多黏类芽孢杆菌JSa-9电转化方法的优化

高 玲，邓 阳，陆兆新，吕凤霞，别小妹*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

摘 要：为建立多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株的高效电击转化体系，本实验研究菌体培养时间、电场强度、电击缓冲液、质粒用量以及电击后复苏培养时间等因素对JSa-9菌株电转化效率的影响。结果表明：Paenibacillus polymyxa JSa-9培养至OD595 nm为0.3时，电转化效率最高，为0.12×103 CFU/μg DNA；用0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油的电击缓冲液洗涤细胞，在电场强度17.5 kV/cm、电阻200Ω，电容25 μF的电击条件下，加入1.0 μg/100 mL质粒DNA，复苏培养时间18 h，电转化效率达到约为0.36×103 CFU/μg DNA；制备P. polymyxa JSa-9原生质体，在电场强度5.0 kV/cm的电击条件下，加入0.8 μg/100 mL质粒DNA，电转化效率较感受态电转提高到约1.0×103 CFU/μg DNA。

关键词：多黏类芽孢杆菌JSa-9；电转化；转化效率

Optimization of Electroporation Conditions for Paenibacillus polymyxa JSa-9

GAO Ling, DENG Yang, LU Zhao-xin, LÜ Feng-xia, BIE Xiao-mei*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract: To establish an electrotransformation method for Paenibacillus polymyxa strain JSa-9, the effects of different factors on the transformation efficiency of strain JSa-9 by electroporation were explored by evaluating cell growth phase, electric field intensity, electroporation buffer, plasmid DNA contentation and recovery time. The results showed that a transformation efficiency of 0.12 × 103 CFU transformants per μg DNA was achieved when P. polymyxa JSa-9 cell culture reached an OD595 nm of 0.3. Under the conditions of 17.5 kV/cm, 200 Ω and 25 μF for electric field strength, electric resistance and capacitance, respectively, the electroporation efficiency was roughly 0.5 × 103 transformants per μg DNA when adding 1.0 μg/100 mL of plasmid DNA to an electroporation buffer containing 0.5 mol/L sorbitol, 0.5 mol/L mannitol, and 10% glycerol and recovering for 17 h. Moreover, the transformation efficiency of P. polymyxa JSa-9 protoplasts was increased to approximately 1.0 × 103 CFU transformants per μg DNA under electric field strength of 5.0 kV/cm upon addition of
0.8 μg/100 mL plasmid DNA.

Key words: Paenibacillus polymyxa JSa-9; electroporation; transformation efficiency

中图分类号：Q785 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）11-0089-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411018

电转化的效率高于化学方法制备感受态细胞的转化率，而且所需设备简单，研究方法较方便、省时，是迄今为止将质粒DNA导入芽孢杆菌的首选方法。目前已被成功的应用于Bacillus subtilis、B. cereus、
B. licheniformis、B. pseudofimus、Paenibacillus polymyxa等的转化中[1-6]，但是由于不同菌株的生理生化特性、细胞壁构造等的差异，转化效率还因菌株而异。

1989年，Vehmaanperä[7]提出一种适用于芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌的电转化方法。该法使用生长培养基为LBSP（LB含0.25 mol/L蔗糖和50 mmol/L钾盐缓冲液，pH 7.2），电击洗液为SHMG（0.25 mol/L蔗糖含1 mmol/L HEPES，1 mmol/L MgCl2和10%甘油），恢复培养基是LBSPG（LBSP含10%甘油）。但该方法转化效率很低，作为表达菌株是可以的，但作为建立分子基因库则远远不够，所以Xue Gangping等[8]于1999年在上述方法的基础上作出改进，通过在电击保护液中添加适量的高渗透剂如山梨醇和甘露醇，大大提高了转化效率。前期的研究表明，多黏类芽孢杆菌JSa-9能产生两大类抗菌脂肽LI-F和Polymyxin以及一种大分子抗菌糖蛋白，对细菌和真菌都具有广谱的抑菌活性；在食品工业中，开发新型天然抗菌物质将具有巨大应用潜能。本实验通过将Paenibacillus polymyxa JSa-9培养到恰当的对数生长期后，在电转化过程中添加高渗透剂作为电击保护液的基础上摸索最适的P. polymyxa JSa-9的转化条件以提高转化效率的处理工艺。增加了电击后的细胞存活率从而高效地使质粒导入多黏类芽孢杆菌中，并能稳定复制和传递，细胞存活率和电转化效率均有很大程度的提高。为日后对菌株JSa-9进行基因工程研究及提高其抗菌物质产量提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

