壳聚糖-乳清分离蛋白复合膜对鲜切雷竹笋
木质化和品质的影响

舒 静1，陈季旺1,2,*，周 琦1，陈 悦1，庞彦卿3，宋光森4

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.农产品加工湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430023；3.湖北瑞发生物工程股份有限公司，湖北 崇阳 437500；4.武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北 武汉 430023）

摘 要：采用壳聚糖-乳清分离蛋白复合膜（chitosan-whey protein isolate composite film，CWF）涂膜1、2、3 次及去离子水、乙酸处理鲜切雷竹笋，于4 ℃冷藏15 d，以贮藏过程雷竹笋的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）活力、丙二醛（MDA）、多酚、木质素含量、菌落总数等为指标，研究CWF对鲜切雷竹笋木质化和品质劣变以及涂膜次数对保鲜效果的影响。结果显示，乙酸对鲜切雷竹笋的木质化和微生物有一定的抑制作用，但影响不显著；CWF涂膜可以显著降低鲜切雷竹笋表面的微生物数量，抑制PAL和POD活力，降低木质素、MDA含量，延长鲜切雷竹笋的货架期。随着CWF涂膜次数的增加，保鲜效果更好，考虑到生产成本选择涂膜2 次。

关键词：鲜切雷竹笋；壳聚糖-乳清分离蛋白复合膜；涂膜保鲜；木质化

Effect of Chitosan-Whey Protein Isolate Composite Film on Quality and Lignification of Fresh-Cut Bamboo Shoot

SHU Jing1, CHEN Ji-wang1,2,*, ZHOU Qi1, CHEN Yue1, PANG Yan-qing3, SONG Guang-sen4

(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China;

2. Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China;

3. Hubei Ruifa Bioengineering Co. Ltd., Chongyang 437500, China;

4. College of Chemical and Environmental Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract: Fresh-cut bamboo shoots soaked in chitosan-whey protein isolate composite film (CWF) solution (1, 2 and 3 times), deionized water, and acetic acid solution, respectively were stored at 4 ℃ for 15 days. The effect of CWF on lignification and quality of fresh-cut bamboo shoots during cold storage was evaluated according to the activity of phenylalanine ammonialyase (PAL) and peroxidase (POD), the contents of polyphenol, malondialdehyde and lignin, and total number of colonies. The results showed that acetic acid had a slight but not significant inhibitory effect on lignification and microorganisms of bamboo shoots. CWF coating could significantly decrease the total number of colonies and the contents of malondialdehyde (MDA) and lignin, inhibit PAL and POD activities, and extend the shelf-life of fresh-cut bamboo shoots. Moreover, the shelf-life of fresh-cut bamboo shoots was further extended with increasing number of coating cycles. Nevertheless, the coating process was repeated twice from a cost viewpoint.

Key words: fresh-cut bamboo shoot; chitosan-whey protein isolate composite film; coating; lignification

中图分类号：TS255.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）10-0284-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201410053

雷竹笋（Phyllostachys prevelnalis）是一种高蛋白、低脂肪、低糖分、多纤维的蔬菜，味道鲜美，深受人们的喜爱。雷竹笋是近几年发展起来的优良笋种，具有减肥、防癌、降血脂和抗衰老等多种保健功能[1]，被广大消费者所喜爱。

长期以来，大部分雷竹笋均以带壳的形式在各地蔬菜市场销售。随着生活节奏的不断加快，以及消费水平的日益提高，去壳清洗的鲜切雷竹笋已进入我国大中城市的超市以净菜的形式销售。鲜切雷竹笋不仅清洁卫生，而且新鲜方便。但在鲜切雷竹笋的加工过程中，由切割造成的机械损伤会诱导一系列的生理生化变化，导致其品质迅速下降[2-3]。周琦等[4]研究表明苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、过氧化物酶（peroxidase，POD）活力在冷藏期内大幅度增加，是导致鲜切雷竹笋木质化的关键酶；酚类物质作为木质素合成的前体物质，参与木质素的合成；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量可能参与鲜切雷竹笋的木质化进程。Luo Zisheng等[5]研究表明新鲜雷竹笋由于去皮等损伤会导致雷竹笋从切口处组织开始，硬度和韧度增大，从而加剧雷竹笋木质化的进程。目前，有关雷竹笋在鲜切加工后如何延长货架期的报道较少，因此，研究鲜切雷竹笋的保鲜技术，对促进雷竹笋资源的开发利用，丰富人们的“菜篮子”具有重要的意义。

