二维多通道色谱法分离松多酚的条件优化

曾祥宏1，王振宇1,2,*，李 辉1，左丽丽1

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，极端环境研究所，黑龙江 哈尔滨 150090；

2.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

摘 要：以东北红松松塔为原料，采用本课题组设计的二维多通道色谱分离设备，确定其分离松多酚的最佳工艺条件。首先通过静态吸附解吸实验，筛选二维多通道色谱分离设备的固相介质和洗脱剂；然后进行单因素动态试验，考察影响二维多通道色谱设备分离效果的4 个因素：上样量、上样质量浓度、洗脱速率和色谱柱数量。结果表明：X-5大孔树脂为二维多通道色谱设备分离松多酚的最佳固相介质，0.5%甲酸-60%乙醇溶液为其最佳洗脱剂，其对松多酚的最大吸附量为 38.74 mg/g，解吸率达72.08%；二维多通道色谱设备分离松多酚的最佳工艺条件：上样量256 mg、上样质量浓度2.0 mg/mL、洗脱速率（200±20）mL/min和色谱柱联用数量4 根。在此条件下，松多酚纯度由2.37%提高到了23.257%，产率达到46.81%。

关键词：二维多通道色谱；松多酚；分离纯化；大孔树脂

Optimization of Two-Dimensional Multi-Channel Chromatographic Separation of Pine Polyphenols

ZENG Xiang-hong1, WANG Zhen-yu1,2,*, LI Hui1, ZUO Li-li1

(1. School of Food Science and Engineering, Institute of Extreme Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China;

2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Abstract: A two-dimensional multi-channel chromatographic separator designed by our research group was used to purify polyphenols extracted from the pinecones of Pinus koraiensis Sieb. et Zucc. from north-eastern China. The chromatographic conditions were optimized. The stationary and eluent were selected by static adsorption and desorption experiments. One-factor-at-a-time design was used to investigate four factors influencing the separation efficiency of polyphenols by dynamic adsorption, sample loading amount, sample concentration, eluent flow rate, and number of chromatographic columns used. Results indicated that X-5 macroporous resin was the best stationary phase for polyphenol separation and the best elutent comprised a mixture of 0.5% formic acid and 60% ethanol in water, providing maximum adsorption quantity of 38.74 mg/g and maximum desorption rate of 72.08%. The optimal experimental conditions for chromatographic separation of polyphenols were 256 mg of sample at a concentration of 2.0 mg/mL, eluent flowing at a rate of (200±20) mL/min and using 4 chromatographic columns. Under these conditions, the purity of polyphenols was increased from 2.37% to 23.257%, and the recovery was 46.81%.

Key words: two-dimensional multi-channel chromatographic separator; pine polyphenols; separation and purification; macroporous resin

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）10-0185-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410035

近些年，研究发现松科植物体内含有大量具有一系列独特理化性质和生物活性的多酚类化合物，即松属植物多酚，简称松多酚。松多酚是一种色素类天然抗氧化剂[1]，研究发现，其具有抗氧化[2-3]、抗肿瘤[4-5]、抗辐射[6]、降血糖血脂[7-8]等多种生理功能，因此开发松多酚具有广阔的市场前景。但是，大批量、工业化生产高纯度的松多酚成为制约其市场化的瓶颈。

大孔吸附树脂是一种高分子聚合物，由于其特殊的空间结构和稳定的物理化学性质，使其具有很好的吸附性和选择性，逐渐运用于活性物质的分离纯化[9-10]。目前，以大孔吸附树脂为固相介质的色谱分离纯化技术在植物功能性化学成分的分离、纯化以及富集中的应用日趋广泛[11-12]，同时，对多酚类化合物的分离纯化也有着大量的应用[13]；但是所采用的色谱分离技术大部分都是传统的柱色谱分离、液相色谱分离和逆流色谱分离技术，它们具有分离效率低、洗脱剂消耗大、分离量小、分离周期长等缺点[14-19]。因此，本课题组在传统柱色谱分离技术的基础上设计了二维多通道色谱分离设备，本实验将运用该设备，确定其分离纯化松多酚的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红松种子外壳（红松松塔），产地黑龙江省伊春。