P. polymyxa JSa-9 本实验室分离并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC4314）；质粒pHT43 德国MoBiTec公司，质粒片段大小为8.1 kb，含有氯霉素抗性基因，氯霉素片段大小约为1.2 kb；重组质粒PMD-spooA∷Cm和PMD-abrB∷Cm 本研究室前期构建。

1.2 培养基

LB培养基：蛋白胨1 g、酵母膏0.5 g、NaCl 1 g，蒸馏水100 mL，pH值调至7.0～7.2，121 ℃、20 min灭菌备用；生长培养基：LB＋0.5 mol/L山梨醇；复苏培养基：LB＋0.5 mol/L山梨醇＋0.38 mol/L甘露醇；高渗溶液SMM：蔗糖17.15 g、MgCl2 0.4273g、顺丁烯二酸0.233 6 g，双蒸水100 mL，pH 6.5，于115 ℃、30 min，灭菌备用；溶菌酶液：用SMM配制溶菌酶液，质量浓度分别为10 mg/mL与50 mg/mL，再用孔径为0.22 μm的无菌滤器过滤除菌，分装成单次使用的小份，－20 ℃保存；再生培养基：牛肉膏 5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、葡萄糖 10.0 g、CaCl2 0.03 mol/L、MgCl2 0.02 mol/L、
L-色氨酸0.2g/L、丁二酸钠0.1 mol/L，蒸馏水1 000 mL，pH值调至7.0～7.2，于121℃、20 min灭菌备用。

1.3 试剂

UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒、UNIQ-10柱式细菌基因组提取试剂盒、UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒、UNIQ-10柱式胶回收试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性内切酶、连接酶 日本
TaKaRa公司；氯霉素（4～5μg/mL） 美国Sigma公司。

1.4 仪器与设备

凝胶成像系统、JS-380C全自动数码凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司；核酸水平电泳仪、MicroPulserTM电击转化仪、PowerPacTM HC；DYY-6B稳流稳压电泳仪 美国Bio-Rad公司；高效液相色谱仪、Agilent 1100 Series（VWD检测器） 美国Agilent公司；LNG-T88台式快速离心浓缩干燥器 江苏太仓市华美生化仪器厂；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；WH-3微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；JY98-III超声波细胞粉碎机 宁波新芝科学仪器研究所；PTC-100TM和PTC-200TMPCR仪 MJ Research公司。

1.5 方法

1.5.1 感受态细胞的制备

将P. polymyxa JSa-9单菌落接入30 mL LB培养基中，30℃、180 r/min振荡培养20 h，然后按1∶30的比例转接至30 mL生长培养基中，30℃、180 r/min培养至一定浓度后，冰浴20 min使细菌停止生长，4℃、5 000×g离心20 min收集菌体细胞，用预冷的电击缓冲液洗涤菌体3 次，培养物悬浮于适量的电击缓冲液中使得细胞浓度约为1.0×108 个/mL。

1.5.2 JSa-9菌株的电击转化及转化子的验证

取2 μL质粒DNA（50 ng/μL）与50 μL冰冷的感受态细胞混匀，转入至1 mm冰置电转杯中，冰浴30 min后设定电击参数电击。电击结束后立即加入1 mL复苏培养基，菌液于30 ℃、120 r/min缓慢振荡培养12 h后涂布于氯霉素抗性平板，培养24 h后观察转化子个数。

