昆仑雪菊结合型黄酮类化合物的分离与鉴定

陈 伟，杨英士，杨海燕*

（1.新疆农业大学食品与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

摘 要：昆仑雪菊结合型黄酮类化合物因与细胞壁以共价键结合，难以直接用溶剂萃取出来。本研究采用碱降解法使结合型化合物释放出来并优化降解条件，在此基础上，利用不同溶剂对降解产物进行提取筛选出最佳的溶剂得到粗提物，利用常压硅胶柱层析和SepdexLH-20凝胶柱层析对粗提物中的黄酮类化合物进行分离纯化得到单体化合物，采用Fe3+还原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）法及2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）法对单体化合物进行抗氧化活性评价。结果表明：最佳的碱降解时间2h、温度50℃、NaOH浓度2mol/L，最佳提取溶剂为正丁醇；从粗提物中分离得到2个单体化合物，采用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectra，ESIMS）鉴定其化学结构分别为金鸡菊查尔酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖（化合物1）、3’,4’,7,8-四羟基二氢黄酮（化合物2）；活性测定结果表明两个化合物的总抗氧化能力均强于阳性对照VE，化合物1与化合物2对DPPH自由基的半数抑制率IC50分别为（17.29±0.17）μmol/L和（70.09±0.09）μmol/L、对ABTS＋•半数抑
制率IC50分别为（22.86±0.21）μmol/L和（33.4±0.18）μmol/L，远低于阳性对照VE的IC50值（分别为（78.08±1.63）μmol/L和（38.54±0.42）μmol/L），说明两个化合物均有很强的抗氧化活性。

关键词：昆仑雪菊；结合型黄酮类化合物；分离鉴定；抗氧化活性

Isolation and Identification of Bound Flavonoids from Coreopsis tinctoria Nutt

CHEN Wei, YANG Ying-shi, YANG Hai-yan*

(1. College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, Ürümqi 830052, China)

Abstract: It is difficult to extract bound flavonoids directly from Coreopsis tinctoria Nutt owing to their binding to the cell wall material by covalent bond. The bound compounds were released using an alkaline digestion method in the current study and the process parameters were optimized. A crude extract was obtained from the digestion products using the selected optimum solvent and pure flavonoid compounds were isolated from the crude extract by open silica gel column chromatography and Sephedex LH-20 gel column chromatography. The antioxidant activities of the purified compounds were evaluated by DPPH, FRAP and ABTS assays. The results revealed that the optimum alkaline degradation conditions were 50 ℃, 2 h and 2 mol/L for temperature, time and NaOH concentration, respectively, and n-butanol was selected as the optimum extraction solvent for flavonoids. Two pure compounds were isolated from the crude extract and their chemical structures were elucidated as okanin-4’-O-β-D-glucopyranoside and 3’,4’,7,8-tetrahydroxyflavanone by nuclear magnetic resonance (NMR) and electro-spray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Antioxidant experiments showed that the total antioxidant capacity of these two compounds was higher than that of the positive control vitamin E. The IC50 values of compounds 1 and 2 in the DPPH assay were (17.29 ± 0.17) and (70.09 ± 0.09) μmol/L, respectively, while those in the ABTS assay were (22.86 ± 0.21) and (33.4 ± 0.18) μmol/L, respectively, which were far lower than that of vitamin E (the IC50 values were (78.08 ± 1.63) and (38.54 ± 0.42) μmol/L for DPPH and ABTS+ radicals, respectively), suggesting that both flavonoids possess powerful antioxidant activities.

Key words: Coreopsis tinctoria Nutt; bound flavonoid compounds; structure identification; antioxidant activities

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）11-0072-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411015

昆仑雪菊是目前新疆惟一与雪莲齐名，具有独特功效的稀有高寒植物，主要分布在昆仑山脉北麓海拔3 000 m雪线以上的部分地区，仅在每年八月绽放一次，花期短暂，且生长面积小，产量极低，因而弥足珍贵[1-3]。

