桦褐孔菌多糖脱色方法及其成分分析

玄光善，李 青，王艳波

（青岛科技大学，山东 青岛 266042）

摘 要：对桦褐孔菌多糖的脱色方法和单糖的组成进行研究。首先考察活性炭粉、过氧化氢、壳聚糖、聚酰胺层析柱的脱色效果。经脱蛋白、脱色后的多糖进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，采用高效液相色谱法分析单糖组成。4种脱色方法对桦褐孔菌多糖均有效果，活性炭和聚酰胺层析柱脱色效果明显优于过氧化氢和壳聚糖脱色法，聚酰胺层析柱脱色是较好的方法，其脱色率为89.3%、多糖保留率为91.7%。结果表明：桦褐孔菌多糖粗品主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其物质的量比为2.13∶1.36∶7.01∶2.98∶1∶1.78。

关键词：桦褐孔菌；多糖；脱色；柱前衍生化；成分分析

Decolorization and Monosaccharide Composition Analysis of Polysaccharides from Inonotus obliguus

XUAN Guang-shan, LI Qing, WANG Yan-bo

(Qingdao University of Science & Technology, Qingdao 266042, China)

Abstract: In the present work, activated carbon powder, H2O2, chitosan, and polyamide column chromatography were compared for their effects in decolorizing Inonotus obliguus polysaccharides, and the decolorized polysaccharides were analyzed for monosaccharide composition by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization with 1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone. All decolorants were able to decolorize Inonotus obliguus polysaccharides, with activated carbon powder and polyamide column chromatography being more significantly effective than the other decolorants. The decolorization efficiency of polyamide column chromatography was 89.3% while retaining 91.7% of polysaccharides. The decolorized polysaccharides were mainly composed of mannose, rhamnose, glucose, galactose, xylose, and arabinose with a molar ratio of 2.13:1.36:7.01:2.98:1:1.78.

Key words: Inonotus obliguus; polysaccharides; decolorization; precolumn derivatization; component analysis

中图分类号：R931.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）10-0207-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410039

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）属桦褐孔菌属于担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科，是一种传统的药用真菌[1]。主产于俄罗斯、北欧、波兰、日本北海道以及中国黑龙江大小兴安岭和吉林长白山地区[2]。其具有抗肿瘤[3]、降血糖[4]、调节免疫功能[5]、抗氧化[6]、抗血脂[7]、抗哮喘[8]等作用。

桦褐孔菌中含有多糖、三萜类、桦褐孔菌醇、栓菌酸、桦褐孔菌素、木质素、黑色素等200多种化合物[9]。桦褐孔菌多糖提取液中混有的色素对其外观品质有一定的影响，并且影响多糖的分离纯化、定性定量分析与结构鉴定，因此在提取、分析前需要去除色素[10]。传统的脱色方法有活性炭法，过氧化氢氧化法等，但这些方法均存在缺陷：活性炭脱色时间长、多糖损失量大，且多糖提取液中混杂的活性炭难以去除；过氧化氢脱色有可能破坏多糖的生物活性。因此，亟需寻找一种有效的脱色方法。郭巧玲等[11]研究了壳聚糖对菠萝粗多糖脱色的影响，脱色率能达到74.3%。陈义勇等[12]采用聚酰胺层析柱对茶多糖进行脱色纯化研究，脱色率能达到82.3%。但桦褐孔菌多糖脱色的研究则较少。本研究选用活性炭、过氧化氢、壳聚糖和聚酰胺层析柱4种脱色方法，对桦褐孔菌多糖进行脱色，并测定多糖保留率和脱色率，评价脱色效果并筛选桦褐孔菌多糖的最佳脱色方法。

常用的单糖组成分析方法有气相色谱法和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[13]。
范柳萍等[14]采用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法定量桦褐孔菌多糖糖基组成。张丽霞[15]采用糖醇甲基醚衍生物气相色谱法分析了桦褐孔菌多糖中单糖组成。马定远等[16]建立了单糖组成分析的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化-HPLC新方法，该法简便、快速、准确、重复性好。本实验亦采用PMP柱前衍生化HPLC法对桦褐孔菌多糖的单糖组成进行分析，为其结构和功能的进一步研究及开发提供了基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桦褐孔菌采自大兴安岭；粉末活性炭（分析纯） 天津市标准科技有限公司；30%过氧化氢（分析纯） 天津市博迪化工有限公司；壳聚糖（脱乙酰度80.0%～95.0%）、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；聚酰胺（80～100目） 上海一基生物试剂有限公司；PMP实验室自制[17]；乙腈（色谱纯） 天津市永大化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV762型紫外-可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司；U3000高效液相色谱仪 戴安（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桦褐孔菌多糖的提取

