenium-enriched grains

中图分类号：O657.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）10-0170-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410032

硒是人和动物体内必须的微量元素之一[1]。人体内含硒量约为14～20 mg，主要分布在肝、肺、皮肤、肾等部位，其中的1/3存在于肌肉尤其是心肌中[2]。食物中硒分为有机硒和无机硒，人们对无机硒吸收和利用不是很理想，其生物有效性低，毒性较大，中毒量与需要量之间范围小，因而被严格限制其使用量，而与无机硒相比，有机硒安全性高，不易发生中毒，生物利用率高[3]，因此特别受欢迎。随着生活水平的改善，测定食品中硒含量及硒形态对健康营养膳食的制定和指导人体内硒的摄入量具有科学指导意义。

目前，测定硒的方法主要有联苯胺比色法[4]、石墨炉原子吸收法[5-6]、分光光度法[7-8]、电感耦合等离子体发射光谱法[9]、高效液相色谱法[10-11]、氢化物-原子荧光光谱法[12-13]，其中氢化物-原子荧光光谱法（hydride generation-atomic fluorescence spectrometry，HG-AFS）具有操作简单、干扰少、灵敏度高的特点[14-16]。本实验主要以无水乙醇作为无机硒提取剂并结合HG-AFS方法测定杂粮中的总硒、无机硒及有机硒的含量，确定提取无机硒所用乙醇最佳体积分数，并简化实验操作，提高实验准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验选取陕西省安康市平利县富硒地带的玉米、大豆等11 种富硒杂粮。样品先用自来水反复冲洗3 次去除上面附着的土壤等杂质，然后用超纯水冲洗，剔除不可食用部分，放在60 ℃烘箱里烘干，待其冷却用粉碎机粉碎，待用。

硼氢化钾、5 g/L氢氧化钾、无水乙醇、10 μg/L铁氰化钾（均为分析纯），盐酸、硝酸、高氯酸（均为优级纯） 广州万从化工有限公司；超纯水。

1.2 仪器与设备

AFS-8X双道原子荧光光度计 北京吉天仪器有限公司；超纯水机 重庆摩尔水处理设备有限公司；800型离心沉淀器 上海手术器械厂；FW-100高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；KH2200DE数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；HH-S4型电热恒温水浴锅、Mb可调式电热板 北京科伟永兴仪器有限公司；MARS Xpress微波消解仪 美国CEM公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

混合酸：硝酸∶高氯酸=4∶1（配比与样品有关）；硼氢化钾溶液（10 g/L）∶取10 g KBH4溶于1 000 mL 5 g/L
的KOH溶液中（现用现配）；硒标准储备液：准确称取0.200 0g高纯硒粉，根据测量总硒的预处理方法进行处理，然后转入1 000 mL容量瓶中定容备用。

1.3.2 仪器条件设置

负高压270 V；灯电流60 mA；原子化器温度200 ℃；原子化器高度8.0 mm；载气流量400 mL/min；屏蔽气流量1 000 mL/min；读数时间10.0 s；延迟时间1.0 s；进样方式为自动进样。

1.3.3 总硒含量测定

称取各种样品粉末1.000 0 g于消解罐中，加入混合酸10.00 mL，最佳微波消解条件下进行消解。待消解基本完成后，用超纯水将消解液转移到50 mL三角瓶中，于电热板上加热（150～180 ℃），赶酸至2 mL左右，当样品清澈透明且冒出白烟时取下，冷却后加入6 mol/L的盐酸5.00 mL加热20 min后，加入1 mL铁氰化钾（10 g/L）并用超纯水定容至25.00 mL，用原子荧光光度计进行测定，同时做空白实验。

1.3.4 无机硒的测定

取各种样品粉末1.000 0g于三角瓶中，加入15～20 mL超纯水并混合均匀，于水浴锅加热（100 ℃）蒸至形成匀浆（切勿蒸干），加入15～20 mL无水乙醇，超声提取30 min后，以4 000 r/min离心30 min，取清液于100 mL三角瓶中，剩余残渣再反复用无水乙醇进行上述提取，合并上清液。加热蒸去大部分无水乙醇，再按照 1.3.3节方法测定上清液，即无机硒的含量。