目前对昆仑雪菊的研究大都集中在对其粗提物活性的研究方面，如降血压、降血脂、降血糖等[4]。梁淑红[5]、徐磊[6]等发现雪菊的乙酸乙酯、乙醇、正丁醇提取物对氯化钾预收缩血管有不同程度的舒张作用，且各极性部位均表现出显著的降胆固醇作用[7]，毛新民等[8]发现雪菊的乙醇、氯仿、正丁醇提取物对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用。对雪菊的化学成分研究国内外鲜有报道，现有的报道大多仅限于对游离黄酮的研究，而忽略了结合型黄酮。研究表明[10-11]，结合型黄酮主要通过酯键、醚键、缩醛键与细胞壁构成材料——膳食纤维结合、能耐受肠道消化酶不被降解并最终穿过胃肠道到达结肠，结肠含有的大量细菌菌群可以发酵降解这些物质，降解产物能够中和氧化剂、维持肠道菌落的生长，从而为维持肠胃健康起到重要作用。因此由于没有考虑到结合型黄酮而低估了总黄酮的含量[9]。因此，结合型黄酮的研究对全面解释昆仑雪菊的功效具有重要意义。

本实验采用碱降解法使雪菊中的结合型黄酮类化合物释放出来，筛选最佳提取溶剂得到粗提物，利用硅胶柱层析和sephedex LH-20分离纯化降解产物中的黄酮类化合物，通过电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术鉴定结合型黄酮类化合物的结构，采用FRAP、DPPH、ABTS法对单体化合物的抗氧化活性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

昆仑雪菊购于乌鲁木齐北园春农贸市场。

Sephadex LH-20 瑞典Pharmacia公司；硅胶H（200～400目） 青岛海洋化工厂；槲皮素、VE、DPPH、ABTS 美国Sigma公司；环己烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、正丁醇重蒸后使用，均为工业用化学纯产品；氯化铝、乙酸钾、过硫酸钾、醋酸钠、冰醋酸、氯化高铁、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、无水乙醇等均为工业用化学纯产品。

1.2 仪器与设备

FW200高速万能粉碎机 天津市华鑫仪器厂；722s 型分光光度计、酸度计 上海精密科学仪器有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；恒温水浴锅 国华电器有限公司；Allegra64R台式冷冻离心机、CJJ78-1型磁力加热搅拌器 金坛市大地自动化仪器厂；N-1100V-WD立式旋转蒸发仪 日本东京理化有限公司；AVANCE3型（400MHz）核磁共振仪 德国Bruker公司；Mariner API-TOF 型质谱仪 美国应用生物系统公司。

1.3 总黄酮含量测定

采用AlCl3比色法测定总黄酮含量[12]。槲皮素标准曲线的制作：精确称取0.5 g槲皮素溶于25 mL 80%的乙醇中，得到质量浓度为200 μg/mL的贮备溶液，取贮备溶液依次稀释成20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0、140.0、160.0 μg/mL的标准溶液。吸取0.5 mL标准或样品溶液，依次加入1.5 mL 95%的乙醇溶液、0.1 mL 10%的AlCl3溶液、0.1 mL 1 mol/L的乙酸钾溶液以及2.8 mL去离子水，混合均匀，于室温下静置30 min后，在415 nm波长下测定吸光度，每个样品平行测定3 次。空白以蒸馏水代替槲皮素溶液。得到槲皮素的标准曲线方程y=0.0037x－0.007 5（R2=0.994 6），式中：x为槲皮素溶液质量浓度/（μg/mL），y为样品的吸光度。

1.4 游离型黄酮类化合物提取溶剂的选择

将昆仑雪菊于粉碎机中粉碎后，分别称取0.5 g的样品7 份，各加入50 mL环己烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、去离子水及正丁醇，于磁力搅拌器上搅拌30 min，用布氏漏斗抽滤，取上清液于旋转蒸发器45 ℃真空浓缩至干，加入20 mL 80%乙醇溶液溶解，测定黄酮含量。其中黄酮含量最高组的溶剂作为提取游离黄酮的最佳溶剂。

1.5 结合型黄酮类化合物提取条件优化

结合黄酮的提取采用碱降解法。结合型黄酮类化合物的提取主要取决于如何最大限度地将结合在细胞壁上的化合物释放出来，可通过优化碱降解温度、时间、碱液浓度、以及溶剂的选择来确定最佳的提取条件。

1.5.1 提取溶剂的选择

取0.5 g样品7 份，用1.3节所确定最佳溶剂去除游离黄酮后保留滤渣，加入2 mol/L的NaOH溶液20 mL，室温下碱降解1 h。加入浓盐酸调溶液pH值至中性，分别加入环己烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水、正丁醇50 mL，磁力搅拌30 min，布氏漏斗抽离，弃去残渣，上清液于旋转蒸发器45 ℃真空浓缩至干，加入40 mL 80%乙醇溶解，测定黄酮含量。