大孔树脂 天津欧瑞生物科技有限公司；福林-酚 天津市光复精细化工研究所；没食子酸、无水碳酸钠、浓硫酸、浓盐酸、95%乙醇等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LD5-2A低速离心机 北京医用离心机厂；RE-3000旋转蒸发器 上海亚荣生化器厂；721型可见分光光度计 天津市普瑞斯仪器有限公司；DFY-500 500 g摇摆式高速中药粉碎机 浙江温岭市大海药材器械厂；JCW-1000W超声波发生器 山东省济宁市超声电子仪器；101-2A型电热鼓风干燥箱 天津市秦斯特仪器有限公司；二维多通道色谱分离设备 课题组自主设计；规格4 cm×20 cm色谱柱 定制。

1.3 方法

1.3.1 二维多通道色谱法的构建

1.3.1.1 构建原理

二维多通道色谱分离纯化设备，是一种利用目标物质与介质的吸附原理进行液体分离操作的传质系统。在传统色谱柱的基础上，将一根整体的传统色谱柱，分割成若干小的色谱柱，设立吸附域和分离域，然后通过管道和阀门连接，再由中央分配系统控制，从而形成串联模式、单通道和多通道并联多种分离纯化模式。原理如图1所示。

图 1 二维多通道色谱分离设备设计原理图

Fig.1 Schematic representation of two-dimensional multi-channel chromatographic separator

1.3.1.2 设备构成

根据原理图设计，为了使设备更加简捷化，对设备各部分进行模板集成化处理，最终由5大主要系统构成，分别为自动化控制系统、中央分配系统、检测系统、柱吸附分离体系和料液控制体系，如图2所示。

1.自动化控制系统；2.柱吸附分离体系；3.中央分配系统；4.料液控制体系；5.流量计；6.检测系统。

图 2 二维多通道色谱分离设备CAD设计图

Fig.2 CAD diagram of two-dimensional multi-channel chromatographic separator

1.3.1.3 操作流程

启动二维色谱设备进样，样品在二维多通道色谱分离设备的吸附域吸附3 h，然后水洗，直至水洗液为澄清时停止水洗。然后开启二维多通道色谱分离设备的串联模式，由静态试验确定的洗脱剂进行分离洗脱；当串联模式的出水口，出现颜色变化时立即停止分离洗脱，关闭串联模式；然后启动二维色谱并联模式，洗脱样品，收集2 个柱体积。

1.3.2 松多酚粗提物制备[20]

首先，对红松松塔进行预处理，放入烘箱烘干，温度50 ℃、时间12 h；烘干后粉碎并过30 目筛。然后，称取一定质量处理后的红松松塔原料，以1∶20的料液比加入60%乙醇提取液，超声萃取2次，超声功率1 000 W，每次超声1～2 h；合并初提液，离心处理，5 000 r/min离心5 min；取上清液并抽滤处理。最后，对处理好的初提液进行旋蒸浓缩，至无醇味，得松多酚粗提物以备用。

1.3.3 福林酚试剂法测定多酚[21]

1.3.3.1 标准曲线的建立

准确称取10 mg没食子酸，加入蒸馏水定容至100 mL，混合均匀得100 μg/mL的没食子酸标准母液，然后由标准母液配制质量浓度为10、20、30、40、50、60 μg/mL的没食子酸溶液。取0.5 mL各质量浓度没食子酸溶液，分别置于10 mL的比色管，然后加入1.0 mL的福林试剂混合，在室温条件下保持5 min；再加入1.0 mL 10%的碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至3.0 mL。在室温条件下反应2 h，以相应试剂为空白对照，测定溶液在760 nm波长处吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。

1.3.3.2 松多酚含量的测定

取一定量的松多酚提取物样品，根据情况稀释50或100 倍；然后取0.5 mL稀释过的松多酚粗提液样品，置于10 mL的比色管，根据绘制标准曲线的方法做同样的处理，同样以相应试剂为空白对照，在760 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线方程计算得到松多酚粗提物含量。