1.3.5 有机硒的测定

根据1.3.3节和1.3.4节方法利用差减法换算出有机硒的含量（有机硒含量=总硒含量－无机硒含量）。

2 结果与分析

2.1 乙醇用量的选择

图 1 乙醇体积分数对无机硒测量的影响

Fig.1 Effect of ethanol concentration on the determination of inorganic selenium

根据多糖等部分有机物易溶水而不溶于乙醇的性质，利用乙醇作为提取液比超纯水更为理想。实验考察了乙醇用量对无机硒含量的影响，见图1。结果表明，当乙醇体积分数达到80%以上时，无机硒测定结果趋于稳定，因此为使实验更为准确，选择无水乙醇作为提取液。

2.2 盐酸用量的选择

图 2 盐酸体积分数对荧光值的影响

Fig.2 Effect of f HCl concentration on fluorescent intensity

由图2可见，当盐酸用量增加时荧光值也随之增加，当盐酸体积分数在5%～15%时，荧光值（IF）基本趋于稳定且较高，考虑到盐酸用量过高会对仪器管路造成损坏，因此，采用体积分数3%的盐酸作为载流液。

2.3 硼氢化钾用量的选择

由图3可见，随着KBH4用量的增大，荧光值随之增大，但当KBH4的用量过高时，荧光值反而降低，这是因为产生的氢气量太大而稀释硒原子蒸汽造成的[17]。因此KBH4最佳质量浓度为10 g/L。

图 3 KBH4质量浓度对荧光值的影响

Fig.3 Effect of KBH4 concentration on fluorescence intensity

2.4 仪器工作条件的选择

2.4.1 灯电流的选择

灯电流选择过小，会大大降低实验的灵敏度，若灯电流选择过大，虽然光信号增强，但相应的噪音也随之增大并且引起空心阴极灯的阴极密度过大，因多普勒效应使谱线变宽并且容易发生自吸现象[18]。实验表明，当灯电流为60 mA时，仪器的精密度（相对标准偏差）基本恒定，所以采用60 mA的灯电流进行测定。

2.4.2 光电倍增管负高压的选择

实验考察Se的荧光信号随负高压的变化情况。实验结果表明，荧光信号随负高压的增大而增强，但当负高压超过270 V时，荧光信号反而降低，且不稳定，因此选择负高压为270 V。

2.4.3 原子化器温度的选择

原子化器温度在20～350 ℃时，Se的荧光信号强度随温度的升高而增强，可见升高温度提高了硒化氢的传输效率。但当温度过高时硒化氢在通过原子化器时被部分分解，从而造成荧光信号降低。实验表明，原子化温度在200 ℃时可获得较好的检测效果，因此选择原子化器温度为200 ℃。

2.4.4 载气和屏蔽气流量的选择

对不同载气流量实验结果表明，当载气流量过大时，火焰中Se原子蒸汽浓度被稀释并且在光路中停留时间较短，从而造成荧光信号降低。当载气流量过小时，硒化氢的传输效率降低而导致荧光信号降低。实验结果表明，当载气流量400 mL/min时可获得较好的检测效果，因此选用400 mL/min的载气流量。

当屏蔽气的流量在700～1 000 mL/min时可防止周围空气进入火焰避免Se与空气组分反应而降低Se质量浓度，能获得较强的荧光信号且稳定性较好。为使实验得到较好的效果选用1 000 mL/min的屏蔽气流量。

2.4.5 原子化器高度的选择

实验考察了原子化器高度对荧光信号的影响，实验结果表明，原子化器高度在8.0～9.5 mm时荧光信号较强且灵敏度较高。当原子化器高度过低时，虽然荧光信号加强，但仪器噪声加大信噪比降低，从而使仪器的精密度下降，因此选用原子化高度为8.0 mm。

2.5 标准曲线的绘制及线性范围

分别量取不同体积硒标准溶液（20 μg/L）配制质量浓度梯度，标准曲线回归方程为IF=82.778C（Se）＋9.04，线性范围为0.1～20 μg/L，相关系数R2为0.999 7。

2.6 干扰的排除

Cu2+、Bi+3、Ni+ 等离子会对硒含量的测定存在干扰[19-20]，加入一定量的铁氰化钾作掩蔽剂可以消除这些离子对硒检测的干扰，并且可以在原子化器内较好的生成硒化氢。实验结果表明，当铁氰化钾质量浓度在10μg/L时基本消除了干扰，并且对原子荧光信号无影响，从而保证结果的准确性。

2.7 样品测定

对富硒杂粮样品中总硒、有机硒和无机硒的含量的测定结果及百分比，见表1。

表 1 各种形态硒含量及所占比例

Table 1 The relative proportion of each selenium species in selenium-enriched grains