1.5.2 碱降解温度的选择

以1.5.1节所筛选的溶剂为提取溶剂，去除样品中的游离黄酮后，加入2 mol/L的NaOH溶液20 mL，分别在30、40、50、60、70、80 ℃水浴降解1 h，中和后提取、浓缩至干，测定黄酮含量。

1.5.3 碱降解浓度的选择

采用1.5.1节和1.5.2节所筛选的提取溶剂和温度参数，去除样品中的游离黄酮后，分别加入浓度为1、2、3、4、5、6 mol/L的NaOH溶液20 mL降解1 h，中和后提取、浓缩至干，测定黄酮含量。

1.5.4 碱降解时间的选择

采用1.5.1、1.5.2和1.5.3节所筛选的提取溶剂、温度和碱液浓度参数，去除样品中的游离黄酮后，分别降解1、2、3、4、5、6h，中和后提取、浓缩至干，测定黄酮含量。

1.6 结合型黄酮类化合物的提取纯化

称取100 g粉碎的雪菊，采用优化条件进行碱降解，并提取结合黄酮，减压真空浓缩至干后得1.8 g粗提物。粗提物干法拌样后上装有50 g硅胶（300 目）的常压柱，用石油醚-丙酮-甲醇梯度洗脱分离，洗脱的组分减压浓缩经TLC检测合并后得到2 个组分（Fraction，简写Fr）：Fr.1、Fr.2。经测定，仅有Fr.1组分含有黄酮类化合物，用于进一步的纯化。组分Fr.1（350 mg）进一步上常压硅胶柱，氯仿-甲醇（200∶1，V/V）洗脱，得亚组分Fr.2-1（210 mg）和Fr.2.2，Fr.2.2（90 mg）含有黄酮类化合物，继续分离，组分Fr.2.2进一步上常压硅胶柱，氯仿-甲醇（100∶1，V/V）洗脱，得化合物1（20 mg）和另一亚组分Fr.2.2.1（15 mg）；组分Fr.2.2.1上Sephadex LH-20纯化，氯仿-甲醇（1∶1，V/V）洗脱得到化合物2（11 mg）；分离过程中其余未检测到黄酮类的组分，不做进一步分离。

1.7 单体化合物的活性测定

采用FRAP、DPPH、ABTS 3种方法对纯品单体化合物进行活性评价。

1.7.1 FRAP法[13]。

FRAP工作液制备：取5.1 g醋酸钠，加入20 mL乙酸并用去离子水定容到250 mL，得到300 mmol/L的醋酸钠缓冲溶液备用；取0.270 5 g FeCl3•6H2O，用去离子水定容到50 mL，得到20 mmol/L氯化铁溶液备用；称取0.031 2 g TPTZ用10 mL 40 mmol/L的盐酸溶液溶解备用（40 mmol/L的盐酸溶液：0.1 mL浓盐酸用30 mL去离子水溶解）。将上述3 种溶液以体积比10∶1∶1混合均匀得到FRAP工作液。

抗氧化活性测定：取0.2 mL无水乙醇配制的样品，分别加入6 mL FRAP工作液0.6 mL去离子水，摇匀后于37 ℃水浴20 min，在593 nm波长处测吸光度，每个样品平行3 次。空白样用0.2 mL无水乙醇代替，VE溶液（100～500 μmol/L）做阳性对照。

无水乙醇配制FeSO4溶液（200～1 000 μmol/L），
上述方法测吸光度，得到标准曲线方程y= 0.000 6x+0.070 5，R2 = 0.994 6。式中：x为FeSO4溶液浓度/（μmol/L），y为样品的吸光度。FRAP值的计算：以待测样品吸光度换算成FeSO4溶液浓度，1 000 μmol/L FeSO4溶液为一个FRAP值。

1.7.2 DPPH法[14-15]

DPPH溶液的配制：准确称取0.019 7 g DPPH，无水乙醇定容到250 mL，得到浓度为2×10-4 mol/L的DPPH溶液。

测定方法：2 mL样品加2 mL DPPH溶液，摇匀后避光静置30 min，于517 nm条件下测得吸光度AI，空白用2 mL无水乙醇代替；2 mL样品加2 mL无水乙醇，摇匀后避光静置30 min，于517 nm条件下测得吸光度AJ；2 mL无水乙醇加2 mL DPPH溶液，摇匀后避光静置30 min，于517 nm条件下测得吸光度AC；VE溶液（20～100 μmol/L）做阳性对照，每个样品平行3 次，清除率按照式（1）计算。