总多酚含量/（mg/g）＝回归质量浓度×稀释倍数×提取液体积/原料干质量 （1）

1.3.4 大孔树脂的筛选[11]

本研究选取的6 种大孔树脂的型号及物理结构参数如表1所示。

表 1 6 种大孔树脂物理结构参数

Table 1 Physical structure parameters of 6 kinds of macroporous resins

取一定量已预处理的6 种固相介质，进行烘干处理（60 ℃、8 h），然后准确称取0.5 g，放入锥形瓶，95%乙醇浸泡，24 h后水洗至中性，真空抽干以备用。随后，加入40 mL 2.173 mg/mL的松多酚粗提液；置于恒温振荡器，温度（30±2）℃、振速100 r/min、时间10 h，待充分吸附后过滤，测定滤液吸光度，然后计算松多酚在各树脂中的吸附量和吸附率。

将上述以吸附的6 种固相介质进行水洗，至水洗液无色；然后加入40mL 60%乙醇，置于恒温振荡器（温度（30±2） ℃、振速100 r/min、时间10 h），静置20 min，取洗脱液，测定吸光度，计算各树脂的解吸情况。计算公式如下：

Q1 =（C0－C1）×V1/m （2）

E1/%=（C0－C1）/C0×100 （3）

Q2 = C2×V2/W （4）

E2/% = ×100

C2×V2

（C0－C1）V1

（5）

式中：Q1为吸附量/（mg/g）；E1为吸附率/%；Q2为解吸量/g；E2为解吸率/%；m为树脂湿质量/g；C0为起始多酚质量浓度/（mg/mL）；C1为达到吸附平衡时溶液中多酚质量浓度/（mg/mL）；C2为解吸液中多酚质量浓度/（mg/mL）；
V1为吸附液体积/mL；V2为解吸液体积/mL。

1.3.5 乙醇洗脱体积分数的筛选

选取20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 7 个乙醇梯度，按上步的解吸实验操作，确定洗脱液的最佳体积分数。

1.3.6 甲酸体积分数对解吸的影响

为了进一步增强洗脱剂对固相介质的解吸效果，故探究不同体积分数甲酸对洗脱效果的影响。在已选定洗脱剂的条件下，分别选取含有0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%甲酸的洗脱剂，进行静态解吸实验，然后测定吸光度，计算各树脂的解吸情况。

1.3.7 单因素试验

二维多通道色谱分离松多酚的条件由上述单因素试验直接确定，实验顺序为上样量、上样质量浓度、洗脱速率和色谱柱数量，并且按照实验顺序确定的单因素条件作为下个因素的固定条件。

上样量：选取6 个水平，分别为80 mL×1.6 mg/mL、
120 mL×1.6 mg/mL、160 mL×1.6 mg/mL、200 mL×1.6 mg/mL、240 mL×1.6 mg/mL、280 mL×1.6 mg/mL。

上样质量浓度：在上样量确定的情况下，选取的上样质量浓度分别为1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL。

洗脱速率：在上两个因素确定的条件下，选取（100±20）、（200±20）、（300±20）、（400±200、（500±20）、（600±20）mL/min 6 个不同洗脱流速。

色谱柱数量：在上述条件确定的条件下，选取1 根柱联用、2 根柱联用、3 根柱联用、4 根柱联用、5 根柱联用5种不同柱数量的联用洗脱情况。

1.3.8 纯度计算

根据福林-酚试剂法测定所收集样品的多酚含量，并取一定体积的样品，置于平皿，放入烘箱烘干至质量恒定，称量干质量。公式如下：

（6）

2 结果与分析

2.1 总多酚标准曲线的建立

以溶液在760 nm波长处的吸光度为纵坐标、没食子酸质量浓度（μg/mL）为横坐标，建立总多酚标准曲线方程：y=0.019 9x－0.0075，R2=0.999 7。根据回归方程，得松多酚提取物中多酚含量为8.259 8 mg/g。