注：*.n=4，且相对标准偏差小于5%。

2.8 检出限和加标回收率的测量

表 2 各样品总硒和无机硒回收率

Table 2 Recoveries of total and inorganic Se

按照测量总硒的方法，以超纯水进行测量，根据测出的空白值计算其标准偏差（σ），按照3σ计算检出限为0.01μg/L。

对各样品待测液分别加入不同量的硒标液进行测量，得出总硒回收率为97.31%～103.53%，无机硒回收率为96.10%～105.45%，见表2。

3 结 论

采用HG-AFS结合无水乙醇提取的方法测定了杂粮中总硒和无机硒的含量，并计算出有机硒的含量。结果表明，农产品中硒主要以有机硒的形式存在，占总硒的63.02%～95.10%，可见是良好的绿色补硒食物。对实验条件进行了考察，确定乙醇、硼氰化钾、盐酸的最佳用量，实验仪器的最佳工作条件的优化，加入10 μg/L铁氰化钾可消除测量样品中Cu2+等主要金属离子的干扰。本方法操作简单、灵敏高、回收率好，适合富硒杂粮中有机硒和无机硒的测定。

参考文献：

[1] 陈铭, 谭见安. 环境硒与健康关系研究中的土壤化学与植物营养学[J]. 土壤学进展, 1994, 22(4): 1-10.

[2] 凌关庭. 保健食品原料手册[M]. 北京: 化学工业出版社, 2002.

[3] ABDULAH R, MIYAZAKI K, NAKAZAWA M, et al. Chemical forms of selenium for cancer prevention[J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2005, 19(2/3): 141-146.

[4] 陈懿. 固相分光光度法测定食品中的痕量硒[J]. 贵州农业科学, 2012, 40(4): 62-65.

[5] 刘娟, 焦华. 分光光度法测定大米中硒含量[J]. 光谱实验室, 2012, 29(4): 2376-2379.

[6] 刘娜, 朱棠君, 赵志湘. 联苯胺比色法测定饲料中有机硒的含量[J]. 中国畜牧杂志, 2010, 46(24): 54-55.

[7] 黄高明. 石墨炉原子吸收法测定富酸奶中有机硒[J]. 中国酿造, 2009, 27(5): 161-164.

[8] 弓巧娟, 杨海英. 石墨炉原子吸收法测定黑花生中的硒[J]. 分析测试学报, 2011(2): 218-221.

[9] 熊晓燕, 张永进, 王津. 电感耦合等离子体-原子发射光谱法测定高纯硒中18 种杂质元素[J]. 冶金分析, 2010, 30(7): 35-38.

[10] 韦淑毅, 钟其顶, 高红波, 等. 高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸[J]. 食品研究与开发, 2012, 33(8): 164-168.

[11] 施能进. 高效液相色谱法测定蛋氨酸硒[J]. 饲料研究, 2011(3): 40-41.

[12] BUNKER V W, DELVES H T. Accurate Determination of selenium in biological materials without perchloric acid for digestion[J]. Analytica Chimica Acta, 1987, 201: 331-334.

[13] SEHLOSKE L, WALDNER H. Marx optimization of sample pre-treatraent in the HG-AAS selenium analysis[J]. Analytical Biochemistry, 2002, 372(2): 700-704.

[14] CAPElO J L, FERNANDEZ C, PEDRAS B, et al. Trends in selenium determination/speciation by hyphenated techniques based on AAS or AFS[J]. Talanta, 2006, 68(5): 1442-1447.

[15] SMRKOL J P, STIBILJ V. Determination of selenium in vegetables by hydride generation atomic fluorescence spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 512(1): 11-17.

[16] LAVILLA I, GONZALEZ-COSTAS J M, BENDICHO C. Improved microwave-assisted wet digestion procedures foraccurate Se determination in fish and shellfish by flow injection-hydride generation-atomicabsorption spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 591(2): 225-228

[17] 李连平, 范威, 庄峙厦, 等. 蔬菜中硒总量及形态的氢化物发生-原子荧光光谱测定方法[J]. 光谱学与光谱分析, 2008, 28(12): 2975-2978.

[18] 林国辉. 原子吸收分光光度计灯电流的选择[J]. 计量与测试技术, 2012, 39(6): 17-19.

[19] 王震, 范世华, 方肇伦. 顺序注射蒸汽发生非色散原子荧光光谱法测定环境样品中痕量硒[J]. 分析化学, 2005, 33(2): 195-197.

[20] 徐宝玲. 氢化物原子荧光法测定硒时元素的干扰及其消除[J]. 分析化学, 1985, 13(1): 29-33.