涂膜处理是一种比较常用的一种保鲜技术。壳聚糖作为目前研究比较成熟的一种生物保鲜剂，无味、无毒、无害，具有良好的成膜性。壳聚糖的主要作用是将食品表面与空气隔离，抑制生物的生理生化变化。同时，壳聚糖具有良好的抑菌性，对腐败菌、致病菌均有一定抑制作用[6-7]。乳清蛋白具有优良的氧气、芳香物质和油脂的阻隔性，能够有效阻隔外界对食品的促老化作用，且成膜能力和营养特性良好，可以作为营养强化剂、抗氧化剂、抗微生物制剂[8]。Ferreira等[9]研究了低pH值条件下壳聚糖-乳清分离蛋白复合膜（chitosan-whey protein isolate composite film，CWF）物理和机械特性；di Pierro等[10]用CWF保鲜意大利干酪，抑制了微生物的生长数量，延长了产品的货架期，涂膜可以有效地降低干酪酸度，保护其结构。但有关CWF对鲜切雷竹笋木质化和品质的影响还未见报道。

本实验以CWF溶液涂膜鲜切雷竹笋，探讨其对鲜切雷竹笋木质化和品质的影响，以及涂膜次数对保鲜效果的影响，力求找出一种环保、低廉、安全可靠的鲜切雷竹笋保鲜方法，为雷竹笋的保鲜提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

雷竹笋由湖北瑞发生物工程有限公司提供。在实验基地挑选长度为20～30 cm、底部直径为4～5 cm、无病虫害和机械损伤的雷竹笋。采后马上将雷竹笋清洗、剥壳，各切除头部和尾部约5 cm长，将处理好的雷竹笋放入4 ℃冰箱中备用。

1.2 试剂与仪器

壳聚糖（脱乙酰度90%、相对分子质量3×105） 青岛海汇生物工程有限公司；乳清分离蛋白 美国Hilmar公司；L-苯丙氨酸、邻苯二酚（均为生化试剂），2-硫代巴比妥酸、聚乙烯吡咯烷酮（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；LRH-150-S恒温恒湿箱 广东医疗器械厂；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；NH-S电热恒温水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 涂膜液的制备

参考杨远谊[11]的方法，并加以改进。分别用1%的乙酸制备壳聚糖质量浓度为2 g/100 mL、乳清蛋白质量浓度为1 g/100 mL的成膜液，1∶1等体积混合后，用1 mol/L HCl、NaOH溶液调节成膜液的pH值为3，加入甘油使其体积分数为1.5%，水浴30 min，并不断搅拌，超声波脱气后，备用。

1.3.2 处理方法与分组

在室温条件下，迅速将鲜切雷竹笋分成5 组，前3 组分别涂膜处理1、2、3 次，记作CWa、CWb、CWc。将涂膜组的雷竹笋浸入涂膜液中2 min，笋身用细毛刷进行刷涂式涂膜，涂膜后的雷竹笋自然阴干后，放入恒温恒湿箱，需要再次涂膜的要等上次涂膜阴干后再进行。后2 组分别用清水和1%乙酸浸泡2 min后放入恒温恒湿箱中，分别记作处理CONTROLa、CONTROLb。

将处理好的鲜切雷竹笋在4 ℃、相对湿度90%的条件下贮藏15 d，每2 d测一次样，测量指标包括POD、PAL活力、MDA含量、总酚含量、木质素含量以及菌落总数。

1.3.3 PAL活力测定

参考曹建康等[12]的方法并加以改进。称取5 g雷竹笋，置于研钵中，加入5 mL提取缓冲液（含4%聚乙烯吡咯烷酮、5 mmol/L β-巯基乙醇，2 mmol/L EDTA），在冰浴条件下研磨成匀浆，4层纱布过滤后，滤液于4 ℃条件下，12 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶提取液。取一支离心管加入3 mL pH 8.8的硼酸缓冲液，0.5 mL 20 mmol/L苯丙氨酸溶液，在37 ℃条件下预热10 min后，加入0.2 mL酶液，混匀后，立即在290 nm波长处测定吸光度，后立即放入37 ℃水浴锅中恒温1 h，再测1 次吸光度。以蒸馏水作空白，以每克雷竹笋（鲜质量）每分钟吸光度变化值增加1 时为1 个PAL活性单位。