清除率/%=（1－ ）×100

AI－AJ

AC

（1）

1.7.3 ABTS法[16]。

ABTS工作液的配制：称取0.191 8 g ABTS，去离子水定容到50 mL容量瓶；取0.066 2 g过硫酸钾，去离子水定容到100 mL容量瓶；取少量将上述两种溶液按体积比1∶1混合后避光放置12～16 h；取混合液，加一定量的无水乙醇在734 nm处测量吸光度，用无水乙醇调吸光度至0.70±0.02即可使用（混合液现配现用）。

测定方法：取0.2 mL无水乙醇配制的样品加入0.6 mL ABTS工作液，室温静置5 min后，于734 nm测量吸光度，空白用无水乙醇代替。VE溶液（20～100 μmol/L）做阳性对照，每个样品平行3次。清除率按照式（2）计算。

清除率/%=（1－AI/A0）×100 （2）

式中：A0为空白样的吸光度；AI各浓度下样品的吸光度。

1.8 数据处理与统计分析

采用Excel 2007和SPSS 16.0统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 游离型黄酮类化合物的提取溶剂的选择结果

方差分析采用新复极差法进行；字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图 1 不同提取溶剂对游离型黄酮提取效果的影响

Fig.1 Effect of different solvents on the extraction efficiency free flavonoids

由图1可知，甲醇提取所得游离黄酮含量远远高于其他溶剂，丙酮、正丁醇次之，因此采用甲醇作为游离黄酮的提取溶剂。

2.2 结合型黄酮类化合物的提取条件优化结果

2.2.1 提取溶剂的选择结果

图 2 不同提取溶剂对结合型黄酮提取效果的影响

Fig.2 Effect of different solvents on the extraction efficiency of bound flavonoids

由图2可知，不同提取溶剂提取结合型黄酮类化合物的量差别较大，其中，正丁醇提取的黄酮量要高于其他溶剂的提取量。因此，最佳的溶剂为正丁醇。

2.2.2 碱降解温度的选择结果

图 3 不同碱降解温度对结合型黄酮提取效果的影响

Fig.3 Effect of degradation temperature on the extraction efficiency of bound flavonoids

由图3可知，30～50 ℃，结合型黄酮类化合物提取量随温度上升也呈上升趋势；超过50 ℃后，随着温度的升高，黄酮类化合物的含量反而会降低，可能是因为温度过高导致部分黄酮分解。因此，最佳的碱降解温度为50 ℃。

2.2.3 碱降解浓度的选择结果

图 4 不同碱降解浓度对结合型黄酮提取效果的影响

Fig.4 Effect of alkaline concentration on the extraction efficiency of bound flavonoids

由图4可知，2 mol/L时降解效果最好，继续升高碱液浓度反而会降低黄酮类化合物的含量，这可能是因为碱浓度过高会使部分黄酮降解。

2.2.4 碱降解时间的选择结果

图 5 不同碱降解时间对结合型黄酮提取效果的影响

Fig.5 Effect of degradation time on the extraction efficiency of bound flavonoids

由图5可知，最佳的碱降解时间为2h，长时间的碱降解可能会导致部分黄酮分解。

2.3 化合物的结构解析

图 6 化合物1的结构及关键的1H-1H COSY 、HMBC耦合

Fig.6 Chemical structure and selected 1H-1H COSY and HMBC correlations for compound 1