桦褐孔菌粉碎过40 目筛，称取100 g菌粉，用40倍水于90 ℃条件下提取2.5 h，抽滤得滤液，减压浓缩，加4倍体积的95%乙醇，4 ℃静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤3 次，真空干燥得多糖粗品。取桦褐孔菌粗多糖10 g，加1 L蒸馏水溶解，用三氯乙酸-正丁醇法去除游离蛋白：将等体积的三氯乙酸-正丁醇溶液（1∶10，V/V）
加入多糖溶液中，磁力搅拌30 min，在分液漏斗中静置3 h，取下清液，于4 ℃冰箱中保存，备用。

1.3.2 多糖保留率的测定

1.3.2.1 标准曲线的建立

本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

精确称取105 ℃干燥至恒质量的葡萄糖标准品50.0 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.0 mg/mL葡萄糖标准液。吸取1.0 mg/mL的葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于10 mL容量瓶中，定容。再分别量取2.0 mL置干燥具塞试管中，加6%苯酚1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，置沸水浴加热30 min后取出，冷水冷却至室温；另取蒸馏水2.0 mL，同上操作，做空白对照，于486 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，作标准曲线，得标准曲线回归方程。

1.3.2.2 换算因子的测定

准确称取已干燥至恒质量的桦褐孔菌多糖10 mg，定容于100 mL容量瓶中，备用。精密量取该溶液2.0 mL，按照上述苯酚-硫酸法测定吸光度，重复3 次，计算出桦褐孔菌多糖中葡萄糖的质量浓度，按式（1）计算换算因子[18]：

F=A/B （1）

式（1）中：A为所配液体中多糖质量浓度/（mg/mL）；B为标准曲线计算所得葡萄糖质量浓度/（mg/mL）。

1.3.2.3 苯酚-硫酸法测定多糖含量

按上述苯酚-硫酸法，分别测定桦褐孔菌多糖原液及不同脱色方法脱色后溶液的吸光度。通过标准曲线和
式（2）计算样品中多糖含量、式（3）计算多糖保留率[19]：

（2）

式（2）中：C为糖的质量浓度/（mg/mL）；V为体积/mL；D为稀释倍数；W为样品糖的质量/mg。

（3）

式（3）中：C1为脱色前得多糖含量/%；C2为脱色后的多糖含量/%。

1.3.3 多糖脱色

采用活性炭粉、过氧化氢、壳聚糖和聚酰胺对桦褐孔菌多糖进行脱色。利用分光光度计在359 nm波长处测定多糖溶液脱色前后的吸光度[20]，并按式（4）计算脱色率，比较各种方法的脱色效果。

（4）

式（4）中：A1为脱色前的吸光度；A2为脱色后的吸光度。

1.3.3.1 活性炭粉末脱色

分别取脱蛋白溶液20 mL，加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 g活性炭粉，摇匀后于40℃水浴静置5 h，抽滤，滤液定容至100 mL容量瓶中，测脱色率和多糖保留率。

1.3.3.2 过氧化氢脱色

分别取脱蛋白溶液20 mL，加入30%过氧化氢4、8、12、16、20 mL，55℃恒温水浴搅拌3 h，调节pH值至8.8～9之间，最终定容至100 mL，测脱色率和多糖保留率。

1.3.3.3 壳聚糖脱色

1%壳聚糖的配制：精确称取壳聚糖1 g，溶于50 mL水中，再加入1 mL冰乙酸，放入80～90℃的恒温水浴锅中，搅拌至溶解，再用蒸馏水定容至100 mL，于85 ℃保温45 min即可使用[21]。

取脱蛋白溶液20 mL 6 份，加入适量1%壳聚糖溶液，使其体积分数分别为5%、6%、7%、8%、9%、10%，用0.2 mol/L NaOH溶液调pH值至5，于45℃恒温水浴锅中搅拌20 min，静置保温40 min，离心，测脱色率和多糖保留率。

1.3.3.4 聚酰胺层析柱脱色

聚酰胺预处理：取适量聚酰胺用90%～95%乙醇浸泡，不断搅拌，去除气泡后装入柱中。用3～4 倍柱体积的90%～95%乙醇洗脱，至洗脱液透明并在蒸干后无残渣。再依次用2～2.5 倍柱体积的5% NaOH溶液、1 倍柱体积的蒸馏水、2～2.5倍柱体积的10%醋酸溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至中性，备用[22]。