1.3.4 POD活力测定

参考曹建康等[12]的方法并加以改进。称取5 g雷竹笋置于研钵中，加入5 mL提取缓冲液（含4% PVP、1 mmol/L PEG，1% Triton X-100），在冰浴条件下研磨成匀浆，4 层纱布过滤后，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶提取液。配制反应体系，包括：3 mL 25 mmol/L愈创木酚，0.2 mL 0.5 mol/L H2O2，以蒸馏水为参比，最后加入0.2 mL稀释100 倍酶溶液迅速启动混合反应，同时开始计时，在反应的15 s开始记录反应体系在470 nm波长处吸光度，作为初始值，每隔1 min记录一次，连续测定至少6 组数据。以每克雷竹笋（鲜质量）每分钟吸光度变化值增加1时为1个POD活性。

1.3.5 MDA、多酚、木质素含量测定

参考李合生[13]的方法并加以改进。称取雷竹笋4 g，加入15 mL 100 g/L三氯乙酸和少量石英砂至研钵内，研磨匀浆后，4 层纱布过滤后，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，收集上清液，吸取上清液2 mL （对照加2 mL 100 g/L三氯乙酸溶液代替提取液），加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸溶液，将混匀物于沸水浴上反应20 min，迅速冷却后再离心，收集上清液，测定450、532 nm和600 nm波长处的吸光度，计算MDA含量。

参考Pirie等[14]的方法加以改进。称取5 g雷竹笋，加入25 mL 1% HCl-甲醇在冰浴条件下研磨至匀浆后，转入25 mL的刻度试管中。用1% HCl-甲醇溶液冲洗研钵，一并转入试管中，摇匀，于4 ℃条件下提取4 h，期间摇动数次。过滤，收集滤液备用。以1% HCl-甲醇溶液作为空白参比，测定280 nm波长处OD值。用没食子酸作标准曲线计算多酚含量。

参考Saura-Calixto等[15]的方法并加以改进。将雷竹笋样分别取样、烘干，混合磨粉，过60 目筛。精确称取0.5 g过筛后的样品移入100 mL烧杯中，加入质量分数72%的浓硫酸25 mL，充分搅拌后。于室温条件下放置2 h，之后转移到1 000 mL烧杯中，用蒸馏水洗涤，洗涤液一并转入1 000 mL烧杯，使最终体积达到575 mL。将该稀酸液煮沸4 h并维持恒定的体积。冷却后，用已恒质量的砂芯坩埚抽吸过滤，用热水洗至无残留酸为止，于105 ℃干燥至质量恒定后称量。

1.3.6 菌落总数的测定

细菌总数检测方法见GB/T 4789.2—2010《食品卫生微生物学检验：菌落总数》测定。称取25 g雷竹笋装入无菌均质袋，加入生理盐水225 mL，以30 r/min 均质2 min，摇匀，制成1∶10的样品匀液，依次稀释。选择2～3 个适宜稀释度的样品液，吸取1 mL的样品液放入无菌平皿内，每个稀释度做3 个平皿（吸取l mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照），倒入20～25 mL培养基转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，细菌平板放置于（37±1） ℃培养（48±2）h。肉眼观察或借用放大镜，记录稀释倍数和相应的菌落数量。

1.4 数据处理

实验按完全随机抽样设计，结果为不同处理分别取样，测定3 次数据的“平均值±标准偏差”，用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 涂膜处理对PAL活力的影响

PAL活性是形成酚类化合物中的一个重要调节酶，为木质素合成提供前体物质，植物体内的PAL活性与木质素的生成密切相关[15]。李正国等[16]研究表明：在逆境环境中，苯丙烷类代谢被激活，促使PAL活力上升，通过产生较多植酸、木质素等来减少自身所受的伤害。当合成较多次生物质后，它们会反馈抑制PAL活力，从而减少营养物质的消耗，并防止次生物质过度积累产生毒害。因此，能否抑制PAL的活力在雷竹笋的保鲜过程中至关重要。

图 1 鲜切雷竹笋贮藏过程中PAL活力的变化

Fig.1 Change in PAL activity in fresh-cut bamboo shoots during storage at 4 ℃

从图1可以看出，鲜切雷竹笋在4 ℃冷藏过程中，不同处理的雷竹笋PAL活力变化趋势相同，都是呈先上升后下降的趋势。冷藏前期，PAL活力上升较快，CWa处理的PAL活力在第11天达到峰值后急剧下降，CWb、CWc、CONTROLa、CONTROLb处理的PAL活力分别在第9天达到峰值后下降。在冷藏过程中，CWF涂膜处理的雷竹笋PAL活力活力低于清水对照组，清水对照组低于乙酸对照组，说明乙酸对雷竹笋PAL活力有促进作用，可能原因是乙酸对雷竹笋表面起到微弱的破坏作用。涂膜处理不仅抵消了这种作用，而且抑制了PAL活力，说明CWF对PAL活力的抑制作用较强烈。不同涂膜处理的PAL活力从涂膜1 次到涂膜3 次逐渐降低，说明随着涂膜次数的增加，CWF对PAL的活力抑制作用有所增强。