对含有氯霉素的LB平板上生长的单菌落先进行形态学判断，然后随机挑选形态上与JSa-9野生菌株一致的菌落接种于含氯霉素的LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养至OD600 nm值约为0.6。用质粒提取试剂盒从各转化子培养物中提取出质粒，并将其作为模板，通过氯霉素抗性基因上下游引物聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增氯霉素抗性基因。扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，如在约1 200 bp处出现目的条带，则证明P. polymyxa JSa-9能在抗性平板上生长是由于转入氯霉素抗性基因所致；另外将提取得到的质粒与原质粒pHT43同时进行电泳检测，如二者条带位置相同则进一步证明质粒pHT43已转化入P. polymyxa JSa-9中，并且使其带有氯霉素的筛选抗性。

PCR引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5’-ATGAACTTTAAT
AAAATTGATTTAG-3’，下游引物：5’-TTATAAAAGCCAGTCATTAGGCC-3’。

1.5.3 JSa-9菌株不同生长时期对转化率的影响

选择不同生长阶段的P. polymyxa JSa-9培养物制成感受态细胞，采用含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油的电击缓冲液，电场强度17.5 kV/cm、电阻200 Ω、电容25 μF，进行电击转化。

1.5.4 不同电场强度和不同电阻值对转化率的影响

电场强度过高会造成细胞的大量死亡，而电场强度过低则不能形成细胞穿孔。本实验测定10、12.5、15、17.5、20、22 kV/cm电场强度下JSa-9菌株的电击转化效率。用前述优化后的最适生长时期的菌体做感受态细胞，采用含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油的电击缓冲液，电阻为200 Ω，电容25 μF，进行电击转化。

对芽孢杆菌的电击转化大多采用200 Ω[9]，也有报道采用400 Ω[10]。因此，本实验比较了200 Ω和400 Ω对JSa-9菌株电击转化效率的影响。用前述优化后的最适生长时期的菌体制备感受态细胞，采用含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油的电击缓冲液，电场强度为1750 V/cm、电容25 μF，进行电击转化。

1.5.5 电击缓冲液和不同质粒质量浓度对转化率的影响

前期实验结果证明，采用含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油的电击缓冲液能转化成功，选择前述已优化的其他电击条件，向基本电击缓冲液中添加不同浓度的山梨醇和甘露醇，来研究电击缓冲液对电转化效率的影响[10]。

Rittich等[11]报道了革兰氏阳性菌的电转化效率与质粒DNA质量浓度的关系。因此，在已优化的电击条件下，用不同质量浓度的质粒DNA进行电击转化。

1.5.6 复苏培养时间的优化

使用前述已获得的最优转化条件对复苏培养时间进行优化，选取不同复苏培养时间分别为3、6、9、12、16、18、20 h，进行电击转化。

1.5.7 原生质体电转化研究

取P. polymyxa JSa-9新鲜斜面接种于LB液体培养基中，30 ℃振荡培养22 h，取1.0 mL菌液转入新鲜的30 mL液体培养基中继续培养4～5 h，取8 mL菌液5 000 r/min离心10 min收集菌体，用SMM液洗涤2 次，用5 mL SMM重悬，加入溶菌酶液使酶终质量浓度为0.1 mg/mL，混合均匀，置于温水浴中保温酶解7 min，酶解结束后立即加入4 mL SMM稀释，2 500 r/min离心10 min，用SMM液洗涤2次以清除酶液，将原生质体悬浮于SMM中使得细胞浓度约为1.0×108 个/mL。

取100 µL原生质体与8 µL质粒DNA（100 ng/µL）混匀放置5 min，加入电击杯内，设置电击参数电击。电击完毕，加入600 µL SMM，吸出培养液，30 ℃培养一定时间，涂布于含有氯霉素抗性的再生平板上30 ℃培养3 d，观察转化子数，计算转化效率。