称取2、4、6、8、10 g聚酰胺，倒入一定量的蒸馏水中加热15 min，使之分散均匀，装层析柱，用蒸馏水洗脱完全。分别量取20 mL脱蛋白溶液，装入聚酰胺层析柱中进行吸附，用1倍柱体积的蒸馏水以1.0 mL/min的流速进行洗脱，测脱色率和多糖保留率。

1.3.4 单糖组成分析

1.3.4.1 单糖标样的衍生化

由文献[20]知，桦褐孔菌粗多糖主要由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和木糖组成。精密称取对照品甘露糖0.018 4 g、鼠李糖0.013 7 g、葡萄糖0.019 7 g、半乳糖0.017 3 g、木糖0.014 2 g、阿拉伯糖0.0109 g，用蒸馏水溶解定容于10 mL容量瓶中，摇匀。取单糖对照品混合溶液400 μL与250 μL 0.3 mol/L
NaOH溶液混匀，再加250 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液，涡旋混匀；70℃烘箱中反应100 min，冷却，加500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，涡旋2 min后，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿层，重复萃取3 次。水相用0.45 μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

1.3.4.2 多糖的水解及衍生化

吸取1 mL质量浓度为4～5 g/L的多糖样品溶液于安瓿瓶中，加入1 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液，充N2封管，110℃烘箱中水解3 h；冷却后打开盖，取600 μL水解液加600 μL甲醇后用N2吹干，如此重复加甲醇并用N2吹3次，去除三氟乙酸；加入蒸馏水400 μL充分溶解残渣，加入250 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混匀，再加250 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中反应100 min，冷却后按上述方法中和、萃取，并用微孔膜过滤。

1.3.4.3 色谱条件

色谱柱：GlobalsilTM C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；流动相：溶剂A为50 mmol/L
磷酸缓冲液（KH2PO4-NaOH，pH 6.9），溶剂B为乙腈；梯度洗脱：0～12min，15% B；12～20min，15%～20% B；20～35min，20% B；35～45min，20%～15% B；45～50min，15% B。检测波长250 nm；进样体积20 μL。

1.3.4.4 标准曲线绘制及单糖组成分析

分别称取葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和木糖对照品配制成一系列不同质量浓度的标准溶液，按上述方法进行衍生化，并在上述色谱条件下进样分析，记录峰面积，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，作标准曲线。

2 结果与分析

2.1 多糖保留率

2.1.1 葡萄糖含量测定标准曲线

按上述方法配制一系列质量浓度的葡萄糖标准液，用苯酚-硫酸法显色，在486 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，计算得到标准曲线回归方程：y=0.05871x＋
0.00137，R2=0.999 0，线性关系良好，线性范围为0.01～0.12 mg/mL。

2.1.2 换算因子

准确称取已干燥至恒质量的桦褐孔菌多糖10 mg，定容于100 mL容量瓶中。精密量取0.1 mg/mL桦褐孔菌多糖溶液2.0 mL，按照上述苯酚-硫酸法测定吸光度，重复3次测得的换算因子F=1.17。

2.2 不同脱色剂的脱色效果

图 1 不同脱色剂对桦褐孔菌多糖的脱色效果

Fig.1 Effects of different decolorants on decolorization of
Inonotus obliquus polysaccharides

由图1A可知，随着活性炭用量的增加，多糖脱色率增加，而多糖保留率逐渐降低。而当活性炭含量大于0.06 g/mL
时，多糖脱色率无明显增加，脱色率达到85.7%。因此，利用活性炭对桦褐孔菌多糖进行脱色的条件为活性炭用量0.06 g/mL、脱色温度40 ℃、脱色时间5 h。

由图1B可知，过氧化氢对桦褐孔菌多糖的脱色效果明显，但多糖保留率较低。当过氧化氢含量大于
0.4 mL/mL时，脱色效果无明显提高，脱色率达到82.8%，而多糖保留率明显降低。因此过氧化氢对桦褐孔菌多糖进行脱色条件选为加入过氧化氢含量
0.4 mL/mL、脱色温度50 ℃、脱色时间3 h、pH 8.8～9。