2.2 涂膜处理对POD活力的影响

POD是促进木质素合成的关键酶之一，木质素的含量增加，提高了组织木质化程度，从而促进组织的衰老。POD活性可以反映组织木质化速率[17]。

从图2可以看出，不同处理的雷竹笋POD活力在冷藏过程中呈先升高后下降的趋势。在冷藏前期POD活力增加，可能是因为果蔬切割后，膜系统的完整性遭到破坏，细胞壁降解，使与膜和细胞壁结合的结合态POD释放成为游离态POD，导致游离态POD活力上升[18]。另外，由于切割后组织所处的环境发生变化，氧气和过氧化氢增加，使酶所处的环境氧化压力增加，也可能会提高酶的活力[19-20]。POD活力下降的原因可能是在第9～15天时，酚类物质被氧化成醌，造成底物含量下降[21]。CWF涂膜处理（CWa、CWb、CWc）的POD活力在第11天到达峰值，分别为141.0、121.5、101.4 U/g，CONTROLa、CONTROLb的POD活力则分别于第7天（119.3 U/g）和第9天（118.5 U/g）达到峰值，随之下降。结果显示，与清水对照比较，乙酸处理对雷竹笋的POD活力的高峰出现时间有一定的延迟作用；CWF涂膜比乙酸处理POD活力高峰出现的时间更迟，涂膜次数越多，POD活力越低。说明CWF能够有效抑制POD的活力，且涂膜次数越多，CWF对POD活力的抑制作用越大。

图 2 鲜切雷竹笋贮藏过程中POD活力的变化

Fig.2 Change in POD activity in fresh-cut bamboo shoots during storage at 4 ℃

2.3 涂膜处理对MDA含量的影响

植物的膜脂过氧化作用是指通过脂氧合酶降解细胞膜，从而破坏其完整性及改变膜透性促使组织衰老[22]。脂质过氧化产物MDA含量可直接反映植物体膜脂过氧化的程度。MDA含量越高，植物细胞膜损伤越严重[23]。Ková?ik等[22]研究表明：在常温贮藏条件下，MDA含量呈前期上升、后期下降的趋势。

图 3 鲜切雷竹笋贮藏过程中MDA含量的变化

Fig.3 Change in MDA content in fresh-cut bamboo shoots during storage at 4 ℃

不同涂膜处理的雷竹笋的MDA含量总体上呈先上升后下降的趋势，CONTROLa、CONTROLb的MDA含量一直都处于较高水平，CWF涂膜处理的MDA含量则相对较低，且随着涂膜次数的增加，MDA含量逐渐较低。CWF涂膜处理的CWa、CWb、CWc在处理后的第7天MDA含量最高，分别为4.06、2.13、2.53 μmol/g；CONTROLa、CONTROLb则是在处理后的第11天最高，分别为4.38 μmol/g和3.79 μmol/g。说明乙酸对MDA含量有一定的抑制作用，CWF能在此基础上有效抑制MDA含量的增加，减缓细胞膜结构的损伤，有利于雷竹笋的贮藏保鲜。

2.4 涂膜处理对多酚含量的影响

酚类物质既是果蔬贮藏期间组织褐变的物质基础，同时又是合成木质素的前体物质[24-25]。总酚含量与竹笋品质有关，它们在竹笋的生长和成熟过程中形成和积累，它们的含量在一定程度上也体现了竹笋的老化进程[26]。

图 4 鲜切雷竹笋贮藏过程中多酚含量的变化

Fig.4 Change in polyphenol content in fresh-cut bamboo shoots during storage at 4 ℃

从图4可以看出，不同涂膜处理的雷竹笋多酚含量总体上呈先下降后上升，最终下降的趋势。原因可能是由于冷藏前期，细胞完整性好，褐变作用程度轻，多酚积累较少；冷藏中期，膜脂过氧化作用加强，褐变作用程度重，多酚积累增加；冷藏后期，雷竹笋细胞破坏较重，导致酚类物质被氧化，使得多酚含量减少。

CWa、CWb、CWc、CONTROLa、CONTROLb处理后最高的多酚含量分别为23.18、23.29、24.02、22.13、25.53 mg/g。以上结果说明，乙酸对多酚含量有促进作用，经过涂膜处理后，多酚含量有所降低，褐变程度变轻，且时间延后，因此CWF涂膜可以延缓鲜切雷竹笋褐变反应的进程。但不同处理的多酚含量差异不明显。