2 结果与分析

2.1 P. polymyxa JSa-9的生长曲线及细胞生长状态对转化效率的影响

选择不同生长阶段的P. polymyxa JSa-9培养物制成感受态细胞，在电场强度17.5 kV/cm、电阻200 Ω、电容25 μF的条件下进行电击。结果表明，不同种龄的菌体制成的感受态转化率差别很大。由图1可知，前2 h内P. polymyxa JSa-9生长缓慢，菌体的转化效率几乎为0；从3 h起，进入生长旺盛的对数期，当OD595nm值为0.3时，菌体转化效率最高，DNA的转化效率约为0.12×103 CFU/μg DNA；随着培养时间的延长，转化效率逐渐下降，当OD595nm值为0.86时，此时菌体处于对数生长末期，转化效率已降至0，没有得到转化子。这可能是由于对数生长初期细胞生命力最旺盛，对电击造成的损伤修复能力强，使得电击后的细胞保持较高的存活率，因此相应的转化效率也高。然而，某些芽孢杆菌培养至对数生长后期或稳定期才最适合电击转化，因为此时期为芽孢形成前期，细胞壁较薄，容易接收外来DNA而发生遗传转化[12-13]。因此，有必要明确不同菌株转化的最佳生长时期。

图 1 不同生长时期的多黏类芽孢杆菌JSa-9菌体细胞对转化效率的影响

Fig.1 Effect of cell growth phase on transformation efficiency of
P. polymyxa strain JSa-9

2.2 电场强度对JSa-9菌株电转化效率的影响

图 2 不同电场强度对多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株电转化效率的影响

Fig.2 Effect of electric field intensity on transformation efficiency of
P. polymyxa strain JSa-9

电场强度是影响电击转化效率的又一重要参数[14-15]。不同电场强度下JSa-9菌株的电击转化效率测定结果如图2所示，在低场强时（如10 kV/cm和12.5 kV/cm），转化效率低于0.1×103 CFU/μg DNA；当场强为17.5kV/cm时，细胞的转化效率达到最高，转化效率为0.19×103 CFU/μg DNA；
但是，若进一步升高电场强度至22 kV/cm时，感受态细胞的转化效率降至0。由于P. polymyxa JSa-9属于革兰氏阳性细菌细胞壁厚，场强低时转化效率低，而过高的场强虽可以增强外源基因进入菌体细胞的机率，但同时也会增加细菌细胞的死亡概率，使得转化效率下降。因此，最佳的转化效率需要同时兼顾这两方面。

2.3 不同电阻值对JSa-9菌株电转化效率的影响

A

B

图 3 电阻值200 Ω（A）和400 Ω（B）对多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株
电转化效率的影响

Fig.3 Effect of electric resistance on transformation efficiency of
P. polymyxa strain JSa-9

测试电阻值在200 Ω和400 Ω条件下JSa-9菌株的电击转化效率，结果见图3，在电阻值为200 Ω和400 Ω的条件下获得的电转化效率差别不大，200 Ω时的转化效率达到0.13×103 CFU/μg
DNA，略高于400 Ω时的0.1×103 CFU/μg DNA。
故后续实验电击过程采用200 Ω电阻值。

2.4 电击缓冲液对JSa-9菌株电转化效率的影响

表 1 不同电击缓冲液对多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株电转化效率的影响

Table 1 Effect of electroporation buffer on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9

选择前述已优化的最佳电击条件，向基本电击缓冲液中添加不同浓度的山梨醇和甘露醇，来研究电击缓冲液对电转化效率的影响[5,8,16-18]。前期用0.625 mol/L蔗糖作为电击缓冲液，转化效率为0.12×103 CFU/μg DNA。表1结果表明，用甘油作为电击缓冲液时，未得到转化子；当加入0.5 mol/L的山梨醇或甘露醇时，转化率略有提高；当山梨醇及甘露醇以等浓度（均为0.5 mol/L）加入时，电转化效率最高，为0.21×103 CFU/μg DNA，高于只加入蔗糖的电击缓冲液条件。因此，确定电击缓冲液的最佳组成为0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油。由于用高渗透溶液作为电击缓冲液来洗涤菌体细胞，可以降低细胞表面的离子强度；还可以平衡菌体内高的膨压，减少了电击时高场强对细胞的损伤，提高了细胞的存活率，从而提高转化效率。