2.2 大孔树脂的筛选

由于大孔树脂的极性、孔径、比表面积、平均孔径等理化性质的不同，其分离目标物质的效果也不同[9]。大孔树脂分离天然活性成分利用的是其吸附的可逆性，在生产制备上，大孔树脂的选取不仅要求吸附量大，而且解吸效果也要较好[22]。因此，吸附性能和解吸性能是大孔树脂作为固相介质筛选的重要依据。表2显示，从吸附性看，不同型号的树脂对松多酚的吸附程度不同，与树脂的极性呈正相关，其中吸附量和吸附率较高的是极性树脂S-8、NAK-2、NAK-9和中等极性的ADS-17，而弱极性和非极性的较低；S-8的吸附性最好，吸附量和吸附率分别达到了75.19 mg/g和86.43%。产生这种情况的原因可能和多酚类物质属于中等极性化合物有一定的关系，同时又有一定的疏水性，因此根据相似相容原理，极性和中等极性的大孔树脂更易与多酚类物质吸附。从解吸性看，解吸效果较好的是X-5和D101，均达到了50%以上。综合吸附和解吸两个参数，S-8的吸附性能最佳，吸附量达到75.19 mg/g，而解吸量仅仅只有17.05 mg/g；而X-5吸附性能不佳，吸附率仅仅达到44.53%，但解吸较好，解吸率达到63.73%，解吸量为24.69 mg/g。因此，确定X-5大孔树脂作为二维多通道色谱法分离松多酚的固相介质。这一结果，与其他学者分离纯化多酚类活性成分所筛选树脂的极性基本一致，都为弱极性吸附树脂[22-24]。

表 2 6 种大孔树脂对松多酚的吸附与解吸

Fig.2 Adsorption and desorption capacities of 6 kinds of macroporous resins

2.3 X-5大孔树脂吸附性的考察

2.3.1 X-5大孔树脂对松多酚的动力吸附

图 3 X-5树脂对松多酚的动力吸附曲线

Fig.3 Dynamic adsorption curves of pine polyphenols on X-5 resin

大孔树脂吸附目标物质是一个由快速吸附到最终吸附饱和的动态过程，由于每种树脂的理化性质的不同和吸附物性质的差异，故大孔树脂吸附的动态过程差异较大，有的几十分钟即可达到平衡，但有些需要几个小时。由图3可以看出：在开始的一段时间内，X-5大孔树脂对松多酚吸附量在逐渐增大。随着时间的延长，吸附逐渐达到饱和。当吸附2 h左右时，X-5树脂对松多酚的吸附达到平衡，吸附量不再增加，趋于稳定，其吸附量为39 mg左右。因此该吸附平衡时间作为了二维多通道色谱分离设备分离松多酚吸附域的吸附时间的参考标准，为了保证吸附完全，选取3 h作为吸附域最终的吸附时间。

2.3.2 X-5树脂对松多酚的等温吸附

在等温吸附实验中，通常采用朗缪尔和费伦德利希吸附模型描述大孔树脂与吸附物之间的相互作用，揭示其吸附过程[12-13,25]。朗缪尔吸附模型公式[25]如式（7）所示：

（7）

式中：Qe为树脂吸附能力；Ce为松多酚平衡浓度；Qm为经验常数；K为朗缪尔常数。

费伦德利希吸附模型[25]公式如式（8）所示：

（8）

式中：Qe为树脂吸附能力；Ce为松多酚平衡浓度；k为费伦德利希常数；1/n为经验常数。

X-5吸附松多酚的等温吸附曲线如图4所示，同时根据上述公式得两吸附模型参数如表3、4所示，综合比较两吸附模型的相关系数，X-5大孔树脂对松多酚的吸附过程更趋于朗缪尔单分子吸附模型，在不同温度下其吸附模型的线性拟合R2＞0.99。在费伦德利希模型，1/n的值是判断其吸附模型是否易于发生的依据[25]；在0～0.5之间说明费伦德利希模型易于发生，反之大于0.5，则不易发生。在表4中1/n的值均大于0.5，故X-5大孔树脂对松多酚的吸附过程不符合费伦德利希模型。