化合物1：橘黄色无定型粉末，ESIMS在451.1和449.0处分别给出准分子离子峰[M+H]+和[M-H]－，结合1H NMR和13C NMR数据分析确定其分子式为C21H22O11。1H NMR在δ 3.15～4.90处的一组质子以及13C NMR在δ 60.7～101.0处的6个碳原子提示分子中存在一个糖单元；进一步分析1H NMR显示分子中存在一个AB自旋系统：δ 6.76（d，J = 9.2 Hz，1H，H-5’）和δ 7.73（d，J = 9.2 Hz，1H，H-6’）；一个ABX自旋系统：δ 7.26（d，J = 2.05 Hz，1H，H-2）、δ 6.80（d，J = 8.15 Hz，1H，H-5）和δ 7.20（dd，J = 2. 05 Hz，8.25 Hz，1H，H-6），提示该化合物中含有两个苯环；1H NMR在δ 13.12（s，1H，2’-OH）处出现一个典型的宽单峰提示为黄酮2’位羟基质子；13C NMR在低场区δ 192.6的碳信号，提示分子中存在一个酮基，推测分子中含有一个金鸡菊查尔酮糖配基。1H-1H COSY 谱确定了糖单元的C的连接顺序C1”- C2”- C3＂- C4”- C5”- C6”；HMBC显示葡萄糖端基质子δ 4.89（d，J = 7.30 Hz，1H，H-1”）与C-4’（δ C 150.4）出现关键的耦合信号，提示吡喃葡萄糖通过糖苷键连接在金鸡菊查尔酮的C-4’位上，而且端基质子耦合常数J=7.30，提示糖单元是一个β型吡喃葡萄糖。化合物1的关键1H-1H COSY、HMBC耦合见图6；化合物1的1H NMR和13C NMR谱数据归纳见表1；以上数据与金鸡菊查尔酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖一致[17]，因此经鉴定化合物1为金鸡菊查尔酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖。

表 1 化合物1的1H NMR和13C NMR谱数据

Table1 1H NMR and 13C NMR data of compound 1

化合物2：淡黄色无定型粉末，ESIMS-给出准分子离子峰[M-H]－：287.1，结合1H NMR（DMSO）和13C NMR数据分析确定其分子式为C15H12O6。分析该化合物氢谱与碳谱，发现该化合物与化合物1非常相似，差别在于缺少一个糖单元，提示该化合物为一个黄酮化合物。1H NMR提示分子中存在一个AB自旋系统：δ 6.61（d，J = 8.7Hz，1H，H-5）和δ 7.30（d，J = 8.7 Hz，1H，H-6），结合13C NMR数据提示分子中存在一个苯环的1、2取代结构；进一步分析1H NMR提示分子中存在一个ABX自旋系统：δ 7.06（d，J = 1.8 Hz，1H，H-2’）、 6.88（d，J = 8.3 Hz，1H，H-5’）和 6.91（dd，J = 1.8 Hz，8.3 Hz，1H，H-6’），结合13C NMR数据提示分子中还存在一个苯环的1、3、4取代结构，13C NMR在低场区δ 192.6出现一个典型的酮基碳信号，提示该化合物为4取代的黄酮类化合物；具体13C NMR数据分析如下：δ 131.1 （C-1’）、114.0 （C-2’）、145.0 （C-3’）、145.3（C-4’）、115.0（C-5′）、118.4 （C-6’）为B环上的6个碳，δ 117.8 （C-5）、109.6 （C-6）、151.6（C-7）、132.6 （C-8）、150.7（C-9）、114.8（C-10）为A环上的6个碳，δ 44.1（C-3）、80.3（C-2）分别为C环上的伯碳和叔碳，以上数据与文献报道一致[18]，该物质被鉴定为3’,4’,7,8-四羟基二氢黄酮。

图 7 化合物2的结构

Fig.7 Chemical structure of compound 2

2.4 化合物的活性测定

2.4.1 FRAP法对纯品单体化合物进行活性评价结果

图 8 化合物1与化合物2的总抗氧化活性（FRAP）

Fig.8 Total antioxidant activities (FRAP) of compounds 1 and 2

由图8可知，在测试浓度范围内，化合物1与化合物2
的FRAP值均大于阳性对照VE，且具有明显的计量效应关系。随着浓度的增加，当化合物1、2和VE的FRAP值呈线增加，当浓度为500 μmol/L时，化合物1的FRAP值达到2.50，远远高于该浓度下化合物2和VE的FRAP值（分别为1.94和1.62），以上结果表明，相比化合物1和2具有很强的总抗氧化活性。

2.4.2 DPPH法对纯品单体化合物进行活性评价的结果

图 9 化合物1与化合物2的DPPH自由基清除率

Fig.9 DPPH free radical scavenging effects of compounds 1 and 2

由图9可知，在测试浓度范围内，化合物1和化合物2
的DPPH自由基清除率均高于阳性对照VE，化合物1的DPPH自由基清除率在20 μmol/L时便达到了54.55%，远高于此浓度下化合物1和阳性对照VE的清除率（分别为18.77%、12.02%），60 μmol/L时达到最大值（78.52%），其后增加缓慢。化合物2的DPPH自由基清除率随浓度增加呈现明显的计量效应关系，当浓度为100 μmol/L时DPPH自由基清除率达到79.96%，高于此浓度下阳性对照VE的清除率（65.66%）。其中化合物1和化合物2对DPPH自由基的半数抑制率IC50分别为（17.29±0.17）μmol/L和（70.09±0.09）μmol/L，
均低于阳性对照VE的DPPH自由基的半数抑制率IC50值（（78.08±1.63）μmol/L）。综上所述，化合物1和2具有很强的DPPH自由基清除活性。