由图1C可知，壳聚糖对桦褐孔菌多糖的脱色效果不明显，多糖脱色率随壳聚糖用量增大而增大，当1%壳聚糖添加量大于7%时，脱色率达到48.3%，脱色率增大幅度变小，而多糖保留率明显下降。因此，壳聚糖对桦褐孔菌多糖进行脱色条件选为1%壳聚糖加入量7%、脱色温度45 ℃、脱色时间1 h、pH 5。

从图1D可知，随着聚酰胺用量的增加，脱色率逐渐增大，多糖的保留率逐渐下降。当聚酰胺用量超过8 g/20 mL脱蛋白溶液时，多糖脱色率变化幅度不大，脱色率达到89.3%，但多糖的保留率明显下降。为了尽可能多地保留多糖、节省实验成本，确定聚酰胺对桦褐孔菌多糖进行脱色条件选为聚酰胺用量为8 g/20 mL脱蛋白溶液，采用1.5 倍柱体积的去离子水以1.0 mL/min的流速进行洗脱。

从脱色率及多糖保留率两方面进行考察，4种方法对桦褐孔菌多糖均有脱色效果。壳聚糖是较新的脱色方法，虽然多糖保留率较高，但是多糖颜色还是很深、脱色率低。过氧化氢脱色效果良，但易对多糖造成破坏，并且色素物质只是被氧化为无色，仍存在于多糖中，并不是真正意义上的去除。聚酰胺层析柱和活性炭的脱色效果优，但活性炭法的多糖损失严重，并且残留在多糖溶液中的活性炭难以完全去除，所以聚酰胺层析柱脱色是较好的方法。

2.3 单糖组成分析

2.3.1 单糖标样的衍生化分析

分别称取葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和木糖对照品配制成一系列不同质量浓度的标准溶液，按上述方法进行衍生化，并在上述色谱条件下进样分析，记录峰面积，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，作标准曲线，结果见表1。根据测得各种糖的峰面积得到对应的质量浓度，各单糖的质量浓度比即为物质的量比。

表 1 单糖的标准曲线

Table 1 Calibration curves for different monosaccbrides

6种单糖对照品按上述方法衍生化，并在上述色谱条件下进样检测，结果见图2，这些单糖组分得到了良好地分离。

1.衍生化试剂PMP；2.甘露糖；3.鼠李糖；
4.葡萄糖；5.半乳糖；6.木糖；7.阿拉伯糖。下同。

图 2 标准单糖PMP衍生物的HPLC图

Fig.2 HPLC chromatogram of the PMP derivatives of
monosaccharide standards

2.3.2 桦褐孔菌多糖的PMP衍生化分析

桦褐孔菌多糖按上述方法衍生化后，进行HPLC分析，结果见图3。

8.未知峰。

图 3 桦褐孔菌多糖水解样品PMP衍生物的HPLC图

Fig.3 HPLC chromatogram of the PMP derivatives of hydrolyzed Inonotus obliguus polysaccharides

根据混合单糖标样PMP衍生物的色谱图（图2）中色谱峰保留时间，来判断多糖水解产物中单糖的种类。由图3可知，桦褐孔菌多糖水解产物衍生物色谱图出现8 个峰。在桦褐孔菌多糖的PMP衍生化色谱图中在40.1 min处出现了未知的峰，经HPLC-MS分析未知物的m/z为164，具体结构有待进一步确认。

由峰面积及各单糖标准曲线回归方程计算得各单糖质量浓度，各单糖物质的量比（甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖）为2.13∶1.36∶7.01∶2.98∶1∶1.78。

3 结 论

癌症是危害人类健康的最主要的疾病之一，而桦褐孔菌含有大量抗癌、降血压、降血糖、复活免疫作用的植物纤维类多糖，因此桦褐孔菌的分离、纯化以及药效学研究很有意义[23-25]。

本研究比较了活性炭粉、过氧化氢、壳聚糖、聚酰胺层析柱对桦褐孔菌多糖脱色效果。聚酰胺层析柱是较好的方法，聚酰胺用量为粗多糖的8倍、采用1.5倍柱体积的去离子水以1.0 mL/min的流速进行洗脱时，聚酰胺层析柱的脱色率为89.3%、多糖保留率为91.7%。

本研究采用PMP柱前衍生化HPLC法分析桦褐孔菌多糖的单糖组成。结果显示，桦褐孔菌多糖主要含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖6种单糖。各单糖物质的量比为（甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖）为2.13∶1.36∶7.01∶2.98∶1∶1.78。

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