图 4 X-5树脂对松多酚的等温吸附曲线

Fig.4 Absorption isotherms of pine polyphenol on X-5 resin

同时如图4可知，在25、35 ℃和45 ℃三个梯度温度，X-5大孔树脂对松多酚的吸附能力随着温度的升高而降低，25 ℃时X-5树脂对松多酚的吸附最佳。同时，在这3 个温度梯度下，X-5大孔树脂对松多酚的吸附，随着松多酚质量浓度的增加而不断的增强，当松多酚质量浓度达到2.0 mg/mL左右时，其吸附达到饱和。随后继续增加质量浓度，X-5大孔树脂对松多酚的吸附量不再增加，甚至略有下降。这可能是因为刚开始松多酚浓度的提高，使目标吸附物质的量也随之提高，增加了松多酚与大孔树脂的相互作用；当达到吸附平衡时，继续增加松多酚的质量浓度，树脂表面接触的松多酚分子过多，延缓了多酚分子进入大孔树脂的内部空间结构，同时质量浓度的增加也增大了竞争多酚吸附杂质的量，从而松多酚的吸附量略有下降。这与其他学者研究多酚质量浓度对吸附影响的结果是一致的[24,26-27]。X-5大孔树脂对松多酚的吸附过程符合朗缪尔单分子层吸附模型，在25 ℃条件下（即室温）对松多酚的吸附较佳，松多酚质量浓度在2.0 mg/mL左右较佳。

表 3 不同温度条件下X-5大孔树脂对松多酚的朗缪尔吸附模型参数

Table 3 Langmuir parameters of pine polyphenol on X-5 resin at different temperatures

表 4 不同温度条件下X-5大孔树脂对松多酚的费伦德利希吸附模型参数

Table 4 Freundlich parameters of pine polyphenol on X-5 resin at different temperatures

2.4 X-5大孔树脂解吸性的考察

2.4.1 乙醇体积分数对解吸的影响

通常洗脱剂的极性决定着大孔树脂的解吸效果[9,28]，将吸附松多酚饱和的X-5大孔树脂等分成份，分别用不同体积分数的乙醇溶液作为解吸剂，测定解吸液中松多酚含量，计算解吸率，结果如图5所示。60%乙醇的解吸最高，达到63.73%，且较快达到解吸平衡。因此，选择60%的乙醇作为进一步研究的洗脱剂。

图 5 乙醇体积分数对解吸的影响

Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption capacity

2.4.2 不同甲酸体积分数洗脱液对解吸的影响

从一些研究中发现，大孔树脂在弱酸性的条件下有利于多酚类活性成分的洗脱[29-30]。因此，利用不同体积分数的甲酸对洗脱液进行酸化，从而洗脱液酸化程度对X-5大孔树脂的解吸影响，结果如图6所示。不同酸化程度的洗脱液对X-5大孔树脂的解吸有一定的作用；适当的加入少许的甲酸能够提高洗脱剂的解吸能力，在甲酸的体积分数达到0.5%时，洗脱剂的解吸能力最强，解吸率达到72.08%；随后随着甲酸浓度的增加，洗脱剂的解吸能力逐渐减弱。这可能是因为多酚在中性条件下易离解，离解物与树脂的结合力可能比非离解物大，经弱酸化的洗脱液可以抑制多酚的离解，可能会改善洗脱效果；随后酸化的程度不断增加，有可能导致松多酚结构的改变，与树脂的结合力增加，从而降低了洗脱剂的解吸能力。

图 6 不同甲酸体积分数洗脱液对解吸的影响

Fig.6 Effect of formic acid concentration of the eluent on desorption capacity

2.5 二维多通道色谱分离设备线上条件优化

2.5.1 上样量对分离松多酚的影响

图 7 上样量对二维多通道色谱分离设备分离松多酚的影响

Fig.7 Effect of sample loading amount for pine polyphenol purity

从图7可以看出，上样量对二维多通道色谱分离设备分离松多酚的影响较大。从二维多通道色谱分离设备的单一域来看，在不同上样量的条件下，吸附域分离纯化松多酚较为稳定，分离获得的松多酚纯度基本在4%～6%之间，没有太大波动，说明上样量对二维多通道色谱分离设备吸附域的分离影响较小；但对二维多通道色谱分离设备的分离域影响较大，各分离域分离获得的松多酚纯度高低不一，波动较大。从分离效果的整体来看，二维多通道色谱分离设备分离效果明显，在上样量为160 mL×1.6 mg/mL时，分离域-1分离的松多酚效果最好，纯度达19.907%。故选取160 mL×1.6 mg/mL的上样量作为上样条件。