2.4.3 ABTS法对纯品单体化合物进行活性评价结果

图 10 化合物1和化合物2的ABTS＋•清除率

Fig.10 ABTS free radical scavenging effects of compounds 1 and 2

由图10可知，在测试浓度范围内，化合物1的
ABTS＋•清除率要高于化合物2和阳性对照VE，在60 μmol/L以内时，化合物1的ABTS＋•清除率随着浓度的增加呈现明显的计量效应关系，当浓度达到60 μmol/L
时清除率达到92.28%，远高于此浓度下化合物1和VE的清除率（分别为71.19%、60.27%），其后增加缓慢；化合物2的ABTS＋•清除率在80 μmol/L以内时随着浓度的增加呈现明显的计量效应关系，当浓度为
80 μmol/L时，ABTS＋•清除率为89.81%，高于此浓度下阳性对照VE的清除率（78.49%），当浓度为100 μmol/L时，化合物1、2以及阳性对照VE的清除率都超过99%。其中，化合物1和2对ABTS＋•半数抑制率IC50分别为（22.86±0.21）μmol/L和（33.4±0.18）μmol/L，
均低于阳性对照VE的半数抑制率IC50值
（38.54±0.42）μmol/L。综上所述，化合物1和2具有很强的ABTS＋•清除率活性。

3 讨 论

黄酮类化合物是植物的次级代谢产物，结构上泛指两个具有酚羟基的苯环（A与B环）通过中间的3个碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮，因苯环上一般连有多个羟基而具有多种生物活性[12]，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌等作用[3-5]。

结合型黄酮类化合物因其特殊的代谢途径而受到越来越广泛的关注，这部分物质主要通过醚键、酯键、缩醛键与细胞壁构成材料－膳食纤维结合而难以直接被肠道摄入，在肠道菌落的作用下局部发挥功效[11-12]。本实验采用碱降解法消化结合型黄酮类化合物将其从细胞壁上释放下来，得到最佳的提取条件为：碱降解时间为2 h，温度为50 ℃，NaOH浓度为2 mol/L，最佳提取溶剂为正丁醇；从粗提物中分离出两个纯的化合物，并鉴定其结构分别为金鸡菊查尔酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖、3’,4’,7,8-四羟基二氢黄酮，其中3’,4’,7,8-四羟基二氢黄酮为首次从该种植物中分离得到。

大量研究表明[4,19-20]，黄酮类化合物是昆仑雪菊中的主要活性成分，其抗氧化作用是通过多种途径来实现的，主要包括清除自由基、抑制氧化酶的活性、络合金属离子、提高抗氧化酶的活性、与其他抗氧化剂（如VC、VE）有协同增效作用、维持体内抗氧化剂浓度等，在捕捉游离基的过程中贡献苯环羟基上的氢原子与自由基结合，中断自由基链式反应而起抗氧化作用，并形成稳定的苯氧共振自由基。本研究通过FRAP法、DPPH自由基法和ABTS法评价了化合物的抗氧化活性，其结果表明化合物1与化合物2均有很好的抗氧化活性，总抗氧化活性均高于阳性对照VE对照，其中化合物1与化合物2对DPPH自由基的半数抑制率IC50分别为（17.29±0.17）μmol/L
和（70.09±0.09）μmol/L，对ABTS＋•半数抑制率IC50分别为（22.86±0.21）μmol/L和（33.4±0.18）μmol/L，
远低于阳性对照VE的IC50值（分别为（78.08±1.63）μmol/L
和（38.54±0.42）μmol/L），说明化合物1和2具有很强的抗氧化活性。

本研究采用碱降解法使结合型化合物释放出来，结合不同溶剂进行提取得到粗提物，筛选出最佳的提取溶剂并优化了降解条件，为分析结合型黄酮提供了有效的分离方法。对粗提物中的黄酮类化合物进行分离纯化得到了两个单体化合物，并对纯化的单体化合物进行了活性评价，为深入分析其活性与构效关系以及进一步开发雪菊的营养健康功能提供了理论基础。

参考文献：

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