2.5 质粒DNA质量浓度对JSa-9菌株电转化效率的影响

在已优化的电击条件下，用不同浓度的质粒DNA进行电击，以得到最高的电转化效率，结果见图4。在0.5～1.0 μg/100 µL的质粒质量浓度范围内，适当地提高质粒DNA的质量浓度可以提高多黏类芽孢杆菌的转化效率，转化效率最高为0.3×103 CFU/μg DNA；但是，当质粒DNA质量浓度继续升高时，转化效率反而降低。如当质粒质量浓度为2.0 μg/100 µL时，转化效率仅为最高转化效率的30%；若质粒质量浓度进一步升高至3.0 μg/100 µL时，将不能获得转化子。

图 4 不同质粒质量浓度对多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株电转化效率的影响

Fig.4 Effect of plasmid DNA concentration on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9

2.6 阳性克隆子的筛选鉴定

A.质粒DNA pHT43基因和提取DNA基因；B.氯霉素抗性基因。

图 5 质粒pHT43转化P. polymyxa JSa-9转化子的验证

Fig.5 Confirmation of the transformants from P. polymyxa JSa-9

为验证电击转化P. polymyxa JSa-9后得到的转化子，随机选择5株转化子提取质粒进行筛选鉴定。电泳结果显示，所提取的质粒与质粒pHT43带型大小均完全一样（图5A）。再以提取得到的质粒为模板PCR扩增氯霉素抗性基因序列，结果表明这些质粒DNA均能扩增得到1 200 bp的氯霉素抗性基因（图5B）。因此，抗性平板上生长出的转化子均为阳性转化子，质粒pHT43成功转入宿主细胞，使得野生型P. polymyxa JSa-9菌株获得氯霉素抗性。

2.7 复苏培养时间的优化

图 6 复苏培养时间对菌株JSa-9电转化效率的影响

Fig.6 Effect of recovery time on transformation efficiency of
P. polymyxa strain JSa-9

本实验使用前述已获得的最优转化条件对复苏培养时间进行优化，由图6可知，复苏培养时间仅为3～9 h内，均不能获得转化子；当复苏培养时间延长至12 h，抗性平板上出现一定数量的转化子，但筛选鉴定表明，其中只有约60%的转化子为阳性转化子，电转化效率为0.12×103 CFU/μg DNA；随着时间的延长转化效率随之提高，当培养至18 h时获得最高转化效率，约为12 h时的3 倍；而再延长复苏培养时间反而使得转化效率有所降低。

2.8 原生质体电转化的研究

图 7 电场强度（A）和质粒质量浓度（B）对多黏类芽孢杆菌JSa-9
菌株原生质体电转化效率的影响

Fig.7 Effects of electric field intensity (A) and plasmid DNA concentration (B) on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9 protoplasts

推测革兰氏阳性菌的细胞壁厚，密度高，很难被击穿以使大分子通过膜穿孔进入细胞中。因此，企图通过去除细胞壁，制备P. polymyxa JSa-9原生质体进行电转，从而提高转化效率。不同电场强度下JSa-9菌株原生质体的电击转化效率测定结果如图7A所示，原生质体的转化率随着电场强度的升高逐渐降低；在电场强度为5 kV/cm时，原生质体的转化效率达到最高，转化效率为1.25×103 CFU/μg DNA；当电场强度升高到15 kV/cm或更高时，原生质体的的转化效率降至0。

在最适的电场强度5 kV/cm条件下，用不同质量浓度的质粒DNA进行电击，以得到最高的电转化效率，结果见图7B。在0.5～1.2 μg/100 mL的质粒质量浓度范围内，适当地提高质粒DNA的质量浓度可以提高多黏类芽孢杆菌原生质体的转化效率，当质粒DNA的质量浓度为0.8 μg/100 mL时，转化效率最高为1.0×103 CFU/μg DNA；但是，当质粒DNA质量浓度继续升高时，转化效率反而降低。