2.5.2 上样质量浓度对分离松多酚的影响

从图8可以看出，松多酚的上样质量浓度对二维多通道色谱分离设备分离松多酚产生了显著的影响。同样的，从单一域可以看出，吸附域的分离效果波动较小，但分离纯化的效果不佳；分离域的分离效果显著，波动大。随着上样浓度的改变，二维多通道色谱分离设备分离松多酚的效果峰值也发生了改变，由1.6 mg/mL的分离域-1转变为了2.0 mg/mL的分离域-2，其分离获得的松多酚纯度达到了23.257%。因此，二维多通道色谱分离设备分离松多酚的上样质量浓度选取2.0 mg/mL。

图 8 上样质量浓度对二维多通道色谱分离设备分离松多酚的影响

Fig.8 Effect of sample concentration on pine polyphenol purity

2.5.3 洗脱速率对分离松多酚的影响

洗脱速率对二维多通道色谱分离设备分离松多酚的影响如图9所示。可知，洗脱速率对分离松多酚的影响显著。从整体分离效果看，在较低的洗脱速率的条件下，二维多通道色谱分离设备分离松多酚的效果比在较高洗脱速率条件下，分离效果好。二维多通道色谱分离设备的各个色谱域，在流速为（200±20）mL/min时，分离效果都达到峰值；其中分离效果最好的是分离域-2，分离获得的松多酚纯度达到23.257%。

图 9 洗脱流速对二维多通道色谱分离设备分离松多酚的影响

Fig.9 Effect of eluent flow rate on pine polyphenol purity

2.5.4 色谱柱数量对分离松多酚的影响

图 10 色谱柱数量对二维多通道色谱分离设备分离松多酚的影响

Fig.10 Effect of number of chromatographic columns used on pine polyphenol purity

从图10可以看出，不同数量的色谱柱联用对二维多通道色谱分离设备分离松多酚有着显著的作用。整体看，多柱联用的二维多通道色谱分离设备的分离效果要优于单柱联用。二维多通道色谱分离设备分离松多酚并不是色谱柱联用的数量越多越好，在4 根色谱柱联用时，二维多通道色谱分离设备分离松多酚的效果即达峰值。与其他数量色谱柱联用相比，4 柱联用的效果，无论是整体分离效果还是单柱分离都优于其他数量色谱柱联用的效果。从而，确定二维多通道色谱分离设备分离松多酚的色谱柱联用数量为4 根柱联用。

按上述优化的分离纯化条件，使松多酚的纯度由2.37%提高到了23.257%，纯化倍数高达9.8。说明分离条件优化后的二维多通道色谱分离设备对松多酚有着很好的分离纯化作用。

3 结 论

本研究通过静态吸附解吸和单因素动态试验，确定了二维多通道色谱法分离松多酚的最佳工艺，条件：X-5树脂为固相介质、0.5%甲酸-60%乙醇溶液为洗脱剂、上样量256 mg、上样质量浓度2.0 mg/mL、洗脱速率（200±20）mL/min和色谱柱4柱联用。在此条件下，松多酚纯度高达23.257%，较原松多酚提取液（2.37%）提高了9.8 倍，同时产率达到46.81%。因此，二维多通道色谱分离设备对松多酚的分离纯化具有较好的效果；同时，较其他松多酚分离纯化技术，二维多通道色谱分离设备具有操作自动化、洗脱液消耗少、生产周期短、处理量大等优势，对于松多酚工业化、大批量生产具有一定的参考价值和意义。

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