2.5 涂膜处理对木质素含量的影响

植物组织的木质化过程多是被诱导产生的，如病原菌侵染、机械损伤等，其木质素合成特点是在被侵染部位迅速大量合成，对植物组织有着积极的防卫反应[27]。雷竹笋贮藏过程中木质素含量呈持续增加趋势，前期增加较为缓慢，后期增幅变大。

表 1 鲜切雷竹笋贮藏过程中木质素含量的变化

Table 1 Change in lignin content in fresh-cut bamboo shoots during storage at 4 ℃

%

由表1可知，在冷藏过程中，鲜切雷竹笋木质素和粗纤维含量呈一直上升趋势，贮藏前期增加较慢，贮藏15 d后木质素含量大幅度增加。CWa由2.3%上升到17.2%，增加了7.5 倍；CWb由2.0%上升到16.8%，增加了8.4 倍；CWc由2.0%上升到15.4%，增加了7.7 倍；CONTROLa 由2.8%上升到23.8%，增加了8.5 倍；CONTROLb由2.6%上升到21.4%，增加了8.2 倍。从总体上看，CWF涂膜的雷竹笋木质素含量低于乙酸对照，乙酸对照略低于清水对照，且随着涂膜次数的增加木质素含量同比有所下降。说明涂膜处理有利于保持笋体的完整性，在一定程度上延缓了雷竹笋的代谢循环，延缓了雷竹笋的木质化进程，且涂膜次数越多，雷竹笋的木质化速率越慢。

2.6 涂膜处理对菌落总数的影响

表 2 鲜切雷竹笋贮藏过程中菌落总数的变化

Table 2 Change in lignin content in fresh-cut bamboo shoots during storage at 4 ℃

CFU/g

病原菌侵染和伤害导致植物细胞壁木质化、木栓化、发生酚类物质和钙离子沉积等多种保卫反应[27]。加剧了鲜切雷竹笋木质化进程，同时，病原物侵染使得与酚类代谢相关酶的活性增强，以PAL和POD活性影响最大。

表2显示，鲜切雷竹笋在冷藏期间，微生物快速增长，尤其是在培养后期（第11天后），微生物数量迅速增长，是前期增长速度的数倍。CWF涂膜处理的雷竹笋菌落总数远低于清水处理和乙酸处理，且乙酸处理的菌落总数略低于清水处理，说明菌落总数的降低乙酸仅仅有部分作用。随着涂膜次数的增加，雷竹笋的菌落总数也相应的减少。以上结果表明涂膜可以显著抑制雷竹笋冷藏期间菌落总数的增加，随着涂膜次数的增加，抑制效果愈加明显。原因可能是涂膜液在雷竹笋表面形成了保护膜，防止了致病菌的侵染，同时壳聚糖和乳清蛋白均有一定的抑菌性，抑制了细菌的生长。

3 结 论

3.1 经乙酸处理后的雷竹笋比清水处理表面微生物最高时数量约下降了24.17%，木质素含量下降了10.08%，PAL活力和多酚含量分别上升了13.14%、15.36%；POD活力和MDA含量分别下降了0.67%、8.01%；说明乙酸对竹笋表面微生物数量和木质化进程有一定的抑制作用，但影响不显著。

3.2 经CWF涂膜3 次处理后的雷竹笋比乙酸处理表面微生物最高时数量约下降了94.83%，木质素含量下降了28.04%，PAL和POD活力分别下降了42.58%、14.43%，MDA含量和多酚含量分别下降了33.24%、5.91%。说明CWF涂膜3 次处理在除去乙酸影响的基础上对雷竹笋的保鲜效果较明显，具体表现在表面菌落总数迅速减少，PAL、POD活力及MDA和多酚含量显著降低，木质化程度急剧下降，有效延长了鲜切雷竹笋的货架期。

3.3 经CWF涂膜1、2、3 次处理后的雷竹笋木质素最高含量分别为17.2%、16.8%、15.4%；菌落总数最大分别为4.8×107、7.2×106、4.7×106 CFU/g；PAL和POD活力峰值分别为1.58、1.03、0.89 U/g和141.0、121.5、101.4 U/g；
MDA和多酚最高含量分别为4.06、2.13、2.53 μmol/g和23.18、23.29、24.02 mg/g。说明随着涂膜次数的增加，鲜切雷竹笋的品质也越好。但涂膜3 次比涂膜2 次处理的各指标数值已接近，考虑到操作简易程度及经济效益等，选择涂膜2 次作为生产的参考涂膜次数。

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