利用上述原生质体电转条件，能够将我们构建的重组质粒（PMD-spooA∷Cm和PMD-abrB∷Cm）转入P. polymyxa JSa-9中，结果如图8所示，在电场强度为5.0 kV/cm时，
重组质粒的转化效率分别为0.37×103 CFU/μg DNA和0.25×103 CFU/μg DNA，重复实验，转化效率较为稳定。

图 8 不同的重组质粒转化多黏类芽孢杆菌JSa-9原生质体

Fig.8 Effect of recombinant plasmid on transformation efficiency of
P. polymyxa strain JSa-9 protoplasts

M. DNA Marker；A.泳道1、2为重组质粒PMD-spooA∷Cm上的氯霉素基因，泳道3、4为假阳性转化子；B.泳道1～3为重组质粒PMD-abrB∷Cm上氯霉素基因。

图 9 重组质粒转化P. polymyxa JSa-9转化子的验证

Fig.9 Confirmation of the transformants from P. polymyxa JSa-9

为验证电击转化原生质体P. polymyxa JSa-9后得到的转化子，随机选择3～4株PCR扩增重组质粒携带的氯霉素抗性基因序列，结果如图9所示，从4株转化子扩增重组质粒PMD-spooA∷Cm携带的氯霉素抗性基因序列，
2株得到1 200 bp的氯霉素抗性基因，2株为假阳性的转化子；从3 株转化子扩增重组质粒PMD-abrB∷Cm携带的氯霉素抗性基因序列，3 株均能得到1 200 bp的氯霉素抗性基因。

3 讨 论

电转化法是用高压脉冲电流击破细胞膜或在细胞膜表面击出小孔，从而使外源基因通过这些小孔进入细胞[19]。影响微生物细胞电转化效率的因素主要有细胞的生长状况、电击缓冲液组成、电场强度、质粒质量浓度等[8]。

另外，以往文献研究芽孢杆菌电转化条件时，采用的电击后菌液复苏培养时间通常为3～6h，而Murray等[20]在转化1株P. larvae时，通过延长复苏时间有效地提高了转化效率。本研究发现，适当延长电击后复苏培养时间可提高转化效率，但同时也出现一定量的非阳性转化子。可能的原因是由于较长时间的复苏培养使得菌体在氯霉素诱导下逐渐获得一定的抗性，而非质粒pHT43成功转入宿主细胞。优化试验结果显示，电击后复苏培养17 h涂抗性平板可获得最高的转化效率，约为0.5×103 CFU/μg DNA。

革兰氏阳性细菌比阴性菌的电转化效率要低，究其原因仍然没有确切的证明，推测可能是革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌细胞壁厚，密度高，更难被击穿以使大分子通过膜穿孔进入到细胞中。从增加电场强度并且保护细胞存活这两方面来越过此瓶颈从而提高转化效率。2009年，莫静燕等[21]通过酶解法对地衣芽孢杆菌工业生产菌株Bacillus licheniformis 303原生质体的制备及再生条件进行研究，在此条件下，采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）法将游离型质粒pHY-P43-secQ转化宿主菌B.licheniformis 303，转化效率可达10～15 CFU/μg DNA。

但是，在已知的范围还少有针对野生型多黏类芽孢杆菌进行原生质体遗传转化研究的报道。因此，在已建立的P. polymyxa JSa-9高效电击转化体系的研究基础上。本实验仍以P. polymyxa JSa-9为研究对象，结合已有的原生质体制备和再生的条件，针对pHT43目的质粒，建立了P. polymyxa JSa-9原生质体电转化体系，电转效率可达到1.25×103 CFU/µg DNA，是制备感受态细胞直接电转的转化效率的2.5倍，并且能够将构建的重组质粒（PMD-spooA∷Cm和PMD-abrB∷Cm）转入P. polymyxa JSa-9中，转化效率稳定，为今后对菌株JSa-9进行基因工程研究及提高其抗菌物质产量提供支持。

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